时间分辨 在体实验 利用电容式免疫探针测量猪心神经肽动态变化

摘要

测定肽类递质的既定免疫化学方法 体内 依赖微透析或大量体液抽取来获取样本进行离线分析。然而，这些方法存在时空分辨率的局限性。本方案描述了一种电容型免疫探针生物传感器的制备与应用，可克服现有技术的局限性。

摘要

能够在体测量与疾病进展评估相关的生物标志物，是科学界和医学界广泛关注的课题。目前某些生物标志物的检测方法所得结果的分辨率往往需要数天甚至数周才能获得，因其在空间和时间分辨率上均存在局限性（例如，通过酶联免疫吸附试验[ELISA]、高效液相色谱[HPLC]或质谱法分析间质液的液体隔室微透析）；因此，其对及时诊断和治疗的指导作用受到限制。本研究报道了一种利用电容型免疫探针生物传感器（CI探针）在体检测和测量肽类递质的独特技术。文中描述了此类探针的制备流程及其体外表征，并提供了在体条件下交感神经刺激诱发的神经肽Y（NPY）释放的测量结果。NPY的释放与去甲肾上腺素的交感释放相关联，作为参考依据。数据表明，该方法可实现对神经肽类物质在体的快速、局部化测量。未来应用包括术中对疾病进展的实时评估，以及通过微创导管部署此类探针。

引言

在蛋白质化学和临床诊断中，尤其是癌症诊断及心血管疾病进展评估，多种用于检测和定量生物标志物的化学方法被常规使用。目前，高效液相色谱法（HPLC）、酶联免疫吸附测定法（ELISA）和质谱法等方法依赖于从血管腔室^1,2,3通过大量体液抽取或从组织间质腔室通过微透析采集样本。微透析采用一段已知长度的半透膜管，将其置入感兴趣区域，通过在数分钟内向管内灌注收集液⁴以获取待分析样本⁵，从而限制了时间分辨率。因此，所采集的样本仅能提供局部微环境在一段时间内的平均值，且受限于灌注速率以及足够样本体积的收集。此外，这些方法需要对实验数据进行汇总和信号平均处理，因而可能无法反映个体间的差异性。更重要的是，样本采集与后续离线分析之间的时间间隔阻碍了即时的临床干预和治疗措施的实施。

本方案概述了一种电容型免疫探针生物传感器（CI探针）用于特异性生物活性肽的时间分辨电学检测方法。神经肽Y（NPY）由支配血管、心内膜、心肌细胞和心脏内神经节的节后交感神经元释放，是心血管系统中一种重要的神经调节肽类递质^6,7,8,9。本文所述方法旨在检测NPY，并在猪心脏模型中验证了其实验可行性。然而，该方法适用于任何具有特异性抗体的生物活性肽¹⁰。该方法依赖于铂丝探针与功能化尖端处导电液体之间形成的电容结^11,12。在此应用中，通过固定于电极尖端、与导电液体环境相接触的抗目标神经肽（NPY）抗体介导相互作用。该功能化过程通过在铂丝探针尖端电沉积反应性聚多巴胺实现^10,13。

当抗体功能化的探针置于感兴趣区域时 体内，诱发的内源性NPY释放导致其与探针尖端的捕获抗体结合，同时NPY蛋白取代电极表面的导电液。局部电学环境的改变使得高迁移率、高介电常数的液体被静止且带静电荷的分子所取代。这改变了电极-液体界面，从而改变其电容，表现为在阶跃电位指令下电荷电流的变化。负 "重置" 每次测量循环结束后立即施加电位，通过静电相互作用使已结合的NPY从抗体上解离，从而清除抗体结合位点，为后续测量轮次做好准备¹⁰这能够实现对神经肽Y（NPY）进行时间分辨的测量。该独特的CI技术克服了上述基于微透析的免疫化学方法的局限性，可在单次实验中测定动态生物标志物水平，无需对多次实验的数据进行合并或信号平均。⁹，可提供近乎实时的数据。此外，该方法能够针对任何具有合适抗体的生物标志物，在时间分辨和局部定位的尺度上进行适应性调整，这为免疫化学检测带来了重要的技术进步，有助于评估疾病进展并指导治疗干预。

用于数据采集和分析的软件是在IGOR Pro（一个完全交互式软件环境）中自行编写的。模拟-数字转换器（A/D）系统在计算机控制下发出命令电压，并从一个定制的放大器获取数据。该放大器具有某些独特特性，包括为四个采集通道中的每一个配备可切换的反馈电阻器，从而可以选择1 MΩ或10 MΩ的反馈电压钳电路，以适应电极的变异性。还构建了一个带有单个探头和共用接地/参考电路的台式单元，用于将设备集成在一个物理模块中并放置在胸部附近。所有报道的数据均使用1 MΩ的反馈电阻器设置进行采集。

