需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

制备高开孔多孔微球（HOPMs） 通过 微流控技术

2.9K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/63971

⸱

2022年5月16日

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Biomaterials and Tissue Engineering, Huaqiao University, 2Fujian Provincial Key Laboratory of Biochemical Technology, Huaqiao University, 3Affiliated Dongguan Hospital, Southern Medical University, 4Division of Engineering in Medicine, Department of Medicine, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School

本文内容

摘要

本方案描述了聚乳酸的制备方法co基于聚乙醇酸的高开放孔微球（HOPMs） 通过 基于单乳液法制备的简易微流控技术。这些微球在组织工程和药物筛选中具有潜在应用价值。

摘要

与块状支架和单纯直接注射细胞相比，可注射模块化单元因其在细胞包装方面的便利性、更高的细胞滞留率以及微创性，在修复功能失常组织方面已引起广泛关注。此外，这些微尺度载体的多孔结构可增强培养基交换，改善营养物质和氧气的供应水平。本研究展示了利用简便的微流控技术制备基于聚乳酸-共-羟基乙酸的高开孔多孔微球（PLGA-HOPMs）用于细胞递送的便捷方法。所获得的单分散PLGA-HOPMs粒径约为400 µm，具有约50 µm的开孔及相互连通的孔道。简言之，在定制的微流控装置中，将包覆有7.5%（w/v）明胶水相的乳化油相液滴（PLGA的二氯甲烷溶液，DCM），通过同轴喷嘴注入1%（w/v）连续流动的聚乙烯醇（PVA）水溶液中。随后，微球经过溶剂萃取和冷冻干燥处理，从而形成HOPMs。值得注意的是，多种配方因素（PLGA和致孔剂的浓度）和工艺参数（乳化强度、针头规格以及分散相流速）对所得PLGA HOPMs的质量和特性具有关键影响。此外，这些结构还可能封装其他多种生化信号分子（如生长因子），在药物发现和组织再生应用中具有广阔前景。

引言

含细胞微球具有多种优势，例如增强的细胞滞留能力 原位，细胞的高效递送以及细胞增殖的后续能力 体内1迄今为止，已有大量研究致力于开发出成功的支架结构，以构建有利于细胞生长的微环境，用于组织再生或药物筛选应用。2然而，由于营养物质/氧气供应不足以及代谢废物的积累，内部环境常常不可避免地出现低氧状况。3为解决这些问题，已采用多种生物材料开发出高度多孔的微球（PMs）4,5,6此外，在动态培养中，支架会受到过高的剪切应力7，且培养基的不稳定状态可能破坏微粒的保真度。或者，聚乳酸-co聚乳酸-乙醇酸（PLGA）可用于制备具有良好机械强度的微球，以用于动态培养1例如，我们展示了负载小鼠成肌细胞（C2C12）的聚乳酸-羟基乙酸共聚物高通透性多孔微球（HOPMs）与负载人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的聚乙二醇中空微棒共注射，用于修复体积性肌肉缺损，实现了显著改善 原位 骨骼肌再生8.

值得注意的是，多孔微球（PMs）具有较大的比表面积和高孔隙率，这一特性在细胞黏附与生长以及微创细胞递送方面具有特殊意义9。基于这些特点，已有多种生物相容性材料被用于制备多孔微球10,11。这些可设计的多孔微球与细胞共培养时表现出优异的黏附性、足够的机械强度以及高度连通的孔道结构，有助于促进细胞增殖，从而修复受损组织12。为此，多种技术已被开发用于制备多孔微球13,14。一方面，通过使用发泡剂（如NH4HCO3）制备多孔微球，但该方法因孔道连通性不足而受到限制15,16,17。另一方面，通过乳化后直接剪切法制备多孔微球，但易产生粒径分布不均的多孔微球18。最终，基于乳液模板法的液滴微流控技术可能是构建多孔微球的一种高效方法，因其通常可制得粒径均一的微粒19。值得注意的是，微球的形态特征通常取决于所生成乳液液滴的质量（i.e.，水包油W/O或油包水O/W），这可能显著影响生物材料的性能20。值得注意的是，预先设计的微流控平台可用于生成微纤维或微球。例如，Yu 等人展示了基于毛细管微流控平台制备载细胞微纤维结构的方法，可用于组装细胞网络以模拟天然组织21。另一个例子中，Ye 等人通过微流控技术对二氧化硅胶体晶体微珠进行模板复制，制备了光子晶体微胶囊，该方法可克服现有技术中需要复杂标记和专用设备的诸多局限22。

