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方法文章

利用精密切割肺片研究气道和肺内动脉平滑肌的收缩调节

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DOI：

10.3791/63932

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2022年5月5日

 , 
1Division of Newborn Medicine, Department of Pediatrics, Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School

本文内容

摘要

本方案描述了制备和利用小鼠精密切割肺片以评估气道和肺内动脉平滑肌收缩力的方法，该方法接近体内生理状态 体内 环境

摘要

平滑肌细胞（SMC）通过介导气道和肺内动脉的收缩，分别调节气道阻力和肺循环，在肺系统稳态中发挥关键作用。SMC收缩功能的失调与多种肺部疾病相关，包括哮喘和肺动脉高压。然而，由于组织获取受限以及缺乏能够维持 体内 SMC 表型，这些疾病中 SMC 收缩功能失调的分子机制尚未完全明确。精密切割肺组织切片（PCLS）提供了一种 离体 一种可规避这些技术难题的模型。作为一种活体的薄层肺组织切片，PCLS 能够使平滑肌细胞（SMC）保持在天然微环境中，并允许 原位 平滑肌细胞收缩及细胞内钙离子追踪2+ 调节平滑肌细胞收缩性的信号通路。本文提供了一种详细的小鼠肺切片（PCLS）制备方案，该方案可保留完整的气道和肺内动脉。该方案在对肺叶进行切片前包含两个关键步骤：通过气管向气道灌注低熔点琼脂糖，以及通过右心室向肺血管灌注明胶。采用本方案制备的PCLS可用于生物测定，以评估Ca2+介导气道和肺内动脉区段中平滑肌细胞的收缩调节。当应用于呼吸系统疾病的小鼠模型时，该方案可实现对平滑肌细胞功能的探究，从而揭示疾病中平滑肌细胞收缩功能失调的潜在机制。

引言

平滑肌细胞（SMC）是肺部的主要结构细胞类型，主要位于气道和肺血管的中膜层。平滑肌细胞通过收缩改变管腔直径，从而调节气流和血流1,2因此，平滑肌细胞（SMCs）的收缩调控对于维持肺通气和肺循环的稳态至关重要。相反，SMCs收缩功能异常可引发阻塞性气道或肺血管疾病，如哮喘和肺动脉高压。然而，由于难以获取肺组织，特别是远端肺部的小气道和微血管，肺SMCs的功能评估一直面临挑战。2,3目前的解决方案依赖于间接检测方法，例如通过Flexivent测量气道阻力以反映气道收缩，以及通过右心导管术检测肺动脉血压以评估肺血管收缩。4,5然而，这些间接检测方法存在多种缺点，例如易受结构因素的干扰，且无法反映全肺尺度下气道或血管反应的空间异质性6,7，且不适用于在细胞水平上对收缩调控机制进行研究。因此，可采用分离的原代细胞、气管/支气管肌肉条等替代方法8,9或大段血管10 已应用于SMC研究 体外然而，这些方法也存在局限性。例如，原代平滑肌细胞在培养条件下会迅速发生表型适应11,12 使其难以将细胞培养的研究结果外推至 体内 此外，分离出的近端气道或血管节段中平滑肌细胞的收缩表型可能无法代表远端肺组织中的平滑肌细胞6,7此外，组织水平的肌肉力量测量仍与分子和细胞事件相分离，而这些事件对于深入理解收缩调控机制至关重要。

精密切割肺组织片（PCLS）是一种活体肺组织切片，提供了理想的 离体 用于表征肺部平滑肌细胞的近似工具 体内 微环境（即保持的多细胞结构和相互作用）13自20世纪80年代Placke和Fisher博士首次提出通过琼脂糖膨胀法制备大鼠和仓鼠肺组织切片以来14,15该技术已不断改进，以制备出质量更高、适用性更广的肺切片（PCLS），用于生物医学研究。其中一项重要改进是在使用琼脂糖充气固定肺组织的基础上，通过明胶灌注增强肺动脉的保存效果 通过 气管。因此，在PCLS中，气道和肺动脉均保持完整 离体 评估16此外，PCLS在培养中可长时间保持活性。例如，小鼠PCLS在培养至少12天内，细胞活力和代谢无显著变化，且气道收缩功能可维持长达7天。17此外，PCLS 可保留不同大小的气道或血管，用于收缩和舒张实验。同时，细胞内 Ca2+ 平滑肌细胞（SMCs）收缩性的决定性因素——细胞内钙信号，可通过Ca测定2+ 共聚焦或双光子显微镜成像的报告染料13.