滤波器和增益设置由放大器传输并记录在数据文件中。数据通过一个二阶模拟贝塞尔滤波器以1 kHz进行滤波，并以10 kHz进行数字化。探针与周围导电溶液之间的电势差在探针尖端形成一个亥姆霍兹电容层。配体与探针尖端的抗体结合会导致局部电荷发生变化，从而引起亥姆霍兹电容的改变。电路中电容组分的这一变化导致在阶跃电压协议中将探针达到目标电势所需注入电荷量的幅度发生偏移。因此，特定配体与功能化探针的结合会表现为电极电容测量值的变化，即峰值电容电流的变化。

方案

所有动物实验均经加州大学洛杉矶分校动物研究委员会批准，并遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》（第8版，2011年）中规定的原则进行¹⁰。实验使用约75 kg的成年雄性约克夏猪进行in vivo研究

1. 电容型免疫探针的制备与功能化

1. 取一段25 cm长的全氟烷氧基（PFA）涂层铂丝（见材料表），使用手术刀从一端剥离约5 mm的PFA涂层，注意不要割伤铂丝。
2. 将剥离后的铂丝端插入镀金的1 mm公头连接针中，使用尖嘴钳将连接针的齿状部分压接在铂丝裸露端（见材料表）。
3. 将铂丝焊接到镀金连接针上，注意不要使用过多焊料。
4. 通过搅拌将50 mg多巴胺盐酸盐溶解于50 mL的10 mM磷酸盐缓冲液（PBS，pH 6.0）中，配制多巴胺溶液。
5. 待多巴胺完全溶解后，将铂丝末端浸入盛有新配制的含多巴胺PBS溶液的容器中。将一个镀金连接针插入前置放大器的一个通道内（见材料表）。
6. 将AgCl圆盘电极（接地电极，见材料表）连接至前置放大器的接地通道。将AgCl圆盘电极放入含有多巴胺PBS溶液和铂丝的容器中，注意仅使圆盘电极浸没，避免导线或焊点接触液体。在继续下一步前，将一根导线分流器接入前置放大器的参考通道。
7. 打开交互式数据采集软件（见材料表）。设置一个锯齿波电沉积电位程序，参数如下：起始电位 = −0.6 V；终止电位 = +0.65 V；扫描速率 = 0.04 V∙s^-1；沉积时间 = 420 s。启动聚多巴胺沉积程序，并确保所有导线连接正确。
8. 完成聚多巴胺沉积后，小心地将AgCl接地片和铂丝尖端从容器中取出，注意不要扰动铂丝电极的尖端。将铂丝尖端放入盛有PBS（pH 7.4）的微量离心管中浸泡2–5分钟，同时准备抗体溶液；确保铂丝尖端不接触离心管壁或底部。
   注：可在聚多巴胺沉积过程中配制抗体溶液；但聚多巴胺沉积完成后，必须将铂丝从含多巴胺的容器转移至PBS离心管中，此步骤不可省略。
9. 配制抗体溶液。将目标抗体与PBS（pH 7.4）按1:20的比例在适当大小的容器（如微量离心管）中混合。
   注：本实验使用的抗NPY单克隆抗体（见材料表）原液浓度为1 mg/mL；示例配比为4 µL抗体加入76 µL PBS中。
10. 将沉积了聚多巴胺的铂电极尖端浸入抗体溶液中，在室温下孵育至少2小时，再次确保铂丝尖端悬浮于溶液中，不接触微量离心管内壁。
    注：近期该技术的应用倾向于在此步骤后立即使用铂丝电极，而非湿存或干存以备后续使用。
11. 在抗体溶液中孵育后，用PBS（pH 7.4）短暂冲洗新功能化的电容型免疫探针（CI探针）尖端。探针现已准备就绪，可供使用。

2. 实验设置用于 体外 肽的检测与定量

1. 将CI探针的功能端放入流室中，注意不要以任何方式触碰或扰动电极尖端，以免损坏探针的传感端。
   注意：流室是通过将硅酮弹性体（参见材料表）倒入一个直径为35 mm的培养皿中制成，培养皿中央放置一个细长的椭圆形占位物。待弹性体固化后，移除椭圆形占位物即形成流室。实验时用Tris缓冲盐水（TBS）持续灌流流室，流速维持在3 mL/min。确保进液和出液保持流室内液面稳定，避免灌流液出现潮汐样波动。只要CI探针处于使用状态，灌流必须持续进行。
2. 在首次实验测试前，使用TBS进行标准运行以预处理CI探针。设置如下命令电压程序：正向阶跃电位 = +100 mV；负向阶跃电位 = −5 mV；阶跃持续时间 = 20 ms；数据采集时长 = 600 s。
   注意：在数据采集前的初始循环阶段，必须给予探针足够的平衡时间，以确保其稳定。
3. 使用相同的TBS配制目标肽溶液，以维持灌流液的组成一致。建立一个管路切换系统，使灌流液可在TBS与添加肽的TBS之间切换，同时避免向管路系统或流室中引入气泡。
   注意：本研究中使用了合成的猪源性NPY肽（参见材料表）。
4. 采用TBS标准参数设置肽传感的数据采集程序（参见步骤2.2）。
   ​注意：在本实验中，每次测试的总时长为360 s（前120 s为TBS灌流，中间120 s为添加肽的TBS灌流，最后120 s恢复为TBS灌流）。