事实上，采用该技术的原理在于其多种优势，例如操作简便、无需复杂设备，以及在合成用于细胞递送和再生医学应用的均一尺寸多孔微球（PMs）方面具有便利性。在此背景下，通过使用聚氯乙烯（PVC）管、玻璃毛细管和针头组装的微流控装置，结合预先设计的乳液模板组分，可方便地获得高孔隙率且孔间相互连通的多孔微球。通过将明胶水溶液与PLGA有机溶液均质化，制备水包油（W/O）乳液前驱体。通过将乳液的适当部分选择性地注入微流控平台，即可制备出粒径均一、且从表面到内部具有相互连通孔隙的多孔微球。本方案旨在通过微流控平台中的乳液模板法来制备PLGA高孔隙多孔微球（PLGA-HOPMs）。该方法有望实现PLGA-HOPMs的可重复制备，并在组织工程和药物筛选等相关领域具有潜在应用价值。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

1. 溶液的配制

  1. 提前配制PVA储备液：将PVA溶液置于80 °C水浴中加热，随后放入4 °C冰箱中冷却，待其降至室温（RT）后用于实验。
  2. 通过将水相明胶溶液（1 mL，7.5%，w/v）加入PLGA的有机相（2 mL，2%，w/v，溶于二氯甲烷DCM）中制备乳化前体（参见材料表）。
    ​注意：通常，微流控技术涉及多个相以形成微球。连续相或收集相为水相聚乙烯醇（PVA，600 mL，1%，w/v）。

2. 液滴微流控装置的组装及PLGA-HOPMs的制备

注意：本组装所需的耗材列于材料表中。

  1. 定制液滴发生器组件。
    1. 使用玻璃毛细管（外径，1 mm）、PVC管（内径，1 mm）和26 G dispensing针头构建共流微流控发生器。
    2. 将玻璃毛细管连接至PVC管末端，然后用针头刺穿上述结构的连接处。
    3. 在液滴生成过程中，将PVC管的另一端置于连续相中。使用紫外胶在固化后密封接头处的缝隙。
      注意：针头需弯曲约45°，以便于刺入PVC管，且针尖应伸入毛细管内，形成同轴结构。
  2. 准备液滴微流控平台。
    1. 使用两台注射泵，如图1所示。使用50 mL注射器装载连续相，5 mL注射器用于乳液形成。
    2. 将连续相和分散相的流速分别设定为2 mL/min和0.08 mL/min。
    3. 将500 mL烧杯置于冰浴中，并加入预冷的PVA水溶液（步骤1.1）。
      注意：玻璃毛细管末端必须浸入收集相中。建议在平台中形成乳液液滴后，用玻璃棒搅拌收集相的上清液（1 h，60 rpm）。乳液液滴在针尖处生成。通常，针头规格影响PMs的尺寸，规格越小，PMs尺寸越小。此外，孔径主要与致孔剂浓度相关，适当浓度的明胶可使其增大1。
  3. 进行乳化和液滴生成。
    1. 按以下步骤制备乳液。
      1. 将水相明胶溶液立即倾入PLGA的DCM溶液中（步骤1.2），并使用超声设备进行乳化（见材料表）。
      2. 调节超声功率至400 W，总处理时间为90 s（间隔2 s，超声处理1 s），同时手动持续改变探头位置。
      3. 使所得乳液稳定约20 min，以便进行注射器吸取和液滴生成。
        注意：将超声细胞破碎仪的探头置于油水界面处。建议不要让超声探头接触容器壁。
    2. 进行液滴生成。
      1. 超声处理后，迅速将制备好的乳液（步骤2.3.1）装入微流控平台的5 mL注射器中。
      2. 将不稳定的W/O乳液（正处于相分离过程中）作为不连续相引入微流控装置，同时使用PVA水溶液作为连续相。
      3. 将适量乳液注入微流控装置后，收集烧杯底部含有乳液的微球（PVA，1%，w/v）。
      4. 将样品在4 °C下静置过夜，以进一步稳定。
    3. 按以下步骤清洗并冻干制备的微球（PLGA-HOPMs）。
      ​注意：生成的PLGA-HOPMs在内部和表面含有任意分布的孔隙。
      1. 在将微球从4 °C恢复至室温前储存于4 °C，并用玻璃棒搅拌（1 h，60 rpm），以去除残留的DCM。
      2. 小心过滤500 mL烧杯中的收集相，并用去离子水洗涤收集的微球三次，以去除PMs表面残留的PVA。
      3. 将PLGA微球置于37 °C水浴中30 min，以溶解包裹在PLGA骨架中的明胶。
      4. 用去离子水洗涤所得PLGA-HOPMs两次，以去除残留明胶，并在-80 °C预冷24 h后进行冻干。
      5. 将干燥的PLGA-HOPMs储存于-20 °C，用于后续实验。

