原位小鼠肝细胞癌模型中的无创PET/MR成像

摘要

本文介绍了一种建立正位肝细胞癌异种移植模型的方案，该方案包括结扎和不结扎肝动脉的条件，并利用[¹⁸F]氟米索硝唑（[¹⁸F]FMISO）和[¹⁸F]氟脱氧葡萄糖（[¹⁸F]FDG）进行无创正电子发射断层扫描（PET）成像，以检测肿瘤缺氧情况。

摘要

能够模拟人类疾病的肝细胞癌（HCC）临床前实验模型是研究肿瘤发生机制和评估新型治疗方法的重要工具。利用正电子发射断层扫描（PET）进行无创全身成像，可实时提供组织在分子水平上的体内特征信息。本文介绍了一种建立原位HCC异种移植模型的实验方案，包括结扎肝动脉（HAL）以诱导肿瘤缺氧，以及使用[¹⁸F]氟米索硝唑（[¹⁸F]FMISO）和[¹⁸F]氟脱氧葡萄糖（[¹⁸F]FDG）进行PET/磁共振（MR）成像以评估其体内肿瘤代谢情况。通过缺氧示踪剂[¹⁸F]FMISO可清晰可视化肿瘤缺氧状态，结果显示，接受HAL处理的HCC小鼠模型中[¹⁸F]FMISO摄取显著高于未行HAL组，而[¹⁸F]FDG则无法区分两组之间的肿瘤缺氧差异。HAL组肿瘤还表现出更高水平的缺氧诱导因子（HIF）-1α表达，以响应缺氧环境。基于标准化摄取值（SUV）方法对HAL组肿瘤进行定量分析，显示[¹⁸F]FMISO摄取量增加了2.3倍。

引言

肝细胞癌（HCC）是全球第六大常见癌症，也是癌症相关死亡的第三大主要原因，2020年新发病例超过90万例，死亡病例达80万例¹。主要危险因素为肝硬化，通常由病毒感染（乙型和丙型肝炎病毒）、酗酒、糖尿病以及非酒精性脂肪性肝炎引起²。HCC的治疗较为复杂，根据疾病分期可选择多种治疗方式，包括手术切除、热消融或化学消融、肝移植、经动脉化疗栓塞、放疗和化疗等^2,3。HCC是一种对化疗不敏感的肿瘤，高达70%的患者在接受根治性治疗后会出现疾病复发²。

尽管肿瘤具有高度异质性，肝细胞癌（HCC）通常与两种常见结果相关：（i）HCC 处于严重缺氧状态，（ii）肿瘤缺氧与更高的肿瘤侵袭性及治疗失败密切相关。HCC 细胞的失控性增殖导致耗氧速率超过血管生成速度，从而形成缺氧的微环境。肿瘤内部低氧水平会触发一系列生物学反应，影响肿瘤的侵袭性及对治疗的响应。缺氧诱导因子（HIFs）通常被认为是缺氧反应中关键的转录调控因子^2,3。因此，检测缺氧的能力对于可视化肿瘤组织、识别需要侵入性操作的难以触及区域至关重要。同时，这也有助于....

方案

所有动物实验均按照香港大学比较医学研究中心（CCMR）实验动物使用与研究委员会（CULATR）的规定进行，该机构已获得国际实验动物护理评估与认证协会（AAALAC）认证。实验所用动物为6至8周龄、体重20 g ± 2 g的雌性BALB/cAnN-nu（裸鼠）小鼠。实验期间自由供应食物和饮水。 随意.

1. 人肝细胞癌细胞系的皮下注射

注意：MHCC97 是一种人肝细胞癌（HCC）细胞系，用于建立皮下 HCC 异种移植模型。MHCC97L 细胞来源于中国上海复旦大学附属中山医院肝癌研究所⁹，并经短串联重复序列（STR）分型鉴定确认。

1. 培养MHCC97L细胞，并在含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的培养基中，于37 °C、5% CO₂的湿化培养箱中维持培养（参见材料表）。每2天更换一次培养基，并在细胞融合度达到80%-90%时进行收获。
   注意：起始细胞数量为1.5 × 10⁶个细胞，细胞使用代数控制在6-8代以内。
2. 将培养基和胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（胰蛋白酶-EDTA）于4 °C避光保存至使用前。使用前将培养基预热至37 °C，胰蛋白酶-EDTA升至室温。本步骤所用所有试剂和耗材详....

