利用精密切割的肺切片研究气道和肺内平滑肌的收缩调节

摘要

本方案描述了制备和利用小鼠精确切割的肺切片来评估在近 体内 环境中的气道和肺内动脉平滑肌收缩力。

摘要

平滑肌细胞（SMC）介导气道和肺内动脉的收缩，分别改变气流阻力和肺循环，因此在肺系统的稳态中起着关键作用。SMC收缩力的放松调节会导致几种肺部疾病，包括哮喘和肺动脉高压。然而，由于组织通路有限且缺乏维持 体内 SMC表型的培养系统，这些疾病中SMC收缩性失调的分子机制仍然得到充分鉴定。精密切割肺切片（PCLS）提供了一种离 体 模型，可以规避这些技术难题。作为活的薄肺组织切片，PCLS将SMC保留在自然环境中，并允许 原位 跟踪SMC收缩和细胞内Ca^{2 +} 信号传导，调节SMC收缩力。这里，提供了详细的小鼠PCLS制备方案，其保留了完整的气道和肺内动脉。该方案涉及在对肺叶进行切片之前的两个基本步骤:通过气管用低熔点琼脂糖充气气道，并通过右心室用明胶填充肺血管。使用该方案制备的PCLS可用于生物测定，以评估气道和肺动脉内室中Ca^{2 +}介导的SMC收缩调节。当应用于呼吸系统疾病的小鼠模型时，该方案能够对SMC进行功能研究，从而深入了解疾病中SMC收缩性调节的潜在机制。

引言

平滑肌细胞（SMC）是肺中的主要结构细胞类型，主要位于气道和肺血管的介质壁中。SMC收缩以改变腔径，从而调节空气和血流量^1，2。因此，SMC的收缩调节对于维持空气通气和肺循环的稳态至关重要。相反，异常的SMC收缩性会引起阻塞性气道或肺部血管疾病，如哮喘和肺动脉高压。然而，肺 SMC 的功能评估受到肺部组织（尤其是肺远端的小气道和微血管）的有限访问的挑战^2，3。目前的解决方案采用间接检测，例如通过Flexivent测量气流阻力以反映气道收缩，以及通过右心导管检查肺动脉血压以评估肺血管收缩^4，5。然而，这些间接测定具有多种缺点，例如被结构因素混淆，未能捕获整个肺尺度^6，7中气道或血管反应的空间多样性，以及不适合细胞水平上收缩调节的机制研究。因此，使用分离的原代细胞，气管/支气管肌肉条^8，9或大血管段¹⁰的替代....

方案

所有动物护理均符合马萨诸塞州总医院机构动物护理和使用委员会的指导方针。本研究使用8周龄的野生型C57 / B6雄性小鼠。

1. 实验准备

1. 准备工作解决方案。
   1. 准备1x汉克平衡盐溶液（HBSS，含钙²⁺ 和镁²⁺，pH值与20mM HEPES平衡，参见 材料表）。使用 HBSS 解决方案来制备和处理 PCLS。在制备PCLS时，将HBSS溶液放在冰上保持低温。
2. 通过用抗生素 - 抗真菌剂（1:100体积比，见 材料表）补充杜尔贝科的改性鹰培养基和F-12（DMEM-F12）来制备PCLS的培养基。
3. 制备1.5%琼脂糖和6%明胶溶液。
   1. 将低熔点（LMP）琼脂糖或明胶粉末（参见 材料表）与HBSS溶液分别在15 mL无菌离心管中混合（如果溶液体积>10 mL，则为50 mL管）至最终浓度。
      注意:琼脂糖溶液的总体积= 5 mL /小鼠x小鼠数量;明胶溶液= 2 mL /小鼠 x 小鼠数量。
   2. 在沸水中加热溶液管，直到粉末完全溶解。将琼脂糖和明胶溶液保持在42°C水浴中。
      注意:解剖台上的加热灯可用于保持操作环境温暖，并防止琼脂糖溶液在注射到小鼠肺部之前凝固。....