3. 扫描电子显微镜（SEM）成像

  1. 将PLGA-HOPMs沉积在SEM的样品台上（参见 材料表在室温下将样品台放入磁控溅射仪的溅射腔室中。依次打开变压器和磁控管电源。样品经金溅射镀膜1分钟后，将其引入扫描电子显微镜（SEM）进行观察。
  2. 通过将加速电压设置为 5 kV 来获取扫描电镜图像。
  3. 此外，使用扫描电镜成像的可变视野对100个PLGA-HOPM颗粒进行粒径定量分析。测量代表性结果以量化孔径分布。
    1. 使用 Image J 打开图像并使用 "直线" 以匹配扫描电镜图像的比例尺，从而使软件能够识别像素与长度的对应关系。
    2. 点击 分析 > 设置比例尺，设置 "已知距离" 比例尺的SEM图像，并点击 全球 > 好的.
    3. 点击 分析 > 工具 > ROI 管理器... 测量PLGA微球的孔径或粒径，并点击 添加它根据需求测量样品数量。
    4. 点击 测量 以获取图形的定量数据用于进一步计算。

4. 细胞培养与荧光成像

注意：本研究使用了大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）。细胞购自商业来源（见材料表）。

  1. 使用添加L-谷氨酰胺的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM/F-12）、10%（v/v）胎牛血清和1%青霉素/链霉素培养细胞。将细胞置于37 °C、5% CO2条件下培养。
  2. 当大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）融合度达到90%时，按1:2比例传代。
  3. 按照以下步骤进行细胞黏附实验。
    1. 将PLGA-HOPMs与乙醇（5 mL，70%，v/v）共同孵育，并在室温下以500 × g离心10分钟，以实现灭菌。
    2. 用磷酸盐缓冲液将灭菌后的PLGA-HOPMs洗涤两次。
    3. 将HOPMs（共五个）与细胞悬液（5 mL，1 × 105 个细胞/mL）置于无菌离心管（50 mL）中孵育，在动态培养条件下使BMSCs黏附于PLGA-HOPMs上。
    4. 将密封的50 mL离心管置于恒温无菌摇床（37 °C，90 rpm）中进行动态培养（参见材料表）。
      注：动态培养旨在提高BMSCs在支架上的黏附率，而非将微球（PMs）和细胞直接孵育在塑料培养板上。将细胞与PLGA微球加入50 mL无菌离心管中，在恒温无菌摇床（37 °C，90 rpm）中孵育，并每2天更换一次培养基。
  4. 进行活/死细胞双染检测。
    1. 用缓冲液冲洗载有细胞的微球三次，以去除未黏附在PLGA-HOPMs上的BMSCs。
    2. 将载有细胞的微球置于35 mm玻璃底培养皿中。向经PBS预洗的样品中加入1 mL染色缓冲液（参见材料表），其中分别含有1 µL钙黄绿素-AM和碘化丙啶（PI）。
    3. 采用共聚焦激光扫描显微镜对样品进行观察（参见材料表）。在相应检测器上开启488 nm和552 nm激发光源。进行z轴层叠分析时，通过显微镜的z轴移动设定z轴扫描范围，以捕获样品的不同层面。
      注：值得注意的是，也可根据需要选用其他染料进行分析。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