考虑到小鼠模型在肺部研究中的广泛应用，本文详细描述了一种制备保留完整气道和肺内动脉的小鼠肺切片（PCLS）的实验方案，用于 离体 肺部研究。利用制备好的PCLS，我们随后展示了如何评估气道和肺动脉对收缩或舒张刺激的反应。此外，还介绍了将PCLS加载Ca2+ 报告染料，然后对Ca进行成像2+ 还描述了与收缩或舒张反应相关的平滑肌细胞信号传导。

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方案

所有动物护理均遵循麻省总医院机构动物护理和使用委员会的指南。本研究使用8周龄的野生型C57/B6雄性小鼠。

1. 实验准备

  1. 配制工作液。
    1. 配制1×汉克斯平衡盐溶液（HBSS，含Ca2+和Mg2+，并用20 mM HEPES调节pH，参见材料表）。使用HBSS溶液进行PCLS的制备和处理。在制备PCLS期间，将HBSS溶液置于冰上保持低温。
  2. 通过向杜氏改良伊格尔培养基与F-12（DMEM-F12）中添加抗生素-抗真菌剂（体积比1:100，参见材料表），配制PCLS的培养基。
  3. 配制1.5%琼脂糖溶液和6%明胶溶液。
    1. 分别将低熔点（LMP）琼脂糖或明胶粉末（参见材料表）与HBSS溶液混合于15 mL无菌离心管中（若溶液体积>10 mL，则使用50 mL离心管），配制成终浓度为1.5%和6%的溶液。
      注：琼脂糖溶液总体积 = 每只小鼠5 mL × 小鼠数量；明胶溶液总体积 = 每只小鼠2 mL × 小鼠数量。
    2. 将溶液管置于沸水中加热，直至粉末完全溶解。将琼脂糖和明胶溶液均置于42 °C水浴中保温。
      注：在解剖台处使用加热灯有助于维持操作环境温度，防止琼脂糖溶液在注入小鼠肺组织前发生凝固。
  4. 将所有解剖器械，包括一把解剖剪、两把弯头显微解剖镊、一把止血钳，完全浸入70%乙醇溶液中至少20分钟，以进行消毒。
  5. 准备好振动切片机（参见材料表），用于将肺组织切成薄片。
  6. 准备一台配备CCD相机的倒置相差显微镜，用于评估气道或血管的收缩反应；同时准备一台定制的激光扫描共聚焦显微镜（参见材料表），用于检测肺平滑肌细胞（SMCs）中的Ca2+信号18。

