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方法文章

供体心脏功能评估 离体 灌注：来自压力-容积环与表面超声心动图的见解

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DOI：

10.3791/63945

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2022年10月11日

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Preclinical Research, Department of Research and Innovation, Groupe Hospitalier Paris Saint Joseph, 2Inserm UMR S 999, Pulmonary Hypertension: Pathophysiology and Novel Therapies, Marie Lannelongue Hospital, Groupe Hospitalier Paris Saint Joseph, 3Department of Cardiac Surgery, Marie Lannelongue Hospital

本文内容

摘要

一种在常温下对供体心脏进行功能评估的可靠非侵入性方法 离体 心脏灌注（NESP）的研究尚不充分。本文描述了一种NESP的实验方案 离体 使用心外膜超声心动图和导纳导管法评估心肌功能

摘要

心脏移植仍是治疗晚期心力衰竭的金标准。然而，目前器官供体严重短缺，导致越来越多具有扩展标准的供体心脏被分配用于临床。这些边缘供心发生原发性移植物功能衰竭的风险较高，可能受益于移植前的离体灌注（ex situ perfusion）。该技术通过温氧合血持续灌注并结合连续代谢监测，实现器官的延长保存。目前临床唯一可用的非搏动性灌注（NESP）设备以无负荷非工作状态灌注器官，无法对跳动的心脏进行功能评估。因此，我们开发了一种新型的NESP工作模式平台，可调节左心室前负荷和后负荷。该方案应用于猪心脏模型。ex situ 心脏功能评估通过心腔内导纳导管术和体表超声心动图实现。本文在描述实验方案的同时，报告了主要研究结果，以及在NESP期间获取压力-容积环和心肌功率时的关键要点与潜在问题。血流动力学指标与超声参数之间的相关性尤为重要，尤其对于移植前供心的进一步功能评估与康复具有重要意义。本方案旨在改进供体心脏的评估方法，以扩大供体池并降低原发性移植物功能衰竭的发生率。

引言

心脏移植是治疗晚期心力衰竭的金标准，但受限于目前器官供体的短缺1。越来越多具有扩展标准的供体心脏（年龄 >45岁、存在心血管危险因素、长时间低灌注、因儿茶酚胺风暴继发的急性左心室功能障碍）被分配用于移植，但其发生原发性移植物功能衰竭的风险增加2。此外，经控制性循环死亡（DCD）后捐献的心脏可能因长时间的温缺血而出现心肌损伤3。因此，在移植前对这些供体心脏进行更准确的评估十分必要，尤其是评估其是否适合进行心脏移植4,5。

常温 离体 灌注（NESP）利用温氧合血来维持心脏跳动。目前唯一 commercially available 的 NESP 设备以非工作状态（Langendorff 模式）保存心脏。该方法最初应用于将移植物的保存时间延长至超过冷缺血的关键 4 小时期限6该技术的另一主要优势在于，可根据灌注液中的乳酸浓度对心肌存活性进行连续评估。6然而，迄今为止，这种生化评估尚未与移植后的预后结果相关联。同样，非搏动性灌注（NESP）中的兰根多夫（Langendorff）模式无法在移植前对心脏进行血流动力学和功能评估。一些研究人员已报道，在NESP期间进行心内导管插入术可能有助于预测移植后心肌功能的恢复情况。7.

本报告旨在提供一种可重复的方法，用于评估心脏在NESP期间的供体心脏功能。我们对灌注回路进行了改进，以实现工作模式灌注，从而可通过心外膜超声心动图无创获取功能参数。通过压力-应变环记录心肌做功指数这一负荷无关的指标。我们探讨了心肌做功与通过心腔内导纳导管技术获得的血流动力学参数之间的关系。

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方案

本方案已获得当地动物实验伦理委员会和机构动物福利委员会批准（APAFIS#30483-2021031811339219 v1，法国巴黎萨克雷大学动物伦理委员会）。动物的饲养和使用遵循美国国立卫生研究院制定的《实验动物护理与使用指南》以及美国医学研究学会制定的《实验动物护理原则》。

注意：手术操作在严格无菌条件下进行，采用与人类手术相同的技术。实验操作包括使用大型白色幼猪（45-60 kg），并在全身麻醉下进行。

1. 动物条件化与麻醉方案

  1. 让动物与同种个体共同在环境丰富化的条件下适应 7 天，以确保动物福利。
  2. 在动物进入实验方案前 12 小时停止喂食。
  3. 在操作前 30 分钟，通过颈肌注射等摩尔混合的替来他明和唑拉西泮（10 mg/kg）进行预麻醉处理。
  4. 动物镇静后，插入耳缘静脉导管，并通过静脉推注丙泊酚（2 mg/kg）联合给予阿曲库铵（2 mg/kg）诱导全身麻醉。
  5. 使用 7.5 mm 口腔气管导管对动物进行插管。
  6. 通过持续心电图（EKG）、呼气末 CO2 和血氧饱和度监测动物生命体征。
  7. 以吸入式异氟烷（2%）混合 40% 氧气维持全身麻醉。