根据先前优化主要参数的研究1，将PLGA溶解于可挥发的DCM溶剂中。通过在超声探头处理下与明胶均质化，制备初乳W/O乳液。采用简化的共流微流控结构进行组装，其中使用注射器持续引入流体。此外，进行了充分的清洗步骤，以去除PLGA微球中的PVA和明胶（图1A，补充图1A,B）。随后，通过扫描电镜（SEM）观察PLGA-HOPMs的形貌特征。结果显示，PLGA-HOPMs具有较大的尺寸（350–500 µm），并带有任意尺寸的孔隙（10–100 µm）以及相互连通的窗口结构，有利于高效传输氧气和代谢废物（图1B）。这些形貌结果与已有报道一致1。

作为概念验证，将骨髓间充质干细胞（BMSCs）初步用于在PLGA-HOPMs中进行培养。人们认为，微球（PMs）的内部结构可允许细胞黏附，并在动态培养过程中确保细胞增殖。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

本文介绍了一种高效制备基于PLGA的结构（即PLGA-HOPMs）的策略。需要注意的是，制备过程中必须谨慎执行若干关键步骤，包括避免PLGA溶剂的挥发，以及在乳液制备期间轻柔调节超声功率至目标位置。此外，可通过适度调整20 mL注射器的液体出口，以解决乳化前驱体的相分离问题。然而，该方法存在一定的局限性：由于致孔剂的状态受环境温度影响，乳液的稳定性可能不理想。总体而言，液滴微流控平台的便捷组装可显著促进载细胞微凝胶的制备，适用于组织工程和药物筛选应用。PLGA因其为美国食品药品监督管理局（FDA）批准的药物递送材料，常被用作制备微球的递送载体。25此外，脂肪族聚酯具有无害的降解特性 通过 水解反应要么 体外 或 体内，这取决于合成过程中乳酸和乙醇酸的比例26.

为了制备PLGA-HOPMs，将水相和有机相通过超声探头均质化，形成水包油（W/O）乳液。随后，将该W/O乳液引入液滴微流控装置，在针尖处转变为水包油包水（W/O/W）液滴（<...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

