一种研究细胞内囊泡破裂功能的光动力学方法

摘要

AlPcS_2a介导的染料辅助激光失活（CALI）是一种用于研究活细胞内细胞内囊泡（IVs）时空损伤的有力工具。

摘要

细胞内囊泡（IVs）通过囊泡内吞进入细胞质而形成。IV的形成涉及多种信号通路的激活，这一过程与IV膜的通透性改变以及内体和溶酶体的形成密切相关。一种名为染料辅助激光失活（chromophore-assisted laser inactivation, CALI）的方法被用于研究IV的形成及其在调控IV过程中的相关物质。CALI是一种基于成像的光动力学方法，可用于研究由膜通透性改变所诱导的信号通路。该方法能够在细胞中对选定的细胞器进行时空特异性的通透性操控。CALI方法已被应用于通过内体和溶酶体的通透化来观察和监测特定分子。已知IV膜的破裂会选择性募集糖结合蛋白，例如半乳糖凝集素-3（galectin-3）。本文所述实验方案描述了利用AlPcS_2a 诱导IV破裂，并以galectin-3作为标记物来标记受损溶酶体的方法，该方法有助于研究在不同条件下IV膜破裂及其下游效应的生物学后果。

引言

内体是一种细胞内囊泡（IV），通过胞吞作用形成，随后成熟为溶酶体。多种细胞内信号通路参与了细胞内囊泡的形成；此外，不同的内在和外在刺激均可对细胞内囊泡造成损伤（例如，病原体在感染过程中可从包被膜中逃逸并进入细胞质¹）。这一过程通常伴随着胞吞囊泡的破裂²。因此，靶向和破坏细胞内囊泡的技术可用于相关研究³。

光动力疗法（PDT）是一种依赖光照射来杀伤肿瘤或病原体以治疗疾病的治疗方法⁴。在PDT中，靶向细胞被标记上无毒性的发色团，即光敏剂，这些光敏剂可通过光照在局部被激活^5,6。光敏剂吸收光能后转变为激发的单重态，进而形成寿命较长的激发三重态。处于三重态的光敏剂可在氧气存在下发生电子或能量转移，产生活性氧物种（ROS），从而在光照区域内特异性地破坏被标记的细胞⁷。其效应因光照强度的不同而有所差异⁸。通过调控光敏剂的浓度和光照强度，可选择性地使靶向生物分子失活而不引起细胞裂解，该过程称为发色团辅助光失活（CALI）⁹。随着能够特异性标记多种亚细胞结构的光敏剂的显著发展，CALI已成为一种重要的工具，可用于调控光介导的生物分子失活，其应用范围涵盖核苷酸和蛋白质等小分子生物分子，以及线粒体和内体-溶酶体等细胞器^{3,10,11,12,13}。

与CALI相比，化学或物理方法也可用于损伤膜结构，例如使用细菌毒素^14,15和Leu-Leu-OMe¹⁶处理以造成溶酶体损伤。然而，这些方法会在细胞内引起大范围的内涵体/溶酶体（IV）损伤。CALI中则使用高效的光敏剂（例如Al(III)酞菁氯化二磺酸（AlPcS_2a））；AlPcS_2a通过内吞作用靶向溶酶体，可在特定区域可控地破坏内体或溶酶体¹⁷。AlPcS_2a是一种不能穿透细胞膜的基于酞菁的发色团，可结合质膜上的脂质，通过内吞作用被细胞摄取，并经由内吞途径最终在溶酶体内富集¹⁸。它在近红外光谱区吸收光，产生单线态氧，这是激发态AlPcS_2a生成的主要活性氧（ROS）¹⁸。单线态氧衰变迅速，其扩散和反应距离被限制在细胞内的极小区域（约10–20 nm）¹⁹。通过调节AlPcS_2a的孵育时间与光照时间，可实现对亚细胞区域内IV损伤的时空精确控制。因此，CALI成为研究IV损伤后果以及IV形成与调控机制的有力工具。

本研究介绍了一种使用AlPcS_2a 作为光敏剂的特异性CALI实验方案。该方案可应用于多种类型的囊泡（IVs），包括内体和溶酶体，并可用于检测膜破裂后的后续反应。通过表达荧光标记的半乳糖凝集素-3^16,20的HeLa细胞在溶酶体破裂后的变化，来演示本实验方案。

