肠道来源的微生物代谢物具有多方面的影响，可导致动物产生复杂的行为变化。本文旨在提供一种逐步解析肠道来源微生物代谢物对大脑作用的方法 通过 脑室内给药 通过 引导套管
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
肠道微生物群及其代谢物对宿主生理和行为的影响在本十年内得到了广泛研究。大量研究表明，肠道微生物群衍生的代谢物通过复杂的肠-脑通路调节宿主大脑介导的生理功能。短链脂肪酸（SCFAs）是肠道微生物组在发酵膳食纤维过程中产生的主要细菌代谢产物。肠道分泌的SCFAs可在外周多个部位发挥作用，由于SCFAs受体分布广泛，可影响免疫、内分泌和神经反应。因此，通过口服或腹腔注射SCFAs的方式，难以区分其对中枢和外周的作用。本文介绍了一种基于视频的方法，用于探究SCFAs在大脑中的功能作用 关键词：肠道微生物群，短链脂肪酸，肠-脑轴，代谢物，神经功能，免疫调节，内分泌反应 通过 在自由活动的小鼠中植入引导套管。通过控制灌注体积和速率，可调节脑内短链脂肪酸（SCFAs）的含量和类型。该方法可为科学家提供一种研究肠道来源代谢物在脑功能中作用的途径。
引言
人体胃肠道内栖息着多种多样的微生物，这些微生物影响着宿主1,2,3这些肠道细菌在利用宿主摄入的膳食成分时，可分泌肠道来源的代谢产物4,5有趣的是，肠道代谢物中未在周围组织被代谢的部分可被转运至其他器官 通过 循环6值得注意的是，这些分泌的代谢物可作为肠-脑轴的介质，肠-脑轴是指中枢神经系统与肠道之间存在的双向通信。7先前的研究表明，肠道来源的代谢物能够调节动物的复杂行为和情绪8,9,10,11.
短链脂肪酸（SCFAs）是肠道微生物群在发酵膳食纤维和不可消化碳水化合物过程中产生的主要代谢产物6。乙酸、丙酸和丁酸是肠道中最丰富的三种SCFAs
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
所有实验方案和动物护理程序均经中国台湾国立成功大学（NCKU）机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准。
1. 实验动物的准备
- 从供应商处获取6-8周龄的野生型C57BL/6JNarl雄性小鼠。
- 将小鼠饲养在标准小鼠笼中，提供标准小鼠饲料和灭菌水 随意摄取.
注：国立成功大学实验动物中心的饲养条件为温度22 ± 1 °C，湿度55% ± 10%，光照周期为13小时光照/11小时黑暗。
2. 立体定位手术
- 准备并灭菌立体定位仪、手术器械及相关物品。
注意：所有将直接接触手术部位的物品均应灭菌，以避免感染。 - 将小鼠置于含1%-5%异氟烷的氧气中，放入聚甲基丙烯酸甲酯（Plexiglas）麻醉箱内进行麻醉。
注意：密切观察小鼠，确保其呼吸频率维持在每秒约一次。 - 将小鼠从麻醉 chamber 中取出。使用宠物修剪器剃除手术部位（小鼠头部）的毛发。将小鼠的门齿固定在立体定位仪的门齿夹具杆上，将其置于立体定位仪框架中。用鼻罩覆盖小鼠的鼻部。
- 在整个立体定位手术过程中，使用1%-2.5%异氟烷与氧气混合对小鼠进行麻醉。评估小鼠的痛觉反应 通过
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
在小鼠完成脑部侧脑室植入导管并恢复1周后，通过注入短链脂肪酸（SCFAs）来评估其在新环境笼子中的运动活动。将小鼠置于新环境笼子中，并在前5分钟内通过已植入侧脑室的商用导管以7 nL/s的输送速率向脑内注入2,100 nL的SCFAs或人工脑脊液（ACSF）。注入完成后，继续记录30分钟的新环境笼子中的运动活动。注入SCFAs与ACSF后，小鼠在新环境笼子中的运动活动未见显著差异（图6）（每组n = 2只小鼠；数据以均值±标准误表示，采用双因素方差分析进行统计分析）。
为验证引导套管在脑区植入的准确性，将荧光神经示踪剂注入小鼠体内 通过 以与短链脂肪酸相同的体积和输注速率（2,100 nL，5 分钟内；7 nL/s）注入示踪染料。注药30分钟后取脑组织进行组织学分析。荧光染料在小鼠脑侧脑室及周围区域被检测到。图7A）。在相同条件下，将不锈钢导管植入小鼠脑侧脑室，用于神经示踪剂的灌注。与导管类似，结果表明，即使通过不锈钢导管灌注，荧光染料信号仍可在.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