3. CI探针的适配 体内 使用

1. 在进行聚多巴胺沉积之前（步骤1.7），将铂丝电极暴露的尖端穿过一支22 G的皮下注射针头，使其超出针尖约2 mm。用镊子轻轻将铂丝电极的尖端向后弯折，形成一个 "刺突" 悬挂在皮下注射针末端的液滴。
   1. 轻轻将针头从带倒钩的尖端撤出，留出足够的导丝长度以便放入血管，同时避免针头接触液体。继续执行步骤 1.4–1.11。
      注意：根据具体情况 体内 在设置过程中，可能需要截取一段超过25 cm的铂丝。
2. 在将CI探头连接至前置放大器之前，务必确保整个电学装置已正确接地。否则，可能在实验记录过程中引入不必要的电干扰。
3. 按照先前发表的文献对动物进行麻醉¹⁰.
4. 进行手术以暴露目标区域。
   注意：本研究中采用胸骨正中切开术以暴露心脏。详见 Kluge 等人。¹⁰ 有关动物手术的详细信息。
5. 轻轻将功能化探针从 PBS 漂洗液中取出（步骤 1.11），将套管针向前推进至带倒钩的 C.I. 探针处，并在将金质连接针插入前置放大器之前，轻柔地将其植入目标区域。植入后，撤出套管针，使电极保留在原位。
   注意：在本研究中，探针被放置于左心室心肌的中间侧壁。¹⁰.
6. 在确保正确电气设置后，按照标准和实验测试方案（步骤2.2和步骤2.4）进行操作。
7. 实验结束后，按照机构批准的技术对动物实施安乐死。
   注意：在本研究中，动物在深度麻醉下被实施安乐死 通过 心室颤动的诱导¹⁰.

结果

电极的制备与表征
制备了一种柔性电容型免疫探针（CI探针），其代表性图像如图1A所示。电极电位由计算机控制的电压钳制电路设定（图1B），并将电极浸入用PBS配制的多巴胺溶液中。通过电沉积将多巴胺沉积到导电电极尖端¹³，以实现表面功能化。指令电位驱动探针电压，同时测量钳制电流的注入情况。单次多巴胺沉积循环过程中测得的钳制电流如图1C所示。在完成多巴胺沉积后，立即把包被的电极尖端浸入目标抗体溶液中（图2A）。所有电极均在完成这些步骤后立即使用。

体外 NPY 测定
将抗体功能化的探针置于流动池中，并通过电压钳电路施加示例性指令电位进行驱动，记录到的电流如图所示（...

讨论

本方案描述了一种可检测和测量目标生物标志物的电容式免疫探针（CI探针）的制备与检测方法，适用于 体外 和 体内 设置。通过在电极尖端捕获生物标志物实现检测。捕获事件会改变铂丝电容型免疫探针与其周围导电液体环境之间的电容结，表现为探针电位变化时电荷电流的改变。同时还提出了一种独特的电信号采集方案，可实现 "重置" 通过静电排斥作用将捕获的生物标志物从探针尖端释放，从而在检测循环之间清除免疫探针上的生物标志物。这种生物标志物的清除使得后续测量循环得以进行，从而实现时间分辨的检测¹⁰在此实施方案中，探针的制备包括在细铂丝电极尖端电沉积一层多巴胺反应性聚合层，该层通过共价键结合针对特定生物标志物的抗体。多巴胺与聚多巴胺的区别在于，聚多巴胺含有醌基官能团。这些醌基可作为亲核试剂攻击的目标，与伯胺发生反应形成共价键。²¹该方案中最关键的步骤是小心操作物理导线，因为功能化尖端的任何磨损都可能导致CI探针无法使用。

此外，在测量前确保CI探针的稳定性至...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
AgCl圆盘电极	Warner Instruments (Holliston, MA)	64-1307
抗NPY单克隆抗体	Abcam, (Cambridge, MA)	ab112473
定制多通道放大器/1 MΩ反馈电阻多通道前置放大器	NPI Electronic, (Tamm, Germany)	NA	基于NPI VA-10M多通道放大器
盐酸多巴胺	Sigma Aldrich (St. Louis, MO)	H8502-10G
镀金公插针	AMP-TE Connectivity (Amplimite)	6-66506-1
HEKA LIH 8+8 模数/数模转换装置	HEKA Elektronik, (Holliston, MA)	NA
Igor Pro 数据采集软件，v. 7.08	WaveMetrics, (Lake Oswego, OR)		控制电位和数据采集的软件为自主编写
Masterflex L/S 标准数字蠕动泵	Cole Palmer, (Vernon Hills, IL)
PFA涂层铂丝	A-M Systems, (Sequim, WA)	773000	裸直径0.005”，涂层直径0.008”
硅酮弹性体	World Precision Instruments (Sarasota, FL)	SYLG184
合成猪源NPY肽	Bachem (Torrance, CA)	4011654
合成猪源NPY肽	Bachem (Torrance, CA)	4011654