结果

小鼠 PCLS 制剂保留完整的肺内气道和动脉
在倒置相差显微镜下观察了150μm厚的PCLS。在小鼠肺中，传导性气道伴随着从肺叶到外周肺的肺内动脉。小鼠PCLS中具有代表性的肺气道 - 动脉束如图 2B所示。气道可以很容易地通过长方体上皮细胞识别，其内腔内表面有活跃的螺旋跳动。相反，附近的肺动脉以扁平内皮为特征。当到达外周肺野时，导电气道分支到呼吸管和囊中，围绕着小的腺泡内小动脉（图2C）。

利用小鼠PCLS评估肺气道和动脉收缩
甲基胆碱（MCh，1μM）诱导的气道收缩如图 2B所示。气道收缩反应通过MCh暴露后腔面积减少的百分比进行量化（图2D）。相反，肺动脉对MCh刺激没有反应（图2B）。在1天或5天培养.......

讨论

PCLS的制备涉及几个关键步骤。首先，必须均匀地使肺叶充气，以避免琼脂糖分布不均匀导致组织硬度的变化。由于液体琼脂糖在低于37°C的温度下在薄导管或气道中迅速凝胶化，由此产生的远端肺野填充缺陷可能增加肺组织硬度的差异，并在振动切片期间引起组织撕裂。因此，可以将低熔点琼脂糖溶液保持在42°C的水浴中，并在解剖台上使用加热灯，以避免琼脂糖凝胶化。快速注射可以将更多的琼脂糖推向肺实质，具有更高的顺应性，因此需要避免。手动琼脂糖注射通常需要大约5-7秒。其次，琼脂糖填充结束时的必要步骤是推动少量空气（〜0.2mL）以将琼脂糖从导电气道冲洗到远端肺泡空间。否则，琼脂糖会凝胶并停留在腔内以抵抗气道收缩。还值得注意的是，肺泡内的琼脂糖凝胶保持在原位，并且在培养箱中在37°C时永远不会再次熔化。琼脂糖凝胶在保持肺组织的3D结构方面起着至关重要的作用，因为肺组织的 3D结构在体内 由负胸内压维持。第三，用明胶溶液灌注肺动脉对于保持PCLS中的动脉腔开放至关重要。明胶溶液在室温下凝胶作为机械阻滞剂，以抵抗组织切片期间化学和物理刺激的血管收缩。如果没有明胶膨胀，肺切片中的肺动脉通常会塌陷并与周围的间质组织分离，即使在存在高剂量的混合血管舒张.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 mL 注射器	BD	309626
15 mL 无菌离心管	Celltreat	229411
3 mL 注射器	BD	309585
50 mL 无菌离心管	Celltreat	229422
乙酰-β-乙酰甲胆碱	Millipore Sigma	62-51-1
抗生素-抗真菌	药 ThermoFisher	15240-062
CCD 相机	尼康	Nikon Ds-Ri2 相机
盖眼镜	Fisher Scientific	12-548-5CP; 12-548-5PP
低温小瓶	Fisher Scientific	430488
定制的激光扫描共聚焦显微镜			参考资料 18
DMEM/F12	Fisher Scientific	MT-10-092-CM
内皮素 1	Millipore Sigma	E7764
精细解剖剪刀	Fisher Scientific	NC9702861
冷冻容器	Sigma-Aldrich	C1562
猪皮明胶	Sigma-Aldrich	9000-70-8
汉克斯平衡盐溶液 （HBSS）	Thermo Fisher
止血钳	Fisher Scientific	16-100-117
	HEPES Thermo Fisher	15630080
高真空硅脂	Fisher Scientific	146355d
异丙醇	Sigma-Aldrich	W292907-1KG-K
金属垫圈	家得宝产品管理局	800442	Everbilt平垫圈 #10
显微解剖钳	Sigma-Aldrich	F4142
针头皮静脉套装 （25 G）	EXELINT	26708
NOC-5	开曼化学	16534
尼龙网组件	供应	U-CMN-300
俄勒冈绿 488 BAPTA-1 AM	Life Technologies	o-6807
相差显微镜	尼康	尼康 Eclipse TS 100
Pluronic F-127	Thermo Fisher	P-6867
剃须刀片	Personna		Personna 白色双刃剃须刀片包装 100 支
磺溴酞	Sigma-Aldrich	S0252
强力胶	Krazy 胶 Krazy 胶		，全
能 超纯低熔点琼脂糖	Thermo Fisher	16520050
振动切片机	精密	VF 310-0Z
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