方案

1. AlPcS_2a 储存液的配制

1. 将10 mg的AlPcS_2a溶解于400 µL的0.1 M NaOH中。为提高溶解度，于50 °C加热溶液并涡旋振荡。
2. 将该溶液与4 mL磷酸盐缓冲液（PBS）混合，随后使用0.22 µm滤膜过滤，以去除不溶性沉淀物。
3. 使用紫外-可见分光光度计测定溶液浓度。AlPcS_2a在672 nm处的消光系数为4 × 10⁴ cm^-1 M^-1。用PBS将AlPcS_2a溶液稀释至1 mM浓度，分装为每份1 mL，于-20 °C保存。

2. 转染

注意：Gal3-GFP 用作溶酶体破裂活细胞成像的指示剂。

1. 在添加10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基中培养HeLa细胞。用PBS洗涤细胞后，使用胰蛋白酶消化细胞，然后将细胞重悬于含10% FBS的DMEM培养基中。
   注意：该方法适用于大多数贴壁细胞系，包括HeLa和A549细胞系。原则上，尽管未对悬浮细胞进行测试，CALI实验仍可能适用于此类细胞。
2. 将300 ng Gal3-GFP质粒溶于25 µL低血清培养基中，然后加入0.6 µL P3000试剂，轻轻混匀。将0.45 µL Lipofectamine 3000试剂溶于25 µL低血清培养基中，轻轻混匀。
3. 室温孵育5分钟。将稀释后的DNA与稀释后的Lipofectamine 3000混合，再于室温孵育10分钟。
4. 将DNA-Lipofectamine混合物、3 × 10⁵个悬浮的HeLa细胞以及200 µL含10% FBS的DMEM培养基混合，然后将细胞接种至35 mm玻璃底培养皿的中央玻璃区域。

3. AlPcS2a 染色

1. 为促进细胞贴壁，将细胞置于37 °C、含适当气体环境的培养箱中孵育 5% CO₂ 至少 4 小时。
2. 稀释 AlPcS_2a 在添加了10% FBS的DMEM中配制，制成1 µM AlPcS溶液_2a 溶液。预先将AlPcS加热至适宜温度_2a含培养基置于37 °C水浴中。将培养基更换为AlPcS_2a含培养基
3. 在含有5% CO₂的培养箱中，于37 °C下孵育细胞₂ 过夜（16–18 小时）。
4. 次日，用 PBS 洗涤细胞两次，以去除细胞外的 AlPcS2a。更换为新鲜培养基，于 37 °C 继续孵育 4 小时，使经内吞途径残留的染料在溶酶体中聚集。
   注意：为了染色内体，将细胞在 1 µM AlPcS 中孵育_2a 在含10% FBS的DMEM中于37 °C孵育15分钟。随后，用PBS洗涤细胞两次，并将细胞置于预热的培养基中孵育，然后进行成像。

图1。使用AlPcS_2a实现选择性IV损伤的示意图。该图展示了选择性IV损伤的示意图。请点击此处查看此图的放大版本。

图2使用AlPcS2a进行溶酶体染色。 用1 µM AlPcS过夜标记的溶酶体_2a 在HeLa细胞中，使用50 nM绿色荧光染料进行阳性染色。比例尺：10 µm。 请点击此处查看此图的放大版本。

4. 样品成像与光照

注意：可对单个细胞内的亚细胞区域或培养皿中所有AlPcS_2a标记的细胞进行光动力损伤处理。对整个培养皿进行大范围照射，可实现对该损伤的定量研究，包括生化分析。

1. 通过损伤单个细胞内的溶酶体来操控单个细胞，具体操作如下所述。
   1. 将培养皿置于共聚焦显微镜的载物台上。分别使用488 nm和561 nm激光激发GFP和AlPcS2a。
   2. 圈出 5 x 5 µm² 感兴趣区域（ROI）在 AlPcS 上_2a-labeled 囊泡，这些囊泡被选择为受损对象。
   3. 用633 nm、0.21 mW的激光对ROI进行脉冲照射，重复70次。监测Gal3斑点的形成，作为溶酶体膜通透化的指标。
2. 按照下述方法损伤培养皿中所有标记的细胞。
   1. 将培养皿置于平台上，用波长为660 nm的准直LED光照射（根据AlPcS2a的激发光谱，近红外光为理想光源）。
   2. 将培养皿置于显微镜下，按照步骤4.1.3中所述监测膜通透性变化的指标。
3. 使用以下指标评估静脉输液（IVs）的损伤情况。
   1. 内体或溶酶体的内容物高度糖基化，在囊泡破裂后会暴露于细胞质中。利用细胞质中的凝集素（galectin）快速标记这些糖基化物质，包括galectin-1、galectin-3、galectin-8和galectin-9。^16,20.
   2. 可通过膜不可渗透性染料的释放情况来确定伤口大小，具体方法如所述²¹.
   3. 内体与溶酶体的区别在于其腔内pH值。溶酶体破裂会扰乱腔内pH，可通过pH敏感性染料（如FITC-葡聚糖）进行检测。³.

