一种用于从介观到微观尺度神经元成像的组织透明化方法

摘要

本方案提供了一种利用组织透明化方法ScaleSF对脑切片进行神经元成像的详细操作流程。该方案包括脑组织制备、组织透明化处理、透明化切片的操作以及从介观到微观水平对神经元结构进行共聚焦激光扫描显微镜成像。

摘要

本文提供了一种详细的实验方案，用于在脑组织中从介观到微观水平可视化神经元结构。利用经ScaleSF光学透明化处理的小鼠脑切片，可实现从神经环路至亚细胞级神经元结构的成像。该透明化方法是ScaleS的改进版本，是一种适用于组织切片的亲水性透明化技术，兼具高效的透明能力以及对荧光信号和结构完整性的高度保留。本研究设计了一种可定制的三维（3D）打印成像腔室，用于稳定固定透明化后的脑组织。将携带增强型绿色荧光蛋白基因的腺相关病毒载体注射至小鼠脑内后，使用4%多聚甲醛固定脑组织，并用振动式组织切片机切成1 mm厚的脑片。脑切片按照透明化方案依次浸入三种溶液中孵育，分别为ScaleS0溶液、磷酸盐缓冲液（–）和ScaleS4溶液，总时长为10.5–14.5小时。透明化后的脑切片被固定于成像腔室内，并包埋于溶解在ScaleS4D25(0)溶液中的1.5%琼脂糖凝胶中。使用配备长工作距离多浸润物镜的共聚焦激光扫描显微镜进行切片的三维图像采集。从介观神经元成像开始，我们成功在光学透明化的脑切片中观察到了树突棘和轴突终扣等精细的亚细胞神经元结构。该实验方案将有助于在神经环路至亚细胞组分尺度上深入理解神经元结构。

引言

组织透明化方法已显著改善了生物和临床样本在光学显微镜下的深度无关成像，使得能够从完整组织中提取结构信息^1,2。光学透明化技术还可能加快组织学分析速度，并降低其成本。目前主要有三种透明化方法：亲水性、疏水性和基于水凝胶的方法^1,2。其中，亲水性方法在保持荧光信号和组织完整性方面表现更优，且相较于其他两种方法毒性更低^3,4。

一种亲水性透明化方法 ScaleS 因其在保持组织结构和分子完整性的同时具备强大的透明化能力（透明-保存光谱）而具有独特地位⁵。在之前的研究中，我们通过改进 ScaleS 的透明化流程，开发了一种快速且等距的组织切片（约 1 mm 厚度）透明化方案 ScaleSF⁶。该透明化方案需将脑切片依次在三种溶液中孵育 10.5–14.5 小时。该方法具有很高的透明-保存光谱，甚至可兼容电子显微镜（EM）分析（补充图 1），从而实现多尺度、高分辨率的三维（3D）成像，并实现信号的精确重建⁶。因此，ScaleSF 特别适用于脑组织，其中神经元细胞具有高度复杂的长程突起，并形成用于传递和接收信息的特化精细亚细胞结构。获取从神经环路到亚细胞水平的神经元结构信息，对于深入理解脑功能具有重要意义。

本文提供了一种使用ScaleSF技术对神经元结构进行成像的详细方案，成像尺度涵盖介观/环路水平至微观/亚细胞水平。该方案包括组织制备、组织透明化处理、透明化组织的操作以及对透明化组织进行共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）成像。本方案重点在于从神经环路到亚细胞组分尺度上解析神经元结构。有关溶液配制以及将腺相关病毒（AAV）载体立体定位注射至小鼠脑内的详细操作步骤，请分别参考Miyawaki等（2016）⁷和Okamoto等（2021）⁸。

方案

所有实验均经顺天堂大学机构动物护理和使用委员会批准（批准号：2021245、2021246），并依照日本科学理事会《动物实验正确实施的基本指南》（2006年）进行。本研究使用了雄性C57BL/6J小鼠，该小鼠注射了携带增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因的AAV载体，以及副肌球蛋白（PV）/肉豆蔻酰化-EGFP-低密度脂蛋白受体C末端细菌人工染色体（BAC）转基因小鼠（PV-FGL小鼠）⁹。PV-FGL小鼠维持在C57BL/6J遗传背景中。本研究未发现与性别相关的差异。