2. 小鼠肺组织的琼脂糖-明胶溶液灌注膨胀

  1. 处死小鼠。
    1. 将小鼠放入一个约 750 cm3 的塑料舱内，使用 5% 异氟烷麻醉。持续暴露小鼠至其呼吸停止至少 1 分钟。
      注意：也可采用其他主要安乐死方法作为吸入式异氟烷的替代方案，例如腹腔注射氯胺酮（240 mg/kg）和赛拉嗪（32 mg/kg）19，或戊巴比妥钠（0.3 mL）20。
    2. 将小鼠尸体仰卧位固定于解剖板上，用 25 G 注射器针头固定尾部、前肢和头部，并用 70% 乙醇喷雾对尸体进行消毒。
    3. 使用手术剪沿腹部正中线剪开腹腔（切口长约 2 cm，宽约 2 cm），随后剪断腹主动脉以排空血液。
  2. 按照以下步骤膨胀肺叶。
    1. 沿胸骨及膈肌上方双侧下肋骨小心切开胸腔，观察胸腔打开后肺叶塌陷的情况。
    2. 去除部分双侧腹侧肋骨，以暴露心脏。操作时应将剪刀尖端远离肺组织，避免损伤肺部。
    3. 使用镊子分离小鼠颈部的胸腺及软组织，暴露气管。
    4. 在气管上端剪一个直径约 1.2 mm 的小孔，以便插入 20 G Y 型静脉留置针的针头（参见 材料表）。
    5. 将 Y 型留置针的一个接口连接预先装有 0.5 mL 空气的 3 mL 注射器，另一个接口连接预先装有 2 mL 温热的 1.5% 琼脂糖溶液（42 °C）的 3 mL 注射器。
    6. 先注入琼脂糖溶液以充满留置针管路，然后将留置针插入预先切开的气管开口中，插入深度为 5–8 mm。
    7. 以约 1 mL/5 秒的速度缓慢注入琼脂糖溶液，肺组织将沿近端至远端方向逐渐扩张。当各肺叶边缘充分膨胀时停止注射。
      注意：切勿过度充胀肺组织，以免造成破裂。年轻成年小鼠全肺膨胀所需琼脂糖溶液体积约为 1.3 ± 0.1 mL。
    8. 从另一注射器注入 0.2–0.3 mL 空气，推动留置针及传导气道中残留的琼脂糖进入远端肺泡腔。
    9. 使用一对弯止血钳夹闭气管（参见 材料表）。
  3. 灌注肺血管系统。
    1. 用 1 mL 注射器吸取温热的 6% 明胶溶液，连接头皮静脉针，先用明胶溶液充满管路，然后将针头穿刺至右心室靠近室壁下部的位置。
    2. 将针头插入右心室约 2–3 mm，并使针尖朝向主肺动脉方向。
    3. 缓慢向右心室及肺动脉血管内注射 0.2 mL 明胶溶液。
      注意：适当的明胶灌注会使肺叶颜色略显苍白。
    4. 注射后保持针头原位 5 分钟，同时将冰冻的 HBSS 溶液倾倒在心脏和肺组织上以降温，随后将连同解剖板的尸体置于 4 °C 冰箱或冰上，共冷却 10 分钟。
    5. 用剪刀将小鼠肺和心脏从周围结缔组织中分离出来，逐个分离肺叶，并将其保存在冰上的 HBSS 溶液中。

3. 将肺叶切成薄片

  1. 用速干胶将肺叶修剪后固定在样本柱顶部，并调整肺叶方向（图1A、B），使切割方向与从肺门至肺表面的大多数气道垂直。
  2. 使用振动切片机和新的薄剃须刀片将肺叶切成150 µm厚的切片。将切片收集至预先加入冷HBSS溶液的100 mm无菌培养皿中。
    注意：开始切片前应设置合适的刀片移动速度和振荡频率。以Compresstom为例，通常设置为速度4级、振荡4级。
  3. 将切片转移至盛有DMEM/F-12培养基的培养皿中（每皿15 mL培养基含20片切片），实验前在37 °C培养箱中孵育过夜。
    注意：小鼠肺切片（PCLSs）在培养中可维持约7天而不丧失气道收缩反应能力17。肺动脉的存活时间尚未充分评估。据我们观察，在DMEM/F12培养基中，其结构完整性和血管反应性至少可维持3天。对于长期保存，可将小鼠PCLSs置于含有10% DMSO的DMEM/F12培养基中（每管1 mL培养基含5片切片），放入装有异丙醇的容器内于-80 °C过夜冷冻，随后转移至液氮中保存数周至数月21。

4. 分析肺内气道和动脉的收缩反应

  1. 将PCLS置于盛有HBSS的24孔培养板中，每孔一个。将PCLS置于孔中央，然后用移液器吸除HBSS溶液。
  2. 在显微镜下找到切片中的目标气道和血管，然后用带有预切中央孔（直径2-3 mm）的尼龙网覆盖切片，以暴露目标区域。
  3. 在网片上方放置一个中空金属垫圈，以固定切片位置（图2A）。
  4. 加入600 μL HBSS溶液浸没PCLS。静置10分钟后，记录气道或血管的基线图像。
  5. 通过移液器小心吸除空白HBSS溶液，加入含激动剂的600 μL HBSS溶液，以诱导气道或血管收缩，例如1 µM乙酰甲胆碱（MCh）或10 nM内皮素（参见材料表）。
    注意：在暴露于乙酰甲胆碱或内皮素之前，无需使用KCl刺激作为工具集标准。在小鼠气道中，100 mM KCl刺激仅引起轻微且不规则的气道收缩（10%-15%）20。同样，无需预先进行乙酰甲胆碱刺激，因为我们已证实相同激动剂（如乙酰甲胆碱或5-羟色胺）在首次和重复暴露时均可引发相似的气道收缩20,22。
  6. 在显微镜下观察反应，直至管腔面积变化达到平衡状态，然后记录气道或血管图像用于分析。
  7. 用移液器吸除MCh或内皮素溶液，加入新的600 µL HBSS溶液，其中含有相同浓度的激动剂和一种舒张剂；观察并记录气道或血管的舒张情况。
  8. 按照以下步骤定量分析气道或血管反应。
    1. 将图像导入由NIH资助的免费软件FIJI中。
    2. 在工具栏中选择多边形选区，在每一帧上勾画气道或血管管腔的轮廓。
    3. 选择分析 > 设置测量 > 面积。
    4. 选择分析 > 测量以量化感兴趣区域的面积。结果将在单独窗口中显示，用于统计分析。

