本方案提供了一种利用组织透明化方法ScaleSF对脑切片进行神经元成像的详细操作流程。该方案包括脑组织制备、组织透明化处理、透明化切片的操作以及从介观到微观水平对神经元结构进行共聚焦激光扫描显微镜成像。
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本文内容
摘要
摘要
本文提供了一种详细的实验方案，用于在脑组织中从介观到微观水平可视化神经元结构。利用经ScaleSF光学透明化处理的小鼠脑切片，可实现从神经环路至亚细胞级神经元结构的成像。该透明化方法是ScaleS的改进版本，是一种适用于组织切片的亲水性透明化技术，兼具高效的透明能力以及对荧光信号和结构完整性的高度保留。本研究设计了一种可定制的三维（3D）打印成像腔室，用于稳定固定透明化后的脑组织。将携带增强型绿色荧光蛋白基因的腺相关病毒载体注射至小鼠脑内后，使用4%多聚甲醛固定脑组织，并用振动式组织切片机切成1 mm厚的脑片。脑切片按照透明化方案依次浸入三种溶液中孵育，分别为ScaleS0溶液、磷酸盐缓冲液（–）和ScaleS4溶液，总时长为10.5–14.5小时。透明化后的脑切片被固定于成像腔室内，并包埋于溶解在ScaleS4D25(0)溶液中的1.5%琼脂糖凝胶中。使用配备长工作距离多浸润物镜的共聚焦激光扫描显微镜进行切片的三维图像采集。从介观神经元成像开始，我们成功在光学透明化的脑切片中观察到了树突棘和轴突终扣等精细的亚细胞神经元结构。该实验方案将有助于在神经环路至亚细胞组分尺度上深入理解神经元结构。
引言
组织透明化方法已显著改善了生物和临床样本在光学显微镜下的深度无关成像，使得能够从完整组织中提取结构信息1,2。光学透明化技术还可能加快组织学分析速度，并降低其成本。目前主要有三种透明化方法：亲水性、疏水性和基于水凝胶的方法1,2。其中，亲水性方法在保持荧光信号和组织完整性方面表现更优，且相较于其他两种方法毒性更低3,4。
一种亲水性透明化方法 ScaleS 因其在保持组织结构和分子完整性的同时具备强大的透明化能力（透明-保存光谱）而具有独特地位5。在之前的研究中，我们通过改进 ScaleS 的透明化流程，开发了一种快速且等距的组织切片（约 1 mm 厚度）透明化方案 ScaleSF6。该透明化方案需将脑切片依次在三种溶液中孵育 10.5–14.5 小时。该方法具有很高的透明-保存光谱，甚至可兼容电子显微镜（EM）分析（补充图 1），从而实现多尺度、....
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方案
所有实验均经顺天堂大学机构动物护理和使用委员会批准（批准号：2021245、2021246），并依照日本科学理事会《动物实验正确实施的基本指南》（2006年）进行。本研究使用了雄性C57BL/6J小鼠，该小鼠注射了携带增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因的AAV载体，以及副肌球蛋白（PV）/肉豆蔻酰化-EGFP-低密度脂蛋白受体C末端细菌人工染色体（BAC）转基因小鼠（PV-FGL小鼠）9。PV-FGL小鼠维持在C57BL/6J遗传背景中。本研究未发现与性别相关的差异。
1. 组织准备
- 灌注固定
注意：步骤 1.1.1 至 1.1.3 需在通风橱中进行，以减少接触多聚甲醛（PFA）。- 通过腹腔注射过量戊巴比妥钠（200 mg/kg）对成年雄性小鼠（8–16 周龄）进行麻醉。通过脚趾夹捏回缩反射和眨眼反射消失确认麻醉充分。
- 打开胸腔，用手术剪剪开右心耳。使用连接 20 mL 注射器的 23 G 针头，先以 20 mL 冰冷磷酸盐缓冲液（PBS）对小鼠进行灌注，随后使用另一支 20 mL 注射器灌注 20 mL 冰冷的含 4% PFA 的 0.1 M 磷酸盐缓冲液（PB）。
警告：PFA 具有毒性和致畸性。避免吸入或接触皮肤、眼睛及黏膜。 - 用镊子将脑组织从颅骨中取出。将脑组织转移至....