1. 组织准备

1. 灌注固定
   注意：步骤 1.1.1 至 1.1.3 需在通风橱中进行，以减少接触多聚甲醛（PFA）。
   1. 通过腹腔注射过量戊巴比妥钠（200 mg/kg）对成年雄性小鼠（8–16 周龄）进行麻醉。通过脚趾夹捏回缩反射和眨眼反射消失确认麻醉充分。
   2. 打开胸腔，用手术剪剪开右心耳。使用连接 20 mL 注射器的 23 G 针头，先以 20 mL 冰冷磷酸盐缓冲液（PBS）对小鼠进行灌注，随后使用另一支 20 mL 注射器灌注 20 mL 冰冷的含 4% PFA 的 0.1 M 磷酸盐缓冲液（PB）。
      警告：PFA 具有毒性和致畸性。避免吸入或接触皮肤、眼睛及黏膜。
   3. 用镊子将脑组织从颅骨中取出。将脑组织转移至含有 0.1 M PB 中 4% PFA 的 15 mL 离心管中，避光保存，并在 4 °C 下以 50–100 rpm 轻柔振荡过夜。
   4. 注意：收获的脑组织可在含 0.02% 叠氮化钠（NaN₃）的 PBS 中于 4 °C 保存数周。
      警告：NaN₃ 具有毒性。避免吸入或接触皮肤、眼睛及黏膜。操作时应在通风橱内进行。
2. 脑切片制备
   1. 通过将 2 g 琼脂加入 50 mL PBS 中配制 4% 琼脂溶液。微波加热至琼脂完全溶解。让溶液冷却至 40–45 °C。
      注意：琼脂中的主要成分琼脂糖胶赋予溶液黏性，有助于组织切片的切割。
   2. 将 10 mL 琼脂溶液加入 6 孔细胞培养板中。用镊子将脑组织浸入琼脂溶液中。置于冰上使琼脂凝固。
   3. 从孔板中取出包埋好的脑组织，用剃刀片修整琼脂块。用速干胶将琼脂块固定在振动切片机浴槽底部，并在缓冲液槽中加入 0.1 M PB。
   4. 使用浸有乙醇的无绒纸巾清洁另一片剃刀片，并将其安装至振动切片机的刀片夹持器上。
   5. 设置切片速度为 0.14 mm/s，振幅为 1.4 mm，频率为 75–77 Hz。将脑组织切成 1 mm 厚的切片，并将切片收集至含有 PBS 的 6 孔细胞培养板中。
      注意：脑切片可在含 0.02% NaN₃ 的 PBS 中于 4 °C 保存数周。

2. 组织透明化

注意：Sca的组成l所使用的 eS 溶液列于下文 表1样品应用锡箔包裹以避免光照。透明化步骤如图所示。 图1A.

1. 向6孔细胞培养板的一个孔中加入8 mL ScaleS0溶液，向另一孔中加入8 mL ScaleS4溶液，并在培养箱中预热至37 °C。
2. 用刮勺将脑片转移至预热的ScaleS0溶液中，在37 °C、90 rpm的振荡培养箱中孵育2小时。
3. 用刮勺将通透处理后的脑片转移至含有8 mL PBS(–)的6孔细胞培养板中，在40–60 rpm的水平摇床中洗涤15分钟，重复此步骤两次。
4. 用刮勺将脑片转移至预热的8 mL ScaleS4溶液中，在37 °C、90 rpm的振荡培养箱中孵育8–12小时以实现透明化。透明化后的脑片如图1所示。

3. 脑切片的制备

注意：使用可定制的成像腔室以稳定固定透明化脑切片（图2）⁶。该腔室由腔室框架和底部盖玻片组成。显微镜载物台适配器也经过设计，可将成像腔室直接安装在显微镜载物台上（图2A、B）。腔室框架和显微镜载物台适配器可通过内部或外包的3D打印服务进行3D打印。成像腔室的3D计算机辅助设计（CAD）数据已在Furuta等2022年研究中提供⁶。

1. 进行腔室准备时，使用压敏胶将腔室框架固定在盖玻片上。
2. 通过将1.5 g琼脂糖加入100 mL ScaleS4D25(0)溶液（ScaleS4凝胶）中，制备1.5%琼脂糖溶液。充分搅拌混合后，微波加热至琼脂糖完全溶解。完成后，使溶液冷却至37 °C。
3. 用刮铲将透明化处理后的脑片转移至成像腔室的底部盖玻片上，并用洁净无绒纸巾擦去脑片表面多余的溶液。
4. 使用移液器将ScaleS4凝胶滴加至脑片上，填充成像腔室。用镊子将另一片盖玻片覆盖在上方，随后依次放置一片无绒纸巾和一块载玻片。
5. 将成像腔室转移至4 °C冰箱中，在载玻片上放置金属重物，静置30分钟。
6. 从成像腔室上移除金属重物、载玻片、无绒纸巾和顶部盖玻片，并擦去多余的凝胶（图2A,B）。
7. 将成像腔室放入60 mm玻璃培养皿中，并使用类似橡皮泥的压敏胶将腔室边缘固定在培养皿上，需在多个位置进行固定。
8. 向培养皿中加入ScaleS4溶液，在20–25 °C下以40–60 rpm在旋转摇床上轻轻振荡1小时。更换新鲜溶液，并用200 µL移液器吸头轻轻刮除凝胶表面的气泡。将浸没在溶液中的成像腔室安装至显微镜载物台上（图2C）。