5. 分析气道或血管平滑肌细胞的 Ca2+ 信号传导

  1. 制备 Ca2+ 染料上样缓冲液
    1. 溶解 Ca2+ 染料，Oregon Green 488 BAPTA-1-AM（参见 材料表），50 µg（一支）加入10 µL DMSO。
    2. 溶解0.2 g Pluronic F-127粉末（参见 材料表) 溶于1 mL DMSO中，配制20% Pluronic溶液。
    3. 将10 µL的20% Pluronic溶液与10 µL的Ca2+ 染料-DMSO 溶液
    4. 制备 Ca2+ 通过将20 µL混合物加入含200 µM磺溴酞钠的2 mL HBSS溶液中，制备染料加载缓冲液（参见 材料表).
  2. 将15个鼠类PCLS置于2 mL的Ca2+ 上样缓冲液中孵育，30 °C 条件下孵育 1 小时。随后将组织切片转移至含有 100 µM 磺溴酞的 2 mL HBSS 溶液中，在室温下继续孵育 30 分钟，以完成荧光染料的去酯化反应。
  3. 检测 Ca2+ SMCs 的信号传导。
    1. 放置 Ca2+ 载有染料的切片置于大面积盖玻片上。
    2. 用3 mL注射器吸取高真空硅脂，通过18 G钝针头将硅脂挤出，在盖玻片上沿组织切片的上方和下方各绘制一条平行线。
    3. 用尼龙网置于两条油脂线之间覆盖切片。将第二块盖玻片放在网膜上方，形成一个两侧由油脂密封的腔室（图3A).
      注意：尼龙网对于使切片附着在底部盖玻片上至关重要，从而确保其位于高倍倒置物镜（如40倍油镜）的工作距离范围内。
    4. 从一端通过手动移液将 HBSS 或激动剂溶液加入腔室 通过 灌流系统。对于持续液体灌流的情况，通过另一端用滤纸吸除或抽真空的方式从灌流室中移除液体。
    5. 将PCLS培养皿置于显微镜载物台上。检测Ca2+ SMC 信号传导23 使用自行搭建的共振扫描共聚焦显微镜，激光扫描速率为15或30帧/秒。
      注意：也可使用目前广泛可得的商用高速激光扫描共聚焦显微镜进行Ca2+ 肺部平滑肌细胞在PCLS中的信号传导检测
  4. 定量测定 Ca2+ 平滑肌细胞中的荧光
    1. 将记录的图像序列加载到 FIJI 中并选择 图像 > 类型 > 8位灰度.
    2. 选择 矩形选择 在工具栏中定义一个5像素 × 5像素的感兴趣区域（ROI），位于平滑肌细胞内。
    3. 选择 分析 > 设置测量参数 > 平均灰度 值，代表 Ca2+ 荧光强度
    4. 如果 ROI 的位置随 SMC 收缩而变化，请选择 分析 > 测量 Ca2+ 逐帧荧光强度
    5. 如果SMC的ROI在一系列图像中的位置保持相似，请选择 图像 > 堆叠 > 测量 Ca的堆栈2+ 荧光强度
      注意：可插入自定义编写的宏程序，用于在图像序列中追踪随收缩而移动的感兴趣区域（ROI），并在平滑肌细胞（SMC）中自动测量 Ca2+ 逐帧测量感兴趣区域（ROI）的强度（灰度值）。

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结果

保留完整肺内气道和动脉的小鼠肺切片制备
在倒置相差显微镜下观察到厚度为150 µm的肺切片。在小鼠肺脏中，传导性气道伴随肺内动脉，从肺门延伸至外周肺组织。图2B展示了小鼠肺切片中一个典型的肺气道-动脉束。气道可通过管腔内表面排列的立方上皮细胞及其活跃的纤毛摆动轻易识别。相比之下，邻近的肺动脉则以扁平的内皮细胞为特征。当到达外周肺区时，传导性气道分支为呼吸性细支气管和肺泡囊，环绕着小叶内小动脉（图2C）。