2. 原位 心脏血流动力学与超声心动图评估

注意：血流动力学评估采用 Swan Ganz 导管进行，而心脏的基线功能评估则通过经胸超声心动图完成。

  1. 采用Seldinger技术，经皮将8 French (Fr)鞘管插入头臂静脉干8。
  2. 排除导管内空气并设定零压力后，将Swan Ganz导管插入8 Fr鞘管，直至监护屏幕显示肺动脉压力波形。
  3. 在球囊充气状态下，将Swan-Ganz导管送入肺循环，获取肺动脉楔压。
  4. 通过Swan Ganz导管近端管腔注入10 mL冷（4 °C）生理盐水，采用热稀释法测定心输出量，重复测量三次。
  5. 采用双平面Simpson法评估左心室射血分数（LVEF）9。
  6. 探查主动脉瓣及主动脉根部，识别是否存在结构异常或反流程度超过2级的主动脉瓣反流，此类情况可能影响经升主动脉进行的心脏离体（ex situ ）灌注（图1）。

3. 常温灌注的描述与预处理 离体 灌注（NESP）装置

注意：采用改良的NESP模块以交替进行朗格多夫灌注和工作模式灌注。简而言之，将循环回路的主动脉管路连接至顺应性腔室 通过 一个Y型连接器。连接一个小儿氧合器和一个心内吸引储血器（位于模块主动脉连接端上方70-80 cm处），以在工作模式下提供约70 mmHg的左心室后负荷。使用另一个Y型连接器将另一个心内吸引储血器（位于模块主动脉连接端上方7-10 cm处）连接至主流入管路，以在工作模式下提供约10 mmHg的左心房前负荷（图2通过连接至肺动脉插管的血流传感器评估冠状动脉血流。离心泵、膜式氧合器和变温机与管路相连（图2）。有关溶液的描述，请参见 表1.

  1. 使用预充液（表1）预充灌注管路。
  2. 将泵流速设定为 1500 mL/min。
  3. 将从供体猪获取的血液（1200–1500 mL）加入管路中。
  4. 调节气体混合器，使氧分压 >250 mmHg。
  5. 将维持液和肾上腺素溶液（表1）连接至管路，并分别将初始流速设定为 5 mL/h 和 0.1 mL/h。
  6. 在将心脏放入灌注模块前，将灌注液温度调节至室温（RT）。
  7. 在工作模式期间，连接浓度为 2.5 mg/mL 的多巴酚丁胺注射器（流速设定为 0.04–0.12 mg/h）。

4. 常温下心脏的获取与装置 离体 心脏灌注

  1. 心脏获取
    1. 将动物置于仰卧位，并持续维持全身麻醉。
    2. 行胸骨正中切开术并打开心包膜。
    3. 用四根固定缝线悬吊心包膜。
    4. 在右心房和升主动脉上分别放置4-0聚丙烯缝线，用于固定带止血带的插管。
    5. 肝素输注（300 IU/kg）后，仔细游离主动脉根部，在右心房插入双腔静脉插管用于血液收集，在升主动脉插入单腔插管用于停跳液灌注。
    6. 用Silastic止血带分别隔离上腔静脉和下腔静脉。
    7. 将静脉插管连接至含有10,000 IU未分馏肝素的血液收集袋。
    8. 将仔猪身体置于头低脚高位（Trendelenburg位），以促进血液流入收集袋。
    9. 血液收集完成后，夹闭升主动脉，在主动脉根部灌注Del Nido停跳液（表1），并确认升主动脉处于加压状态（无主动脉反流）。
    10. 分别切开下腔静脉和右肺静脉以减压右心房和左心房，同时用止血带夹闭上腔静脉。
    11. 停跳液灌注完成后，用两针4-0聚丙烯缝线结扎左侧半奇静脉。
    12. 进行心脏获取，保留约2 cm长的肺动脉干及左心房后壁。
    13. 检查房间隔以确认无未闭的卵圆孔，必要时使用4-0聚丙烯缝线予以关闭。
  2. NESP前心脏的器械准备
    1. 将心脏置于4 °C生理盐水中，分离升主动脉与肺动脉干。检查主动脉瓣和冠状动脉开口是否受损。
    2. 在升主动脉远端切口下方5 mm处插入四针带垫片缝线（4-0聚丙烯），将灌注插管插入主动脉，并用血管钳夹紧主动脉以固定插管。
    3. 将引流插管插入肺动脉干，并用3-0聚丙烯连续缝线固定。
    4. 用5-0聚丙烯连续缝线关闭下腔静脉和上腔静脉。
    5. 用4-0聚丙烯连续缝线关闭左心房后壁。
    6. 通过左心房后壁插入左心室引流插管，并用止血带套扎固定。
    7. 将预负荷插管插入左心耳，并用止血带套扎固定。