4. 共聚焦激光扫描显微成像

1. 使用配备长工作距离（WD）多介质物镜（16倍/0.60 数值孔径 [NA]，WD = 2.5 mm）的共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）采集图像。
   注意：高数值孔径（NA）物镜可提供高衍射极限分辨率。
2. 开启所有相关成像设备（工作站、显微镜、扫描仪、激光器和汞灯），并启动CLSM成像软件。
3. 将多介质物镜的校正环设置为1.47。ScaleS4溶液的折射率（RI）约为1.47^5,7。折射率不匹配引起的像差会影响图像形成（图3）。
4. 将物镜浸入溶液中，并缓慢接近组织切片。清除物镜前端附着的任何气泡。使用落射荧光在透明化组织中寻找感兴趣区域（ROIs）。
5. 通过测试合适的设置来确定图像采集参数。
   1. 确定图像采集的位深。图像的数据量随位深增加而增大。
   2. 设置 检测波长。根据发射光谱调整探测器的合适门控范围。确保检测波长不包含任何激光谱线。
   3. 设置xy分辨率。较大的图像格式可提供更优的xy分辨率，但采集图像所需时间更长。
   4. 设置扫描速度。较慢的扫描速度可提供较高的信噪比，但也会增加像素驻留时间及光漂白风险。应根据需要进行选择。
   5. 调节针孔大小。针孔大小控制光学切片厚度。较小的针孔产生更薄的光学切片，从而获得更优的z分辨率，但会降低荧光信号强度；增大针孔可获得更厚的光学切片和更强的荧光信号。
   6. 设置激光功率、探测器/放大器增益和偏移量。逐步增加激光功率和探测器/放大器增益，直至获得合适的图像。过高的激光功率可能导致光漂白。适当调节偏移量（对比度），以获得高信噪比。
   7. 根据感兴趣区域（ROI）的大小确定所需的拼接范围。确保完整覆盖ROI的全长和全宽。
   8. 在各个平面上导航透明化组织，设定图像堆栈的起始点和终止点。根据所需的z分辨率设置z轴步进大小。
6. 在对图像采集参数满意后开始采集图像，并保存所获取的图像。使用图像分析软件对图像进行处理。

结果

采用本方案实现了厚度为1 mm的小鼠脑片的光学透明化。图1B展示了小鼠脑片在透明化处理前后的透射图像。该组织透明化方法使1 mm厚的小鼠脑片变得透明。在透明化溶液中孵育12小时后，脑片的最终尺寸略有扩大（线性膨胀率为102.5% ± 1.3%）。通过PV-FGL小鼠中血浆膜上特异性表达的EGFP评估了组织中荧光信号和结构完整性的保留情况（图1C）。在这些小鼠中，体树突膜靶向的EGFP在PV阳性神经元中表达⁹。经透明化处理后，体树突区域血浆膜上靶向表达的EGFP信号得以保留（图1C）。此外，先前的电镜研究表明，经ScaleSF透明化处理的小鼠脑组织结构完整性保持良好（补充图1）⁶。

折射率不匹配引起的像差导致图像亮度和分辨率明显下降（图3）。将一片厚度为...

讨论

实验方案中的关键步骤
本实验方案中有若干关键步骤必须格外谨慎地操作，以获得有意义的结果。在大规模组织中进行三维成像时，样本的均匀固定至关重要。物镜、样本和浸没液的折射率（RI）必须匹配。若三者之间存在折射率不匹配，将导致在透明化脑切片中对表达EGFP的细胞成像时出现严重干扰（图3）。通过调节物镜的校正环以匹配浸没液的折射率，可最大限度减少由深度引起的球面像差，从而在三维成像中提升信号强度、对比度和空间分辨率。所配制溶液的折射率可使用折射仪进行测量。

技术故障排除
溶液储存时间过长可能影响其透明化能力，以及荧光信号和结构完整性的保持能力。应使用新鲜配制的溶液。这些溶液可在 4 °C 下保存最多 1 个月。等距性对于实现高效、有效的神经元成像及准确的信号重建至关重要。尽管在孵育 12 小时后观察到样本尺寸略有扩张（图 1B），但通过将孵育时间控制在 8–12 小时之间，可有效控制该扩张现象。为了获得更精...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
16倍多介质物镜	Leica Microsystems	HC FLUOTAR 16x/0.60 IMM CORR VISIR
琼脂	Nacalai Tesque	01028-85
琼脂糖	TaKaRa Bio	L03
二甲基亚砜	Nacalai Tesque	13407-45
D-山梨醇	Nacalai Tesque	06286-55
γ-环糊精	Wako Pure Chemical Industries	037-10643
甘油	Sigma-Aldrich	G9012
Huygens Essential	Scientific Volume Imaging	ver. 18.10.0p8/21.10.1p0 64b
Imaris	Bitplane	ver. 9.0.0
Leica 应用套件 X	Leica Microsystems	LAS X, ver. 3.5.5.19976
甲基-β-环糊精	Tokyo Chemical Industry	M1356
多聚甲醛	Merck Millipore	1.04005.1000
磷酸盐缓冲液 (10倍; pH 7.4)	Nacalai Tesque	27575-31	10倍 PBS(–)
叠氮化钠	Nacalai Tesque	31233-55
戊巴比妥钠	Kyoritsu Seiyaku	N/A
TCS SP8	Leica Microsystems	N/A
吐温 X-100	Nacalai Tesque	35501-15
尿素	Nacalai Tesque	35940-65
振动组织切片机	Dosaka EM	PRO7N