图3。AlPcS_2a介导的CALI诱导TagRFP-galectin-3（Gal3）在照射区域内向溶酶体局部募集。 在表达TagRFP-galectin-3的HeLa细胞中，溶酶体经1 µM AlPcS_2a染色过夜，随后用近红外光（633 nm）照射黄色方框区域。黄色方框内的AlPcS_2a信号发生光漂白，同时伴随TagRFP-galectin-3点状结构的形成。比例尺：10 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

结果

已展示一幅示意图，表示AlPcS_2a诱导的IV型内体和溶酶体损伤（图1）。

可使用市售标记物来确定AlPcS_2a的染色条件。例如，AlPcS_2a斑点与绿色荧光染料的共定位（图2）²²。

荧光标记的半乳糖凝集素-3（galectin-3）可作为监测IV损伤的指示剂（图3）。此外，还可通过追踪Gal3点状信号的位置来检测下游信号通路，包括溶酶体修复和溶酶体自噬^3,23。Gal3从细胞质快速聚集到受损的IV部位会显著增强Gal3的信号强度，若调整图像对比度以显示细胞质中的Gal3，则Gal3点状信号的强度可能达到饱和。事实上，图...

讨论

AlPcS_2a 与质膜结合后，通过内吞作用被细胞内化，并最终在溶酶体中积累。因此，通过调整孵育时间，可将 AlPcS_2a 定位于不同的亚细胞区室。该方法的一个局限性在于，仅有一部分内体囊泡（IVs）可通过内吞作用被 AlPcS_2a 标记，因为 IVs 的膜来源多样，还包括内质网和高尔基体等。此外，AlPcS_2a 对早期内体或晚期内体的选择性标记较为困难，然而在亚细胞成像过程中，可利用荧光标记物来区分早期形成的内体与晚期形成的内体。CALI 诱导的 IV 损伤可通过多种染料实现^3,24。

损伤程度可通过光的功率和照射时间进行控制。较强的损伤可能导致细胞皱缩或坏死。本文展示了若干IV损伤的指标，可用于确定实验条件。此外，这些指标也可作为受损IV的标记物，提供其随时间变化的亚细胞分布信息。

在临床上，AlPcS_2a

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>试剂
氯化铝(III)酞菁二磺酸（AlPcS）2a)	前沿科学	P40632
培养皿	ibidi	812128-200
培养基			DMEM 培养基，添加 10% FBS、100 U/mL 青霉素 G 和 100 mg/mL 链霉素
DMEM	Gibco	11965092
FBS	赛默飞世尔科技	A4736301
Gal3-GFP 质粒	addgene
Lipofectamine 3000 试剂盒	赛默飞世尔科技	L3000008
LysoTracker Green DND-26	赛默飞世尔科技	L7526	绿色荧光染料
多孔板	珀金埃尔默	PK-6005550
NaOH	赛默飞世尔科技	Q15895
OptiMEM	赛默飞世尔科技	31985070
青霉素-链霉素	Gibco	15140163
磷酸盐缓冲液（PBS）	Gibco	21600-069	137 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM Na2HPO4，1.8 mM KH2PO4
<强>细胞系
HeLa细胞系	ATCC	CCL-2	这些方法适用于大多数贴壁细胞系，但需针对不同情况分别确定实验条件。
<强>仪器设备
0.22 µm 滤光片	默克	SLGV013SL
准直LED光源  (660 nm)	Thorlabs	M660L3-C1 和 DC2100	近红外光基于AlPcS2a的激发光谱是理想的选择。
共聚焦显微镜	卡尔·蔡司	LSM 780	长期成像需要使用培养系统。
NanoDrop 2000/2000c 分光光度计	赛默飞世尔科技
红光LED	Tholabs	M660L4-C1