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结果
采用本方案实现了1 mm厚小鼠脑切片的光学透明化。图1B展示了小鼠脑切片在透明化处理前后的透射图像。该组织透明化方法使1 mm厚的小鼠脑切片变为透明。在透明化溶液中孵育12小时后，脑切片的最终尺寸略有扩大（线性膨胀率为102.5% ± 1.3%）。通过PV-FGL小鼠中血浆膜上靶向表达的EGFP评估了组织中荧光信号和结构完整性的保留情况（图1C）。在这些小鼠中，体树突膜靶向的EGFP在PV阳性神经元中表达9。经透明化处理后，体树突区域血浆膜上靶向的EGFP表达得以保留（图1C）。此外，先前的电镜研究表明，经ScaleSF透明化处理的脑组织结构完整性保持良好（补充图1）6。
折射率不匹配引起的像差导致图像亮度和分辨率明显下降（图3）。将一片厚度为1 mm.......
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讨论
实验方案中的关键步骤
本实验方案中有若干关键步骤必须格外谨慎地操作，以获得有意义的结果。在大规模组织中进行三维成像时，样本的均匀固定至关重要。物镜、样本和浸没液的折射率（RI）必须匹配。若三者之间存在折射率不匹配，将导致在透明化脑切片中对表达EGFP的细胞成像时出现严重干扰（图3）。通过调节物镜的校正环以匹配浸没液的折射率，可最大限度减少由深度引起的球面像差，从而在三维成像中提升信号强度、对比度和空间分辨率。所配制溶液的折射率可使用折射仪进行测量。
技术故障排除
溶液储存时间过长可能影响其透明化能力，以及荧光信号和结构完整性的保持能力。应使用新鲜配制的溶液。这些溶液可在 4 °C 下保存最多 1 个月。等距性对于实现高效、有效的神经元成像及准确的信号重建至关重要。尽管在孵育 12 小时后观察到样本尺寸略有扩张（图 1B），但通过将孵育时间控制在 8–12 小时之间，可有效控制该扩张现象。为了获得更精.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢顺天堂大学的 Yoko Ishida 提供腺相关病毒载体的制备，以及顺天堂大学的 Kisara Hoshino 提供的技术支持。本研究得到了日本学术振兴会科研费（JSPS KAKENHI，项目号 JP20K07231 至 K.Y.；JP21H03529 至 T.F.；JP20K07743 至 M.K.；JP21H02592 至 H.H.）以及创新领域研究“共振生物”（JP18H04743 至 H.H.）的资助。本研究还获得了日本医学研究开发机构（AMED）（项目号 JP21dm0207112 至 T.F. 和 H.H.）、日本科学技术振兴机构（JST）的登月型研发计划（Moonshot R&D，项目号 JPMJMS2024 至 H.H.）、JST 融合导向颠覆性科学技术研究计划（FOREST，项目号 JPMJFR204D 至 H.H.）、顺天堂大学医学院老年病研究所研究助成金（X2016 至 K.Y.；X2001 至 H.H.）以及私立大学品牌化项目的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 16倍多介质物镜 | Leica Microsystems | HC FLUOTAR 16x/0.60 IMM CORR VISIR | |
| 琼脂 | Nacalai Tesque | 01028-85 | |
| 琼脂糖 | TaKaRa Bio | L03 | |
| 二甲基亚砜 | Nacalai Tesque | 13407-45 | |
| D-山梨醇 | Nacalai Tesque | 06286-55 | |
| γ-环糊精 | Wako Pure Chemical Industries | 037-10643 | |
| 甘油 | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Huygens Essential | Scientific Volume Imaging | ver. 18.10.0p8/21.10.1p0 64b | |
| Imaris | Bitplane | ver. 9.0.0 | |
| Leica 应用套件 X | Leica Microsystems | LAS X, ver. 3.5.5.19976 | |
| 甲基-β-环糊精 | Tokyo Chemical Industry | M1356 | |
| 多聚甲醛 | Merck Millipore | 1.04005.1000 | |
| 磷酸盐缓冲液 (10倍; pH 7.4) | Nacalai Tesque | 27575-31 | 10倍 PBS(–) |
| 叠氮化钠 | Nacalai Tesque | 31233-55 | |
| 戊巴比妥钠 | Kyoritsu Seiyaku | N/A | |
| TCS SP8 | Leica Microsystems | N/A | |
| 吐温 X-100 | Nacalai Tesque | 35501-15 | |
| 尿素 | Nacalai Tesque | 35940-65 | |
| 振动组织切片机 | Dosaka EM | PRO7N |
参考文献
- Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: Toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).
- Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R.
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重印与许可
