快速脂质分析的样品制备 果蝇 利用基质辅助激光解吸/电离质谱成像技术研究大脑

摘要

本实验方案的目的是为小组织（如 果蝇 脑组织，采用基质辅助激光解吸/电离（MALDI）质谱成像技术。

摘要

脂质谱分析，或称脂质组学，是一种用于研究细胞或组织中全部脂质成分的成熟技术。通过该技术获得的信息可用于 脂质组学在研究发育、疾病及细胞代谢相关通路方面具有重要价值。许多工具和仪器已广泛应用于脂质组学研究，其中尤以质谱与液相色谱技术的各种联用方法最为突出。基质辅助激光解吸/电离质谱成像（MALDI MSI）近年来作为一种强大的成像技术崭露头角，可有效补充传统研究方法。该新技术能够提供组织区域内脂质空间分布的独特信息，而此类信息在以往若无大量修饰手段则无法获得。MALDI MSI 方法的样品制备至关重要，因此成为本文的重点。本文介绍了一种对大量样本进行快速脂质分析的方法 黑腹果蝇 使用最佳切割温度化合物（OCT）包埋的脑组织，提供用于通过基质辅助激光解吸电离质谱成像（MALDI MSI）进行脂质分析或代谢物与小分子分析的小组织样品制备的详细方案。

引言

脂质参与多种生物学过程，根据其结构多样性可大致分为五类：脂肪酸、甘油三酯（TAGs）、磷脂、甾醇脂质和鞘脂¹。脂质的基本功能是为生物过程提供能量来源（如甘油三酯）以及构成细胞膜（如磷脂和胆固醇）。 然而，脂质在发育和疾病中的其他作用也已被发现，并在生物医学领域得到广泛研究。例如，已有研究表明，不同链长的脂肪酸可能具有独特的治疗作用：短链脂肪酸可参与对抗自身免疫性疾病的防御机制，中链脂肪酸可产生缓解癫痫发作的代谢物，而长链脂肪酸则可生成用于治疗代谢性疾病的代谢物²。在神经系统中，胶质细胞来源的胆固醇和磷脂已被证实对突触形成至关重要^3,4。其他类型的脂质在医学应用中也展现出潜力，包括用于药物递送系统的 鞘脂以及支持免疫系统的 糖脂^5,6。脂质在生物医学领域中的多种作用及其潜在的治疗应用，使得脂质组学——即对细胞脂质通路及其相互作用的研究——成为一个关键且日益重要的研究领域。

脂质组学利用分析化学大规模研究脂质组。脂质组学中主要的实验方法基于质谱法（MS），并结合多种色谱和离子迁移技术^7,8。质谱法在该领域具有显著优势，包括高特异性和灵敏度、快速的数据采集能力，以及独特的功能：（1）可检测即使处于低水平或短暂存在的脂质及其代谢物；（2）单次实验中可检测数百种不同的脂质化合物；（3）鉴定先前未知的脂质；（4）区分脂质异构体。在质谱技术的发展中，包括解吸电喷雾电离（DESI）、基质辅助激光解吸电离（MALDI）和二次离子质谱（SIMS），其中MALDI质谱成像（MALDI MSI）已成为一种强大的成像技术，能够提供脂质在组织区域内空间分布的独特信息，从而补充传统的基于质谱的分析方法^9,10。

脂质组学的典型工作流程包括样品制备、利用质谱技术进行数据采集以及数据分析¹¹脂质和代谢物在样品中的研究推动了用于理解生物体代谢过程中生理与病理状态的技术发展。尽管理解生物相互作用至关重要，但脂质和代谢物的敏感性使其在缺乏染料或其他修饰的情况下难以成像和鉴定。代谢物水平或分布的变化可能导致表型改变。一种用于代谢组学分析的工具是MALDI MSI，该技术无需标记， 原位 一种能够同时检测数百种分子的成像技术。基质辅助激光解吸电离成像（MALDI成像）可在保持样品完整性和空间分布的前提下，实现对代谢物和脂质的可视化。以往的脂质谱分析技术依赖放射性化学物质对脂质进行逐个定位成像，而MALDI成像则无需使用此类试剂，可同时检测多种脂质。