5. 连接 NESP 机器与心脏复苏

注意：在对心脏进行插管操作前，应确保复苏所需的材料已放置在灌注回路旁边，特别是配备内置探头的除颤器以及带有心外膜电极的体外起搏器。确保压力传感器连接至主动脉管路，输出传感器放置在冠状动脉血流管路上。后负荷管路必须夹闭，工作模式回路的前负荷管路也必须夹闭。

  1. 将泵流速降低至 200 mL/min。
  2. 在排除连接器内空气后，将心脏连接至主动脉连接器。确保心脏正确连接至灌注模块，使心室下壁以及左右心房位于操作者前方。避免扭曲升主动脉，以防发生主动脉反流。
  3. 在室温下将主动脉压力调节至 30 mmHg。
  4. 在复苏期间，进行轻柔的心脏按摩，直至恢复窦性心律。
  5. 在 15–25 分钟内，以每次 50 mL/min 的幅度逐步增加泵流速，使主动脉压力达到 65 mmHg。同时，以每次 2–4 °C 的幅度逐步提高灌注液温度，直至达到 37 °C。
  6. 当主动脉压力达到 65 mmHg 且灌注液温度达到 37 °C 后，如有需要，给予 5 J 电击，必要时重复操作，直至恢复窦性心律。
  7. 将心外膜电极固定于右心室后壁，并连接至体外起搏器。以 80 次/分钟（BPM）起搏心脏，以超速抑制自发心律。
  8. 将肺动脉插管连接至冠状动脉血流管路。
  9. 采集动脉和静脉血样，用于灌注液的气体及生化分析。记录初始乳酸浓度，并纠正生化异常，以达到以下目标值：葡萄糖 >1 g/L，K+ 3.5–5.5 mmol/L，Ca2+ 1.0–1.20 mmol/L，pH 7.35–7.45，Na+ 135–145 mmol/L，HCO3- 20–24 mmol/L。
  10. 调节泵流速，使平均主动脉压力达到 65–75 mmHg，冠状动脉血流达到 650–850 mL/min。
  11. 每 15 分钟进行一次动静脉血气分析，以确保心肌对乳酸的摄取有效。若静脉乳酸浓度高于动脉乳酸浓度，则通过减少维持液量将平均主动脉压力提高至 80 mmHg，并在 15 分钟后检测乳酸浓度。若动静脉乳酸清除仍不理想，则将冠状动脉血流增加至 >850 mL/min，并于 15 分钟后再次检测乳酸浓度。

6. 工作模式操作步骤

注意：乳酸的有效动静脉清除通常在开始朗根多夫灌注后30分钟内完成。随后可通过将预负荷导管连接至预负荷储液器来启动工作模式（此管路在朗根多夫模式期间先前处于夹闭状态）。类似地，将后负荷管路连接至主动脉管路（图2）。设置后负荷管路上的流量传感器以测量心输出量。

  1. 打开预负荷管路并调节泵的流速，以确保预负荷储液器稳定充盈。在此期间，左心房和左心室逐渐被血液充盈。
  2. 打开主动脉后负荷管路，并夹闭用于Langendorff灌注的主回路管路。后负荷储液器随之逐渐充盈。通过溢流管路确保储液器的液体引流，将灌注液回流至回路的主储液器中。
  3. 开始以0.04 mg/min的速率输注多巴酚丁胺。
  4. 进行动脉和静脉血气样本分析，以确认心肌对乳酸的摄取仍有效。
  5. 当心输出量稳定后，进行有创血流动力学评估，并同步进行心外膜超声测量。