SCL、YW、RKK 和 AZC 感谢国家自然科学基金委员会（NSFC，32071323、81971734 和 U1605225）以及福建省高校科技创 新团队计划提供的经费支持。YSZ 未获得上述任何项目的资助，也未接受任何形式的报酬；特此感谢布里格姆研究所（Brigham Research Institute）提供的支持。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
离心管Solarbio, 北京, 中国5 mL & 50 mL (无菌)
共聚焦激光扫描显微镜Leica, Wetzlar, 德国TCS SP8
二氯甲烷国药集团化学试剂有限公司, 上海, 中国20161110研究级
分配针Kindly, 上海, 中国26 G, 内径: 250 μm, 外径: 460 μm
DMEM/F-12Gibco; Life Technologies Corporation, Calsbad, 美国15400054DMEM/F-12 50/50, 1x (Dulbecco's
改良Eagle培养基/Ham's F12
50/50 混合液)，含L-谷氨酰胺
乙醇国药集团化学试剂有限公司, 上海, 中国20210918研究级
乙二胺四乙酸 (EDTA)-胰蛋白酶Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, 以色列胰蛋白酶 (0.25%), EDTA (0.02%)
胎牛血清 (FBS)Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, 以色列研究级
冷冻干燥机Bilon, 上海, 中国FD-1B-50
明胶Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, 美国lot# SZBF2870V来源于猪皮，A型
玻璃底培养皿Biosharp, 合肥, 中国BS-15-GJM, 35 mm
玻璃毛细管华欧, 江苏, 中国0.9-1.1 × 120 mm
恒温振荡培养箱智城, 上海, 中国ZWYR-200D
活死细胞染色成像试剂盒Solarbio, 北京, 中国60421211112活细胞呈绿色荧光 (激发/发射 488 nm/515 nm)；死细胞呈红色荧光 (激发/发射 570 nm/602 nm)
低速离心机湘仪, 湖南, 中国TD5A
磁控溅射仪日业电器有限公司, 苏州, 中国MSP-2S
微流注射泵Harvard Apparatus, Holliston, 美国Harvard Pump 11 Plus
青霉素-链霉素Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, 以色列2135250研究级
磷酸盐缓冲液 (PBS)赛维尔生物技术有限公司, 武汉, 中国GP21090181556PBS 1x, 细胞培养级, 不含钙, 不含镁
聚乳酸-共-乙醇酸Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, 美国lot# MKCF965166–107 kDa, 丙交酯:乙交酯 75:25
聚乙烯醇Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, 美国lot# MKCK426613-13 kDa, 98% 水解
PVC管申晨, 上海, 中国内径, ID: 1 mm
大鼠骨髓间充质干细胞Procell, 武汉, 中国
扫描电子显微镜Phenom pure, Eindhoven, 荷兰设定加速电压为 5 kV
医用注射器Kindly, 上海, 中国5 mL & 50 mL (带针头)
恒温水浴锅明翔, 深圳, 中国36 W
变压器日业电器有限公司, 苏州, 中国SZ-2KVA
超声细胞破碎仪JY 92-IID, Scientz, 宁波, 中国JY 92-IID
紫外固化胶卓立德, 佛山, 中国D-3100