脂质代谢与稳态在细胞生理学中发挥着重要作用，例如维持和促进神经系统的发育。神经系统脂质代谢的一个关键方面是神经元与胶质细胞之间的脂质转运，这一过程由分子载体脂蛋白介导，包括极低密度脂蛋白（VLDL）、低密度脂蛋白（LDL）和高密度脂蛋白（HDL）¹²。脂蛋白包含载脂蛋白（Apo），如 ApoB 和 ApoD，它们既作为脂质运载物的结构组分，也作为脂蛋白受体的配体。神经元与胶质细胞间的脂质交互涉及多种因子，包括胶质细胞分泌的 ApoD、ApoE 和 ApoJ，以及神经元上的低密度脂蛋白受体（LDLRs）^13,14。在 Drosophila 中，载脂蛋白原（apolipophorin）是 ApoB 家族成员，也是血淋巴中主要的脂质载体¹⁵。载脂蛋白原具有两个高度同源的脂蛋白受体（LpRs），即 LpR1 和 LpR2，它们是哺乳动物 LDLR 的同源物^15,16。在前期研究中发现，星形胶质细胞分泌的脂质运载蛋白 Glial Lazarillo（GLaz）——一种人类 ApoD 的 Drosophila 同源蛋白——与其神经元受体 LpR1 协同介导了神经元-胶质细胞间的脂质转运，从而调控树突形态发生¹⁷。因此，推测 LpR1 的缺失会导致 Drosophila 脑组织整体脂质含量下降。基质辅助激光解吸电离质谱成像（MALDI MSI）适用于分析 LpR1^−/− 突变体与野生型 Drosophila 脑组织等微小样本中的脂质组成，本研究即展示了该技术的应用。

尽管基质辅助激光解吸电离质谱成像（MALDI MSI）的应用日益广泛，但其高昂的仪器成本和复杂的实验操作常常限制了该技术在独立实验室中的实施。因此，大多数MALDI MSI研究通常依赖于共享的核心设施来完成。与其他MALDI MSI应用一样，脂质组学研究中严谨的样品制备过程对于获得可靠结果至关重要。然而，由于载玻片样品的制备通常在各个独立的研究实验室中进行，可能导致MALDI MSI检测结果存在变异。为解决这一问题，本文旨在提供一份详细的样品制备操作流程，以正离子模式下对大量成年Drosophila脑组织进行脂质分析为例，展示如何对小型生物样品在MALDI MSI检测前进行样品处理^11,17。然而，某些磷脂类别以及大多数小分子代谢物在负离子模式下通过MALDI成像检测更为灵敏，这一点在先前的研究中已有描述¹¹。因此，结合这两项示例研究，我们希望提供涵盖多种组合方式的详细样品制备方案：游离的大组织与包埋的小组织、冷冻贴片与温热载玻片贴片、正离子模式与负离子模式。