7. 采用导纳法进行压力-容积（PV）环评估

注意：所有校准步骤必须在工作模式下进行。

  1. 将导管置入左心室进行压力-容积（PV）测量
    1. 用生理盐水清洗7 Fr猪尾型导电性导管，并将其连接至硬件接口。
    2. 轻柔地将导管推入已通过左心房顶部插入的8 Fr鞘管中，使其与二尖瓣对齐。
    3. 一旦导管穿过二尖瓣，根据最佳压力和容积信号调整至合适位置。若信号噪声过大，可轻柔移动导电性导管以改善回路质量。
  2. PV回路导管校准
    1. 压力校准
      1. 当导电性导管准确位于左心室内后，在软件中打开校准界面，并使用导电性测量采集软件校准压力值。
      2. 开始记录，依次在控制界面上选择0 mmHg和100 mmHg压力，每项记录5秒。
      3. 然后停止记录，打开压力校准界面，将相应信号与对应的压力水平匹配。
      4. 校准完成后，验证信号是否与有创血压监测获得的数值一致。
    2. 容积校准
      1. 导电性校准
        1. 在软件中打开用于导电性测量的控制界面。
        2. 依次开始记录，并选择校准界面建议的容积值。
        3. 让系统对每个值记录5秒，然后停止记录。
        4. 使用获得的数据轨迹，打开容积校准界面。
        5. 将相应的轨迹与压力水平匹配。
      2. 并行容积校准
        1. 心脏周围组织具有导电性，会影响总体容积信号。为实现精确的容积测量，需去除该并行容积（后处理校准）。
        2. 在此实验设置中（心肌壁），仅向左心房灌注管路中一次性注入10 cc高渗盐水溶液（4%）以评估并行容积。
        3. 避免重复操作，以防发生高钠血症。
  3. 场校正因子校准
    1. 输入从超声测量中获得的每搏输出量数值。
      注：校正因子α将根据超声测量或导电性导管测得的每搏输出量比值进行计算。
  4. PV数据采集
    1. 停止心脏心外膜起搏，以避免对导电性信号造成干扰。在信号稳定后的稳态条件下进行数据记录（图3）
    2. 选取连续的10个回路，打开分析软件。软件将自动提供每搏功、前可募集每搏功、最大dP/dt、最小dP/dt以及tau指数。
    3. 为获得收缩末期压力-容积关系（ESPVR）和舒张末期压力-容积关系（EDPVR），在前负荷阻断期间记录信号。逐渐夹闭心房灌注管路，直至有效降低前负荷（图4），然后缓慢松开夹子。

8. 心脏工作状态下的心外膜超声心动图评估

  1. 超声图像序列的采集
    1. 将三个连接至超声心动图仪的心电图心外膜电极放置到位。
    2. 在心脏周围覆盖无菌铺巾，并使用经食管探头。
    3. 将探头置于左心房上壁，并手动旋转换能器，直至获得四腔心切面图像（图5）。
    4. 启动超声心动图采集软件，采用X-plan模式进行心肌功能评估。
    5. 随后运行超声探头马达，获取三腔心和两腔心切面图像。对这些切面的分析可用于测量左心室射血分数和整体纵向应变9。
  2. 心肌做功指数（MWI）的评估
    1. 依次采集四腔心、三腔心和两腔心切面图像，并同步记录动脉压力（图6）。
    2. 利用上述切面评估整体纵向应变，并打开MWI分析软件。在图像序列采集期间，使用灌注回路中外接传感器检测到的有创血压数据。
    3. 手动向软件输入主动脉瓣和二尖瓣开启与关闭的精确时相。
      注意：MWI软件将自动计算并提供整体心肌做功指数、有效做功、无效做功和总有效做功。

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结果

本文介绍了一种在单心室工作状态下进行的无血心脏停搏液灌注（NESP）方案，该方案使用了一种改良的心脏灌注模块，该模块通常在临床实践中用于心脏移植前供体心脏的Langendorff灌注。本研究所用的定制模块于2019年开发，用于构建仔猪NESP模型。灌注回路的改动较小，大部分灌注管路在实验中得以重复利用。模块的盖子配备了一层柔韧且防水的膜，可在运输过程中保护心脏，同时允许在保持无菌环境的前提下进行心脏表面超声心动图检查。在临床实践中，推荐的预充量（混合血液与预充液）约为1200–1500 mL。而在本方案中，预充量更高（2000 mL），因为工作模式灌注需要更长的管路和额外的储液装置。因此，此类设计要求实验动物体重超过50 kg，以采集足够的血液 >1500 mL

与先前报道的NESP工作模式模型相比，猪心脏在灌注模块中的放置方式有所不同10,11。事实上，大多数模型描述的是将心脏通过主动脉悬挂，垂直置于血液收集室上方。在本方案中，我们使用了一个 commerc...