参考文献

  1. Kankala, R. K., et al. Highly porous microcarriers for minimally invasive in situ skeletal muscle cell delivery. Small. 15 (25), 1901397(2019).
  2. Wang, Y., et al. Modeling endothelialized hepatic tumor microtissues for drug screening. Advanced Science. 7 (21), 2002002(2020).
  3. Li, Q., et al. Tripeptide-based macroporous hydrogel improves the osteogenic microenvironment of stem cells. Journal of Materials Chemistry B. 9 (30), 6056-6067 (2021).
  4. Liu, Y., et al. PLGA hybrid porous microspheres as human periodontal ligament stem cell delivery carriers for periodontal regeneration. Chemical Engineering Journal. 420, 129703(2021).
  5. Wei, P., Xu, Y., Zhang, H., Wang, L. Continued sustained insulin-releasing PLGA nanoparticles modified 3D-printed PCL composite scaffolds for osteochondral repair. Chemical Engineering Journal. 422, 130051(2021).
  6. Sang, S., et al. Biocompatible chitosan/polyethylene glycol/multi-walled carbon nanotube composite scaffolds for neural tissue engineering. Journal of Zhejiang University-Science B. 23 (1), 58-73 (2022).
  7. Ghasemian, M., et al. Hydrodynamic characterization within a spinner flask and a rotary wall vessel for stem cell culture. Biochemical Engineering Journal. 157, 107533(2020).
  8. Wang, Y., et al. Minimally invasive co-injection of modular micro-muscular and micro-vascular tissues improves in situ skeletal muscle regeneration. Biomaterials. 277, 121072(2021).
  9. Kang, S. W., Bae, Y. H. Cryopreservable and tumorigenic three-dimensional tumor culture in porous poly(lactic-co-glycolic acid) microsphere. Biomaterials. 30 (25), 4227-4232 (2009).
  10. Fan, D., et al. Mesoporous silicon-PLGA composite microspheres for the double controlled release of biomolecules for orthopedic tissue Engineering. Advanced Functional Materials. 22 (2), 282-293 (2012).
  11. Xu, Y., et al. Metabolism balance regulation via antagonist-functionalized injectable microsphere for nucleus pulposus regeneration. Advanced Functional Materials. 30 (52), 2006333(2020).
  12. Yao, R., Zhang, R., Lin, F., Luan, J. Injectable cell/hydrogel microspheres induce the formation of fat lobule-like microtissues and vascularized adipose tissue regeneration. Biofabrication. 4 (4), 045003(2012).
  13. Sikavitsas, V. I., Bancroft, G. N., Mikos, A. G. Formation of three-dimensional cell/polymer constructs for bone tissue engineering in a spinner flask and a rotating wall vessel bioreactor. Journal of Biomedical Materials Research. 62 (1), 136-148 (2002).
  14. Kim, T. K., Yoon, J. J., Lee, D. S., Park, T. G. Gas foamed open porous biodegradable polymeric microspheres. Biomaterials. 27 (2), 152-159 (2006).
  15. Wang, C. Y., Liao, H. F., Sheu, D. C. Enhancement of recombinant human macrophage colony-stimulating factor production using culture systems with porous polymeric microspheres. Journal of the Taiwan Institute of Chemical Engineers. 41 (2), 203-208 (2010).
  16. Amoyav, B., Benny, O. Microfluidic based fabrication and characterization of highly porous polymeric microspheres. Polymers. 11 (3), 419(2019).
  17. Zhang, H., et al. Microfluidic fabrication of inhalable large porous microspheres loaded with H2S-releasing aspirin derivative for pulmonary arterial hypertension therapy. Journal of Controlled Release. 329, 286-298 (2021).
  18. Qu, M., et al. Injectable open-porous PLGA microspheres as cell carriers for cartilage regeneration. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 109 (11), 2091-2100 (2021).
  19. Zheng, Y., et al. Microfluidic droplet-based functional materials for cell manipulation. Lab on a Chip. 21 (22), 4311-4329 (2021).
  20. Kawakatsu, T., Kikuchi, Y., Nakajima, M. Regular-sized cell creation in microchannel emulsification by visual microprocessing method. Journal of the American Oil Chemists' Society. 74 (3), 317-321 (1997).
  21. Yu, Y., Shang, L., Guo, J., Wang, J., Zhao, Y. Design of capillary microfluidics for spinning cell-laden microfibers. Nature Protocols. 13 (11), 2557-2579 (2018).
  22. Ye, B., et al. Photonic crystal microcapsules for label-free multiplex detection. Advanced Materials. 26 (20), 3270-3274 (2014).
  23. Zhong, Z., et al. Zn/Sr dual ions-collagen co-assembly hydroxyapatite enhances bone regeneration through procedural osteo-immunomodulation and osteogenesis. Bioactive Materials. 10, 195-206 (2022).
  24. Poole, C. A., Brookes, N. H., Clover, G. M. Keratocyte networks visualized in the living cornea using vital dyes. Journal of Cell Science. 106 (2), 685-692 (1993).
  25. Gentile, P., Chiono, V., Carmagnola, I., Hatton, P. V. An overview of poly(lactic-co-glycolic) acid (PLGA)-based biomaterials for bone tissue engineering. International Journal of Molecular Sciences. 15 (3), 3640-3659 (2014).
  26. Lanao, R. P. F., et al. Physicochemical properties and applications of Poly(lactic-co-glycolic acid) for use in bone regeneration. Tissue Engineering Part B-Reviews. 19 (4), 380-390 (2013).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

PLGA微球细胞递送组织再生可注射支架乳液形成超声乳化冻干程序干细胞培养
制备高开孔多孔微球（HOPMs） 通过 微流控技术
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。