方案

1. 果蝇头部包埋

注意：整个过程需要约 45-60 分钟。

1. 准备一个表面平整的冰冻切片包埋剂（OCT 化合物）载台。
   1. 将 OCT 化合物加入塑料冷冻模具（15 mm × 15 mm × 5 mm）中，填充至模具深度的一半，避免产生气泡。将模具静置于平坦表面上数分钟，然后转移至干冰上。
   2. 保持冷冻模具在干冰上处于水平状态，使 OCT 形成平整均匀的表面。等待 OCT 在模具中完全凝固。制备好的冷冻 OCT 载台应立即使用，或保存于 −80 °C。
2. 使用 CO₂ 对成年果蝇进行麻醉（例如，使用 CO₂ 麻醉垫）。
   1. 准备一个培养皿，内放一片实验室擦拭纸。用水润湿擦拭纸的一部分，以减少静电。保持擦拭纸一半湿润、一半干燥。
   2. 在解剖显微镜 1 下，用镊子切下果蝇头部。每次收集 4–5 个头部，并将其放置在擦拭纸的干燥区域。
      注意：收集 4–5 个头部约需 2 分钟。
3. 将 OCT 载台从干冰转移至解剖显微镜工作区域。
   1. 将 OCT 载台从干冰取出，立即转移至显微镜 2，迅速将果蝇头部转移至 OCT 载台并排列整齐，整个过程约需 30 秒，以避免 OCT 融化。每个果蝇脑组织周围应预留约 1 mm 的空白区域，以确保 OCT 提供足够的支撑；同时，组织块边缘应预留 4–5 mm 的空白空间，以便后续切片操作。若吻部过长，可剪除其尖端；若长度适中，则保持完整。将 OCT 载台放回干冰，静置约 3 分钟，确保其保持冻结和固态。
   2. 当 OCT 载台再次置于干冰上等待凝固时，可进行下一轮头部收集。重复步骤 1.2 和 1.3，将额外样本转移至载台的剩余空间。
      注意：本实验室通常每种基因型准备 8 个头部，每个 OCT 载台可容纳 4 种基因型。
   3. 使用两台并排的解剖显微镜，避免频繁调焦，缩短头部转移与排列所需时间，降低 OCT 载台融化的风险。
4. 在所有果蝇头部排列完毕后，将 OCT 载台继续置于干冰上静置 5–10 分钟。
5. 将 OCT 载台从干冰取出，放置于平坦台面（实验台），迅速加入大量 OCT 化合物，完全覆盖所有样本并填满整个冷冻模具，此过程约需 3 秒。
6. 立即将冷冻模具放回干冰，使包含包埋组织的整个 OCT 块完全冻结。让 OCT 载台在干冰上继续静置 5–10 分钟。在冷冻模具边缘标记样本信息。
7. 将冻结的样本储存于 −80 °C，直至进行切片操作。