肠道来源的代谢物已被发现与脑部介导的疾病相关，但其精确机制尚不明确，部分原因在于这些代谢物在体内具有多个结合位点6,12,24。先前的研究表明，短链脂肪酸（SCFAs）可在体内多个部位作为G蛋白偶联受体的配体、表观遗传调控因子以及能量生成的来源6,12。为了规避来自外周系统（如免疫细胞、激素和自主神经系统）的混杂因素，本研究建立了一种方法，即通过植入导向套管，对自由活动的小鼠进行脑室内注射短链脂肪酸。此外，还对套管植入位置和灌注靶区进行了验证，以探索可能受短链脂肪酸影响的脑区。综上所述，本文提供了一种精确、细致且经过验证的方法，可用于将肠道来源的代谢物递送至脑内，推动肠-脑轴相关研究。
通过导管套管向动物脑室内递送药物和化学物质的方法已得到充分建立
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者与本工作无利益冲突。
致谢
我们感谢中国台湾国立成功大学（NCKU）实验动物中心工作人员对实验动物的悉心照料。本研究得到了中国台湾振兴医院教授黄昆彦教育基金为C.-W.L.提供的奖学金支持；中国台湾科技部（MOST）经费支持：为T.-H.Y.提供的大学生研究计划项目（MOST 109-2813-C-006-095-B）；为W.-L.W.提供的项目（MOST 107-2320-B-006-072-MY3；109-2314-B-006-046；110-2314-B-006-114；110-2320-B-006-018-MY3）；以及中国台湾教育部高等教育深耕计划对国立成功大学大学发展总部为W.-L.W.提供的经费支持。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 材料 | |||
| Advil Liqui-Gels Solubilized Ibuprofen A2:D41 | Pfizer | n/a | |
| Alexa Fluor 488 驴抗兔抗体 | ThermoFisher Scientific | A-21206 | |
| 抗荧光金抗体（兔多克隆） | Millipore | AB153-I | |
| 瓶顶式真空滤器，500 mL，0.22 μm，PES，无菌 | NEST | 121921LA01 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | ACSF：0.14 g/L |
| 氯己定擦洗液 2% | Phoenix | NDC 57319-611-09 | |
| 氯己定溶液 | Phoenix | NDC 57319-599-09 | |
| 商用假插管 | RWD Life Science | 62004 | Single_OD 0.20 mm/ M3.5/G = 0.5 mm |
| 商用导引套管 | RWD Life Science | 62104 | Single_OD 0.41 mm-27G/ M3.5/C = 2.5 mm |
| 商用注射器 | RWD Life Science | 62204 | Single_OD 0.21 mm-33G/ 与 M3.5 配合使用/C = 3.5 mm/G = 0.5 mm |
| D-(+)-葡萄糖 | Sigma-Aldrich | G8270 | ACSF：0.61 g/L |
| 牙科丙烯酸树脂 | HYGENIC | n/a | |
| 固定螺钉 | RWD Life Science | 62521 | |
| 含 DAPI 的 Fluoroshield 封片剂 | Abcam | AB104139 | |
| 马血清 | ThermoFisher Scientific | 16050130 | |
| 胰岛素注射器 | BBraun | XG-LBB-9151133S-1BX | 1 mL |
| 异氟烷 | Panion & BF biotech | DG-4900-250D | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | ACSF：0.19 g/L |
| 酮洛芬 | Swiss Pharmaceutical | n/a | |
| 利多卡因 | AstraZeneca | n/a | |
| 低熔点琼脂糖 | Invitrogen | 16520 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | ACSF：0.19 g/L |
| 显微镜盖玻片 | MARIENFELD | 101242 | |
| 显微镜载玻片 | ThermoFisher Scientific | 4951PLUS-001E | |