结果

为了获得适用于连续原位移植的肿瘤组织块，首先将200 μL DPBS细胞悬液（含MHCC97L细胞）皮下注射至裸鼠下侧腹部位，以建立稳定的克隆（图1A）。监测肿瘤生长情况，当肿瘤体积达到800–1000 mm³（注射后约4周）时，处死小鼠，将所获得的肿瘤组织块切成约1 mm³大小的片段，用于后续在另一批裸鼠（n = 6）中进行肝脏原位移植。小鼠被随机分为两组：对照组（C1，n = 3）和肝动脉结扎组（H2，n = 3）。通过用细线结扎肝动脉主干实现肝动脉结扎（HAL）。C1组小鼠在原位移植前不进行HAL处理。该操作仅在H2小鼠中诱导出肿瘤缺氧状态，而C1小鼠中未出现，且可利用PET缺氧示踪剂[¹⁸F]FMISO对肿瘤缺氧状态进行无创监测。PET/MR研究显示，仅H2小鼠的肿瘤[¹⁸F]FMISO摄取增加；而使用糖酵解标志物[¹⁸F]FDG检测时，两组间肿瘤摄取水平相似（图1B）。

讨论

本研究中，我们描述了利用皮下肿瘤对肝原位HCC异种移植瘤进行HAL操作的步骤，以及使用[¹⁸F]FMISO和[¹⁸F]FDG PET/MR对原位异种移植瘤进行无创性肿瘤缺氧监测的方法。我们的研究兴趣在于多种癌症和疾病模型的代谢成像，用于早期诊断及治疗反应评估^11,13,14,15。迄今为止，文献中关于构建HAL HCC异种移植瘤模型及其in vivo肿瘤代谢特征的报道极为有限，这促使我们通过PET成像技术来探究这些肿瘤模型的代谢特性。

成功建立以肝动脉结扎（HAL）为手段的原位异种移植小鼠模型，用于研究肝细胞癌（HCC）中的缺氧环境，是体内研究HCC生物学的重要方面。in vivo研究表明，缺氧可促进癌症恶性进展。此外，肿瘤内缺氧与增殖增强、转移以及.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.9% 无菌生理盐水	BBraun	N/A	0.9% 氯化钠静脉输注液，500 mL
10# 手术刀片	RWD Life Science Co.,ltd	S31010-01	动物手术工具
10% 聚维酮碘溶液	Banitore	6.425.678	用于消毒
25G 针头配 1 mL 注射器	BD PrecisionGlide	N/A	用于细胞悬液注射的 1 mL 注射器配 25G 针头
5 mL 注射器	Terumo	SS05L	5 mL 鲁尔锁注射器
70% 乙醇	Merck	1.07017	用于消毒
自动细胞计数仪	Invitrogen	AMQAF2000	用于自动细胞计数
布托啡诺	HealthDirect	N/A	皮下注射（0.05–0.2 mg/kg/12 小时），术后镇痛
细胞培养皿（60 mm 直径）	Thermo Scientific	150462	用于肿瘤组织处理
离心机	Sigma	3-16KL，固定角转子 12311	用于收集细胞悬液
离心锥形管	Eppendorf	EP0030122151	用于收集细胞悬液
培养基（Dulbecco’s 改良 Eagle’s 培养基）	Gibco	10566024	高糖，含 GlutaMAX™ 补充剂
数显卡尺	RS PRO	841-2518	用于皮下肿瘤大小测量
直接加热 CO2 培养箱	Techcomp Limited	NU5841	用于细胞培养
剂量校准仪	Biodex	N/A	Atomlab 500
DPBS（Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液）	Gibco	14287072	用于细胞洗涤和注射
眼用润滑剂	Alcon Duratears	N/A	无菌眼用润滑软膏，3.5 g
胎牛血清（FBS）	Gibco	A4766801	适用于多种细胞类型，尤其敏感细胞系
镊子（弯精细和直钝头）	RWD Life Science Co.,ltd	F12012-10 & F12011-13	动物手术工具
加热垫	ALA Scientific Instruments	N/A	手术期间小鼠用加热垫
胰岛素注射器	Terumo	10ME2913	1 mL 胰岛素注射器配针头，用于放射性示踪剂注射
InterView 融合软件	Mediso	版本 3.03	后处理与图像分析软件
倒置显微镜	Yu Lung Scientific Co., Ltd	BM-209G	用于观察细胞形态
异氟烷	Chanelle Pharma	N/A	Iso-Vet，吸入性麻醉剂，250 mL
氯胺酮	Alfasan International B.V.	HK-37715	10% 氯胺酮注射液，10 mL
医用氧气	Linde HKO	101-HR	压缩气体，纯度 99.5%
nanoScan PET/MR 扫描仪	Mediso	N/A	3 特斯拉磁共振
持针器	RWD Life Science Co.,ltd	F31026-12	动物手术工具
Nucline nanoScan 软件	Mediso	版本 3.0	扫描仪操作软件
尼龙缝线（6/0 和 5/0）	Healthy Medical Company Ltd	000524 & 000526	动物手术工具
青霉素-链霉素	Gibco	15140122	培养基中终浓度为 50 至 100 I.U./mL 青霉素和 50 至 100 µg/mL 链霉素
戊巴比妥	AlfaMedic	13003	腹腔注射（330 mg/kg），诱导小鼠呼吸停止
锐利剪刀	RWD Life Science Co.,ltd	S14014-10	动物手术工具
弹簧剪刀	RWD Life Science Co.,ltd	S11005-09	动物手术工具
台盼蓝溶液，0.4%	Gibco	15250061	用于细胞计数
胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA，0.25%），酚红	Gibco	25200072	用于细胞消化
赛拉嗪	Alfasan International B.V.	HK-56179	2% 赛拉嗪注射液，30 mL