2. 组织的冷冻切片

注意：操作氧化铟锡（ITO）载玻片时，应始终佩戴手套以避免组织污染。建议同时佩戴口罩，以防止直接向载玻片呼气。

1. 使用设定为电阻模式的电压表检测ITO载玻片的导电性，以确认ITO涂层一侧。将测得电阻的一侧标记为用于黏附组织的一侧，并做好标签。每次操作时，始终在载玻片底部放置一片实验室擦拭纸，以避免载玻片污染。
2. 让组织在冷冻切片机舱内平衡30-45分钟。
   1. 为避免OCT融化，应提前将所有必要工具（如镊子和细尖画笔）放入冷冻切片机舱内进行预冷。
3. 用70%乙醇清洁冷冻切片机，最好使用70%乙醇。擦拭滚轮板和载物台，并更换已使用的刀片。使用额外的洁净擦拭纸确保乙醇已完全挥发，所有表面均干燥后，再开始切片。
4. 根据组织类型调整冷冻切片机腔室和样本头的温度（例如，肝脏为−14 °C，肌肉为−20 °C，皮肤为−25 °C）¹⁰；本方案中果蝇头部保存于−18 °C。
5. 使用OCT将组织固定在样本托上。注意使用足量的OCT覆盖OCT包埋块的底部，并尽可能平整地安装包埋块。
6. 将洁净的刀片放入载物台并固定。根据需要调整样本头部的位置，以达到所需的切割角度。
   1. 将样本块以所有基因型/处理组均垂直于刀片的方向放置。
      注意：这可以确保切面的一致性，并避免不同组别之间的交叉污染。若切割不同的组织块，应在样品之间更换新刀片，以防止交叉污染。
7. 开始以厚切片（50–100 µm）进行切割，直至找到目标区域（例如脑部的特定区域）。
   1. 用预冷的艺术家画笔不断刷去多余的碎屑，以保持工作区域清洁。
8. 当到达目标区域后，将切片厚度调整为10–12 µm。
   1. 根据需要略微调整腔室温度。例如，如果切片容易碎裂或脱落，可设置较高的温度。
      注意：OCT包埋块的推荐温度为−18 °C。
9. 小心地切取所需组织区域，并将其贴附于ITO载玻片上。此操作应在冷冻切片机腔室内进行。
   1. 取一片室温的ITO载玻片，将其置于切片上方，缓慢接近 轻柔且迅速地操作切片，使其贴附于载玻片上，同时不在冷冻切片机载物台上留下痕迹。
      注意：OCT 会融化并粘附在载玻片上。
10. 将载玻片置于冷冻切片机外的架上或实验擦拭纸上，以备在连续切片过程中暂存。
11. 若需对同一队列的不同样本进行比较，可将多个样本的切片置于同一张载玻片上，以实现同步分析并最大程度减少 变异。如有必要，可分至两张载玻片上，因为MALDI靶板架可在单次运行中容纳两张载玻片。
12. 将载玻片放入真空箱中，转移至底部铺有干燥剂的干燥器内。在真空条件下干燥30–60分钟。
    注意：或者，如果实验室未配备真空干燥器，则载玻片应在整个过程中保存于 −20 °C，直至24小时内转移至 −80 °C 保存，或用干冰运输，以避免脂质或代谢物降解。
13. 进行基质沉积。使用2,5-二羟基苯甲酸（DHB）溶于甲醇/水（70/30，v/v）作为基质。
14. 如果切片不能立即进行检测，可将切片在−80 °C保存（果蝇脑切片最长1个月，啮齿类动物脑切片最长6个月），或立即使用足量干冰将样本运送至MALDI核心设施。为实现最佳保存和运输效果，应将切片放入切片运输盒中，并用封口膜严密封闭开口；再用自封袋密封，放入另一个含有干燥剂的自封袋中，并在外部贴上标签。
    注意：有关切片扫描、基质沉积和MALDI成像步骤的详细操作，请参见先前的研究工作¹¹.
15. 使用自动 HTX M5 基质喷雾仪，以甲醇/水（70/30，v/v）中 40 mg/mL 的 DHB 溶液进行基质沉积。设置定制流速为 0.12 mL/min，喷嘴温度为 85 °C，喷雾 10 次。使用 N₂ 10 psi 的气体压力。
    注意：如果喷雾器中的氮气压力低于5 psi，喷雾器的安全机制将立即关闭加热器，以避免在1,300 mm/min的喷雾速度、2 mm的轨迹间距、3 L/min的流量和40 mm的喷嘴高度下对喷雾器造成损坏。
16. 使用基质辅助激光解吸电离飞行时间（TOF）质谱仪（参见 材料表在正离子模式下进行检测，采集质荷比（m/z）50–1,000 范围内的质谱图。
    1. 为校准仪器，将0.5 µL乙腈中的红磷乳液点样至ITO载玻片上，并利用其质谱在50–1,000 m/z质量范围内应用二次校准曲线对仪器进行校准。².
    2. 将激光光斑直径设置为 培养基，因为这是针对40 µm光栅宽度调制的光束轮廓，并在每个阵列位置以1,000 Hz的激光重复频率累积500次 shots 来采集成像数据。
    3. 使用软件（参见 材料清单）记录和处理光谱数据。使用均方根（RMS）归一化方法进行成像数据分析，以±0.10 Da的质荷比区间宽度生成离子图像。利用软件对同一实验中的OCT与脑组织光谱进行比对，评估OCT的峰重叠情况及其引起的离子抑制干扰。补充图 S1实验结束后，对含有组织样本的MALDI载玻片进行苏木精和伊红（H&E）染色处理&E) 染色，如前所述¹¹.

