测定肽类递质的既定免疫化学方法 体内 依赖微透析或大量体液抽取来获取样本进行离线分析。然而，这些方法存在时空分辨率的局限性。本方案描述了一种电容型免疫探针生物传感器的制备与应用，可克服现有技术的局限性。
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本文内容
摘要
摘要
能够在体测量与疾病进展评估相关的生物标志物，是科学界和医学界广泛关注的课题。目前某些生物标志物的检测方法所得结果的分辨率往往需要数天甚至数周才能获得，因其在空间和时间分辨率上均存在局限性（例如，通过酶联免疫吸附试验[ELISA]、高效液相色谱[HPLC]或质谱法分析间质液的液体隔室微透析）；因此，其对及时诊断和治疗的指导作用受到限制。本研究报道了一种利用电容型免疫探针生物传感器（CI探针）在体检测和测量肽类递质的独特技术。文中描述了此类探针的制备流程及其体外表征，并提供了在体条件下交感神经刺激诱发的神经肽Y（NPY）释放的测量结果。NPY的释放与去甲肾上腺素的交感释放相关联，作为参考依据。数据表明，该方法可实现对神经肽类物质在体的快速、局部化测量。未来应用包括术中对疾病进展的实时评估，以及通过微创导管部署此类探针。
引言
在蛋白质化学和临床诊断中，尤其是癌症诊断及心血管疾病进展评估，多种用于检测和定量生物标志物的化学方法被常规使用。目前，高效液相色谱法（HPLC）、酶联免疫吸附测定法（ELISA）和质谱法等方法依赖于从血管腔室1,2,3通过大量体液抽取或从组织间质腔室通过微透析采集样本。微透析采用一段已知长度的半透膜管，将其置入感兴趣区域，通过在数分钟内向管内灌注收集液4以获取待分析样本5，从而限制了时间分辨率。因此，所采集的样本仅能提供局部微环境在一段时间内的平均值，且受限于灌注速率以及足够样本体积的收集。此外，这些方法需要对实验数据进行汇总和信号平均处理，因而可能无法反映个体间的差异性。更重要的是，样本采集与后续离线分析之间的时间间隔阻碍了即时的临床干预和治疗措施的实施。
本方案概述了一种电容型免疫探针生物传感器（CI探针）用于特异性生物活性肽的时间分辨电学检测方法。神经肽Y（NPY）由支配血管、心内膜、心肌细胞和心脏内神经节的节后交感神经元释放，是心血管系统中一种重要的神经调节肽类递质6,7<....
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方案
所有动物实验均经加州大学洛杉矶分校动物研究委员会批准，并遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》（第8版，2011年）中规定的原则进行10。实验使用约75 kg的成年雄性约克夏猪进行in vivo研究
1. 电容型免疫探针的制备与功能化
- 取一段25 cm长的全氟烷氧基（PFA）涂层铂丝（见材料表），使用手术刀从一端剥离约5 mm的PFA涂层，注意不要割伤铂丝。
- 将剥离后的铂丝端插入镀金的1 mm公头连接针中，使用尖嘴钳将连接针的齿状部分压接在铂丝裸露端（见材料表）。
- 将铂丝焊接到镀金连接针上，注意不要使用过多焊料。
- 通过搅拌将50 mg多巴胺盐酸盐溶解于50 mL的10 mM磷酸盐缓冲液（PBS，pH 6.0）中，配制多巴胺溶液。
- 待多巴胺完全溶解后，将铂丝末端浸入盛有新配制的含多巴胺PBS溶液的容器中。将一个镀金连接针插入前置放大器的一个通道内（见材料表）。
- 将AgCl圆盘电极（接地电极，见材料表）连接至前置放大器的接地通道。将AgCl圆盘电极放入含有多巴胺PBS溶液和铂丝的容器中，注意仅使圆盘电极浸没，避免导线....