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讨论

在NESP方案中有一些关键步骤需要考虑。原位对心脏的初步评估仍然至关重要，特别是主动脉瓣不应存在明显的主动脉瓣反流（2级或以上）；否则，由于冠状动脉灌注受损和心肌缺血，心脏在Langendorff灌注期间的复苏将受到影响。在Langendorff灌注后启动工作心脏模型（WM）是一项具有挑战性的操作，至少需要两人协作调节前负荷储液器的充盈、泵的流量、左心房压力以及主动脉流出道管路。这一过渡阶段需在心肌实现有效的乳酸代谢提取后进行。在此期间，由于大量空气栓塞导致泵功能失效，灌注回路可能会停止运行。超声探头需放置于左心房壁以获得稳定的两腔和三腔切面图像，但心脏周围复杂的插管和装置设置会部分干扰探头的最优定位。超声心动图数据必须在非常稳定的超声信号下记录，并至少包含三个心动周期。

在NESP期间，关于心脏复苏的报道在文献中并不明确。仅有少数研究详细描述了启动NESP的复苏操作流程13。本方案中开发了初步的复苏方法，以建立最佳的复苏技术，包括通过逐步增加冠状动脉血流和血液温度（从室温升至37 °C）实现渐进性再灌注。超声成像的...

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披露

所有作者均无利益冲突需要披露。

致谢

Georges Lopez 研究所，Lissieu，69380，法国

Claudia Lacerda，通用电气医疗集团，Buc，法国

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
3T 加热冷却系统Liva Nova，Châ蒂隆，法国IM-00727 A体外加热冷却装置
4-0聚丙烯缝合线Peters，法国博比尼20S15B缝合线
5-0聚丙烯缝合线Peters，法国博比尼20S10B缝线
腺苷Efisciens BV，荷兰鹿特丹9088309用于离体灌注的药物
肾上腺素Aguettant，里昂，法国600040用于离体灌注的药物
阿曲库铵Pfizer Holding France，巴黎，法国582547麻醉诱导用药
DeltaStream费森尤斯医疗，L’法国阿尔布雷勒MEH2C4024体外血泵
心外膜心电图电极美国伊利诺伊州沃基根市，Cardinal Health LLC31050522心电图检测电极
体外起搏器美敦力公司，明尼阿波利斯，明尼苏达州，美国5392起搏器装置
葡萄糖 5%B.Braun Melsungen AG，德国美尔森3400891780017用于预充液的药物
心脏灌注套装，器官护理系统Transmedics，美国马萨诸塞州安多弗Ref#1200常温离体心脏灌注装置
Intellivue MX550飞利浦医疗，法国叙雷讷NA永久监测系统
Istat 1Abbott，芝加哥，伊利诺伊州，美国714336-03O血液分析仪
LabchartAD Instruments Ltd，法国巴黎LabChart v8.1.21压力容积环采集软件
镁Aguettant，里昂，法国564 780-6心脏停搏液用药
硫酸镁Aguettant，里昂，法国600111心脏停搏液用药
甘露醇 20%Macopharma，Mouvoux，法国3400891694567.00心脏停搏液用药
甲泼尼龙Mylan S.A.S，法国圣普里耶斯特400005623引物溶液用药
Millar 导管式容积导管AD Instruments Ltd，法国巴黎Ventri-Cath 507压力-容积环导管法
MWI 软件美国伊利诺伊州芝加哥市通用电气医疗集团NA用于超声心动图仪的软件
经口插管导管Smiths医疗ASD公司，明尼阿波利斯，明尼苏达州，美国100/199/070麻醉期间用于插管的探针
10% 氯化钾德国美乐森 B.Braun Melsungen AG 公司3400892691527.00心脏停搏液用药
丙泊酚Zoetis France，Malakoff，法国8083511麻醉诱导用药
Quadrox-I 小型成人氧合器杰廷格，Gö瑞典哥德堡BE-HMO 50000体外血液氧合器
林格氏液德国美乐森 B.Braun Melsungen AG 公司DKE2323心脏停搏液用药
碳酸氢钠法国雷诺丹实验室，伊塔苏3701447心脏停搏液用药
氯化钠Aguettant，里昂，法国606726引物溶液用药
Swan Ganz导管Merit Medical，美国犹他州南乔丹5041856右心压力和心输出量探头
替来他明Virbac France，卡罗斯，法国3597132126021.00麻醉诱导用药
经食管探头（3–8 MHz 6VT美国伊利诺伊州芝加哥市通用电气医疗集团NA经食管超声心动图超声探头
Vivid E95 超声成像仪美国伊利诺伊州芝加哥市通用电气医疗集团NA超声心动图机
Xylocaï2%Aspen，法国吕埃-马尔迈松600550心脏停搏液用药
佐拉西泮Virbac France，卡罗斯，法国3597132126021.00麻醉诱导用药

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