利用小鼠肺切片（PCLS）评估肺气道和动脉收缩
甲基胆碱（MCh，1 µM）诱导的气道收缩如图2B所示。气道收缩反应通过MCh刺激后管腔面积减少的百分比进行量化（图2D）。相比之下，肺动脉对MCh刺激无反应（图2B

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讨论

PCLS 的制备包含若干关键步骤。首先，必须均匀地充胀肺叶，以避免因琼脂糖分布不均导致组织硬度差异。由于液态琼脂糖在低于 37 °C 时会在细小导管或气道中迅速凝胶化，远端肺区可能出现填充缺陷，从而增加肺组织硬度的不均一性，并在振动切片过程中引起组织撕裂。因此，建议将低熔点琼脂糖溶液置于 42 °C 水浴中保温，并在解剖台处使用加热灯，以防止琼脂糖过快凝胶。快速注射会将更多琼脂糖推入顺应性较高的肺实质区域，应予以避免；手动注射琼脂糖通常需持续约 5–7 秒。其次，在完成琼脂糖灌注后，需推动少量空气（约 0.2 mL）将琼脂糖从传导性气道驱入远端肺泡腔，此步骤必不可少。否则，琼脂糖将在管腔内凝胶并滞留，阻碍气道收缩。还需注意，肺泡内凝胶化的琼脂糖会稳定存留，在 37 °C 培养箱中不会再次融化。琼脂糖凝胶在维持肺组织三维结构方面发挥着关键作用 体内 由胸腔内负压维持。第三，用明胶溶液灌注肺动脉对于保持PCLS中动脉管腔的开放至关重要。明胶溶液在室温下凝固，作为机械阻断物，可抵抗组织切片过程中化学和物理刺激引起的血管收缩。若未进行明胶灌注，即使存在高剂量的混合血管扩张剂（包括酚妥拉明、肾上腺素和硝苯地平），肺切片中的肺动脉...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助编号为 K08135443（Y.B）和 1R01HL132991（X.A）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1 mL 注射器BD309626
15 mL 无菌离心管Celltreat229411
3 mL 注射器BD309585
50 mL 无菌离心管Celltreat229422
乙酰-β-甲基胆碱Millipore Sigma62-51-1
抗生素-抗真菌剂Thermo Fisher15240-062
CCD 相机NikonNikon Ds-Ri2 相机
盖玻片Fisher Scientific12-548-5CP; 12-548-5PP
冻存管Fisher Scientific430488
定制激光扫描共聚焦显微镜详见参考文献18
DMEM/F12 培养基Fisher ScientificMT-10-092-CM
内皮素1Millipore SigmaE7764
精细解剖剪Fisher ScientificNC9702861
冷冻容器Sigma-AldrichC1562
猪皮明胶Sigma-Aldrich9000-70-8
汉克斯平衡盐溶液（HBSS）Thermo Fisher14025092
止血钳Fisher Scientific16-100-117
HEPESThermo Fisher15630080
高真空硅脂Fisher Scientific146355d
异丙醇Sigma-AldrichW292907-1KG-K
金属垫圈Home Depot Product Authority800442Everbilt 平垫圈 #10
显微解剖镊Sigma-AldrichF4142
头皮静脉针套件（25 G）EXELINT26708
NOC-5Cayman Chemical16534
尼龙网筛Component SupplyU-CMN-300
Oregon Green 488 BAPTA-1 AMLife Technologieso-6807
相差显微镜NikonNikon Eclipse TS 100
Pluronic F-127Thermo FisherP-6867
剃须刀片PersonnaPersonna 双刃剃须刀片，白色包装，100片装
磺溴酞Sigma-AldrichS0252
超级胶水Krazy GlueKrazy Glue 多用途胶水
超纯低熔点琼脂糖Thermo Fisher16520050
振动切片机PrecisionaryVF 310-0Z
振动切片机冷却块PrecisionarySKU-VM-CB12.5-NC
振动切片机样本管PrecisionarySKU VF-SPS-VM-12.5-NC
Y型静脉导管BD383336BD Saf-T-Intima 封闭式静脉导管

参考文献

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