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结果
电极的制备与表征
制备了一种柔性电容型免疫探针（CI探针），其代表性图像如图1A所示。电极电位由计算机控制的电压钳制电路设定（图1B），并将电极浸入用PBS配制的多巴胺溶液中。通过电沉积将多巴胺沉积到导电电极尖端13，以实现表面功能化。指令电位驱动探针电压，同时测量钳制电流的注入情况。单次多巴胺沉积循环过程中测得的钳制电流如图1C所示。在完成多巴胺沉积后，立即把包被的电极尖端浸入目标抗体溶液中（图2A）。所有电极均在完成这些步骤后立即使用。
体外 NPY 测定
将抗体功能化的探针置于流动池中，并通过电压钳电路施加示例性指令电位进行驱动，记录到的电流如图所示（.......
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讨论
本方案描述了一种可检测和测量目标生物标志物的电容式免疫探针（CI探针）的制备与检测方法，适用于 体外 和 体内 设置。通过在电极尖端捕获生物标志物实现检测。捕获事件会改变铂丝电容型免疫探针与其周围导电液体环境之间的电容结，表现为探针电位变化时电荷电流的改变。同时还提出了一种独特的电信号采集方案，可实现 "重置" 通过静电排斥作用将捕获的生物标志物从探针尖端释放，从而在检测循环之间清除免疫探针上的生物标志物。这种生物标志物的清除使得后续测量循环得以进行，从而实现时间分辨的检测10在此实施方案中，探针的制备包括在细铂丝电极尖端电沉积一层多巴胺反应性聚合层，该层通过共价键结合针对特定生物标志物的抗体。多巴胺与聚多巴胺的区别在于，聚多巴胺含有醌基官能团。这些醌基可作为亲核试剂攻击的目标，与伯胺发生反应形成共价键。21该方案中最关键的步骤是小心操作物理导线，因为功能化尖端的任何磨损都可能导致CI探针无法使用。
此外，在测量前确保CI探针的稳定性至.......
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披露
作者声明不存在任何经济或其他方面的利益冲突。
致谢
我们感谢加州大学洛杉矶分校心脏心律失常中心的 Olu Ajijola 博士提供的专业支持 体内 实验。本工作由美国国立卫生研究院（NIH）U01 EB025138项目（JLA, CS）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| AgCl圆盘电极 | Warner Instruments (Holliston, MA) | 64-1307 | |
| 抗NPY单克隆抗体 | Abcam, (Cambridge, MA) | ab112473 | |
| 定制多通道放大器/1 MΩ反馈电阻多通道前置放大器 | NPI Electronic, (Tamm, Germany) | NA | 基于NPI VA-10M多通道放大器 |
| 盐酸多巴胺 | Sigma Aldrich (St. Louis, MO) | H8502-10G | |
| 镀金公插针 | AMP-TE Connectivity (Amplimite) | 6-66506-1 | |
| HEKA LIH 8+8 模数/数模转换装置 | HEKA Elektronik, (Holliston, MA) | NA | |
| Igor Pro 数据采集软件，v. 7.08 | WaveMetrics, (Lake Oswego, OR) | 控制电位和数据采集的软件为自主编写 | |
| Masterflex L/S 标准数字蠕动泵 | Cole Palmer, (Vernon Hills, IL) | ||
| PFA涂层铂丝 | A-M Systems, (Sequim, WA) | 773000 | 裸直径0.005”，涂层直径0.008” |
| 硅酮弹性体 | World Precision Instruments (Sarasota, FL) | SYLG184 | |
| 合成猪源NPY肽 | Bachem (Torrance, CA) | 4011654 | |
| 合成猪源NPY肽 | Bachem (Torrance, CA) | 4011654 |
参考文献
- Chow, S. L., et al. Role of Biomarkers for the prevention, assessment, and management of heart failure: A scientific statement from the American Heart Association. Circulation. 135 (22), 1054-1091 (2017).
- Goldstein, D. S.
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