结果

人们推测，星形胶质细胞分泌的脂联蛋白 Glial Lazarillo（GLaz）的神经元受体 LpR1 的缺失——GLaz 是人类 ApoD 的 Drosophila 同源物——可能导致 Drosophila 大脑整体脂质含量下降。为验证这一假设，采用 MALDI 质谱成像技术对 LpR1^−/− 突变型和野生型 Drosophila 大脑中的脂质进行了谱型分析，具体方法如下所述。

实验按照图1所示的工作流程进行。成年果蝇脑组织按上述方法获取，包埋于OCT中，并使用干冰冷冻OCT包埋块。将OCT组织块在−18 °C条件下进行冷冻切片，切片厚度为12 µm，样品头和切片室温度均为−18 °C。将贴有冷冻切片的ITO载玻片置于室温下真空干燥30分钟。随后，使用自动HTX M5基质喷雾仪，以40 mg/mL的DHB溶于甲醇/水（70/30，v/v）的溶液进行基质沉积。

MALDI 飞...

讨论

如在突变型与野生型脂质组成差异的研究中所示 黑腹果蝇 大脑，MALDI质谱成像可作为一种有价值的无标记成像技术 原位 小昆虫器官内分子分布模式的分析。事实上，由于脂质分布在脑组织和脂肪体中 黑腹果蝇 头部，当使用全头提取时，基于液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）的传统脂质组学方法只能检测到两个区域的合并信号。总体而言，对于果蝇等小型昆虫器官内亚区的差异性脂质组学分析 果蝇 对于LC-MS方法而言，是一项非常耗时且具有挑战性的任务¹⁸这需要对这些区域进行解剖，具有很大的挑战性。相比之下，MALDI质谱成像能够提供足够的分辨率，以区分不同的解剖结构，即使在微小的区域内也是如此 果蝇 脑组织。与传统的液相色谱-质谱联用技术相比，该方法对组织样本需求量极小，因此也适用于临床活检等珍贵样本。此外，为基质辅助激光解吸电离质谱成像（MALDI MSI）制备的样本切片还可用于飞行时间二次离子质谱（TOF-SIMS）和免疫组织化学等互补技术进行检测，从而实现多学科交叉方法所获数据的整合

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2,5-二羟基苯甲酸（DHB）	Millipore Sigma Aldrich	85707-1G-F
Andwin Scientific CRYOMOLD 15X15X5	Fisher Scientific	NC9464347
Andwin Scientific Tissue-Tek CRYO-OCT 包埋剂	Fisher Scientific	14-373-65
艺术家毛笔 MSC #5 1/8 X 9/16 TRIM RED SABLE	Fisher Scientific	50-111-2302
autoflex speed MALDI-TOF 质谱系统	Bruker Daltonics Inc		MALDI-TOF 质谱仪
BD 带鲁尔锁扣头的注射器	Fisher Scientific	14-823-16E
BD Vacutainer 通用注射器针头	Fisher Scientific	23-021-020
Bruker Daltonics 用于 MALDI 成像的玻璃载玻片	Fisher Scientific	NC0380464
Drierite（含指示剂，8目），ACROS Organics		AC219095000
Epson Perfection V600 照片扫描仪	Amazon	Perfection V600
Fisherbrand 五位载玻片邮寄盒	Fisher Scientific	HS15986
Fisherbrand 数字自动量程万用表	Fisher Scientific	01-241-1
FlexImaging v3.0	Bruker Daltonics Inc		Bruker 质谱成像分析软件
色谱级甲醇	Fisher Scientific	MMX04751
色谱级水	Fisher Scientific	W5-1
HTX M5 喷雾仪	HTX Technologies, LLC		自动加热基质喷雾仪
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes 精细擦拭纸	Fisher Scientific	06-666A
MSC Ziploc 冷冻密封袋	Fisher Scientific	50-111-3769
SCiLS Lab (2015b)	SCiLS Lab		高级 MALDI 质谱成像数据分析软件
Thermo Scientific CryoStar NX50 冷冻切片机	Fisher Thermo Scientific	95-713-0
Thermo Scientific Nalgene 透明聚碳酸酯经典设计干燥器	Fisher Scientific	08-642-7