| 轻质矿物油，白色 NF | Macron Fine Chemicals | MA-6358-04 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | ACSF：7.46 g/L |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282 | ACSF：0.18 g/L |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | ACSF：1.76 g/L |
| n-丁基氰基丙烯酸酯粘合剂（组织粘合胶） | 3M | 1469SB | 3M Vetbond |
| 神经示踪剂 | Santa Cruz | SC-358883 | FluoroGold |
| 多聚甲醛 | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| 聚乙烯管 | RWD Life Science | 62329 | 外径 1.50 mm，内径 0.50 mm；外径 1.09 mm，内径 0.38 mm |
| Puralube Vet（眼用）软膏 | Dechra | 12920060 | |
| 乙酸钠 | Sigma-Aldrich | S2889 | SCFAs：13.5 mM |
| 叠氮化钠 | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| 丁酸钠 | Sigma-Aldrich | B5887 | SCFAs：8 mM |
| 丙酸钠 | Sigma-Aldrich | P1880 | SCFAs：5.18 mM |
| 不锈钢导引套管 | Chun Ta stainless steel enterprise CO., LTD. | n/a | 外径 0.63 mm；本地供应商 |
| 不锈钢注射器 | Chun Ta stainless steel enterprise CO., LTD. | n/a | 外径 0.3 mm；假插管由注射器制成；本地供应商 |
| 强力胶 | Krazy Glue | KG94548R | |
| 吐温 X-100 | Merck | 1.08603.1000 | |
| 设备 | |||
| 套管固定架 | RWD Life Science | B485-68217 | |
| 天花板摄像头 | FOSCAM | R2 | |
| 数字立体定位仪 | Stoelting | 51730D | |
| 解剖显微镜 | INNOVIEW | SEM-HT/TW | |
| 玻璃珠灭菌器 | RWD Life Science | RS1501 | |
| 加热垫 | Stoelting | 53800M | |
| Leica 显微镜 | Leica | DM2500 | |
| 显微镊 | ROBOZ | RS-5136 | 带齿，轻微弯曲；超精细；尖端宽度 0.5 mm；4" 长度 |
| 显微剪刀 | ROBOZ | RS-5918 | 4.5" 角度锋利 |
| 微量注射控制器 | World Precision Instruments (WPI) | MICRO2T | SMARTouch 控制器 |
| 微量注射泵 | World Precision Instruments (WPI) | UMP3T-1 | UltraMicroPump3 |
| 微升注射器 | Hamilton | 80014 | 10 µL |
| 双光纤冷光源光纤 | Step | LGY-150 | 本地供应商 |
| 宠物修剪器 | WAHL | 09962-2018 | |
| 异氟烷挥发器 | Step | AS-01 | 本地供应商 |
| 振动切片机 | Leica | VT1000S | |
| 软件 | |||
| 动物行为视频追踪软件 | Noldus | EthoVision | 版本：15.0.1416 |
| Leica Application Suite X 软件 | Leica | LASX | 版本：3.7.2.22383 |
参考文献
- Lynch, J. B., Hsiao, E. Y. Microbiomes as sources of emergent host phenotypes. Science. 365 (6460), 1405-1409 (2019).
- Dinan, T. G., Cryan, J. F. The microbiome-gut-brain axis in health and disease. Gastroenterology Clinics of North America. 46 (1), 77-89 (2017).....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
