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方法文章

控制 白纹伊蚊 蚊子幼虫 Carpesium abrotanoides L.

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DOI：

10.3791/63976

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2022年8月23日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Qiannan Medical College for Nationalities, 2Key Laboratory of Human Parasitic Diseases in Qiannan Prefecture, 3Guizhou Medical University

本文内容

摘要

使用 Carpesium abrotanoides L. plant 用于蚊虫幼虫控制可有效降低 Aedes albopictus 蚊虫种群控制，并为设计植物源杀虫剂提供基础。

摘要

作为登革热、黄热病及其他蚊媒疾病的重要传播媒介，Aedes albopictus（双翅目：Culicidae）在全球范围内广泛分布，对公共卫生构成严重威胁。迄今为止，鉴于蚊虫对杀虫剂抗性迅速增强，开发新型植物源杀虫剂以控制和减少Ae. albopictus数量已成为一项紧迫而关键的任务。因此，为探究C. abrotanoides L.植物煎剂对蚊幼虫的杀灭效果，我们检测了不同浓度（60 mg/mL、120 mg/mL 和 180 mg/mL）的煎剂在一系列时间点（12 h、24 h、36 h 和 48 h）处理后幼虫的死亡率。研究发现，使用180 mg/mL的C. abrotanoides L.煎剂处理24 h后，蚊虫死亡率相对于对照组达到92.35%；同时，120 mg/mL浓度下处理36 h亦可杀死超过90%的蚊虫。此外，将金鱼（Carassius auratus）暴露于120 mg/mL的C. abrotanoides L.煎剂中36 h后，未出现死亡个体。死亡率评估表明，该浓度不会造成生态环境污染的有害水平。本研究提供了一种潜在的植物候选材料，可用于设计植物源杀虫剂。此外，这些方法也可经调整后应用于其他蚊种的研究。

引言

Aedes albopictus，又称“亚洲虎蚊”，可通过吸食人和动物的血液传播多种疾病，如登革热、基孔肯雅热和寨卡病毒病1. 由于广泛分布的 白纹伊蚊近年来，登革热等蚊媒疾病的疫情日益严重，对全球人民的生命健康构成严重威胁2目前，大多数蚊媒疾病尚无有效的疫苗或特异性治疗药物，使用化学杀虫剂灭蚊仍是控制蚊媒疾病的主要手段。3化学防治方法通过使用化学杀虫剂能够快速高效地杀灭蚊虫，已成为蚊媒控制的主要手段。4然而，杀虫剂的长期大规模使用已导致害虫对杀虫剂的敏感性下降 白纹伊蚊 对杀虫剂及其抗药性的研究已成为控制蚊媒疾病的最主要障碍。因此，开发一种高效、安全且环保的新型蚊虫杀虫剂具有重要的现实意义。

在自然界中，植物是主要的初级生产者。昆虫和许多动物以植物为食。当植物遭受各种“自然和人为灾害”时，会产生次生代谢物以维持生存。这些物质通常具有抵抗其他生物取食、抗病和抗虫的能力。它们不仅对多种害虫有效，而且对环境的毒性风险较低5。 Carpesium abrotanoides L. 是菊科 Carpesium abrotanoides 属的一种多年生草本植物，又称“兔儿草”、“鹿活草”、“野烟叶”等，广泛分布于中国及东亚地区。其茎叶在这些地区可用作杀虫剂，并用于治疗擦伤和发热6。其果实在中国民间俗称“北鹤虱”，用于治疗绦虫和 Ascaris lumbricoides（人蛔虫）感染7,8。据报道，该植物富含单萜、倍半萜、酚类等特征性成分，具有显著的药理活性，如抗炎、抗真菌、抗寄生虫、抗肿瘤和抗病毒作用7。近期研究发现，其对甜菜夜蛾 Spodoptera exigua 具有拒食作用9，对玉米象 Sitophilus zeamais 具有接触毒性10，对亚洲带绦虫 Taenia asiatica 的囊尾蚴具有杀灭能力8，同时对黏虫和小菜蛾 Plutella xylostella 具有拒食活性和接触毒性11。目前，关于 C. abrotanoides L. 对某些寄生虫、农业害虫和卫生害虫的毒理作用已取得初步进展，可用于控制白纹伊蚊 Aedes albopictus 的幼虫。

本研究讨论了用于控制的实验方案 白纹伊蚊 幼虫与 C. abrotanoides L. 在本方案中， C. abrotanoides L. decoction 用于处理四龄幼虫 Ae. albopictus，幼虫在处理后出现死亡 C. abrotanoides L. 在不同浓度（60 mg/mL、120 mg/mL 和 180 mg/mL）下于一系列时间点（12 h、24 h、36 h 和 48 h）的杀灭效应测定 C. abrotanoides L. 煎剂对 白纹伊蚊 幼虫为高效、低毒且使用环境友好型植物源杀虫剂的进一步蚊虫防控提供了新思路。

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方案

用于喂养雌性蚊子的山羊血采自中国贵州省都匀市的一家当地屠宰场，并遵循中国贵州省都匀市黔南州人类寄生虫病重点实验室的伦理准则和规定进行使用。

1. 试剂的准备

注意：有关本实验方案中所用仪器、试剂及其他耗材的列表，请参见材料表。

  1. 提取与鉴定 C. abrotanoides L.
    1. 采集整株草本植物 C. abrotanoides L. 全草 C. abrotanoides L. 本研究于2021年4月采集自中国贵州省三都水族自治县（N: 25.95，E: 107.87）。采集地照片来自 C. abrotanoides L. in 图1.
      注意：根据资源分布、药用特性、组织结构以及理化鉴定特征 C. abrotanoides L.，鉴定 C. abrotanoides L. 全株高30-100厘米，茎直立，上部多分枝，茎下部叶互生，稍具叶柄，叶片椭圆形，长10-15厘米，宽5-8厘米，边缘全缘或具不规则锯齿；茎上部叶近无柄，长椭圆形，向上渐小，头状花序腋生，近无柄，花下垂，具特殊气味，味淡而微辛。该植物被鉴定为 C. abrotanoides L. 由本机构附属的中医专业教师。
  2. C. abrotanoides L. 清洗、干燥和研磨
    1. 去除收集样品中的杂质，如枯叶和土壤 C. abrotanoides L. 并清洗干净。在通风条件下晾干10-15天，或在95 °C的干燥箱中干燥6 h。
      注意：在干燥过程中 C. abrotanoides L.，需要将其翻转，以确保其均匀干燥。如果 C. abrotanoides L. 组织在研磨过程中不易破碎时，可再次干燥后进行研磨。
  3. 制备 C. abrotanoides L. 精华煎剂
    1. 称取 360 g 的 C. abrotanoides L. 精制粉末，加入1000 mL蒸馏水，用文火（功率800 W）煎煮2小时.
    2. 用普通滤纸过滤煎液，然后在旋转蒸发仪中浓缩制成浸膏。用蒸馏水将浸膏稀释至1000 mL，并制备成 C. abrotanoides L.含原药材360 mg/mL的精制水煎液
    3. 取 50 mL、100 mL 和 150 mL 的 C. abrotanoides L. 将精制水煎液稀释，配制成每150 mL分别含原药材120 mg/mL、240 mg/mL和360 mg/mL的水煎液，备用。
      ​注意：煮沸过程中应严格控制加热温度。煮沸后调低火力，使液体保持在 100 °C 并维持微沸状态。

2. 蚊虫样品制备

  1. 蚊虫来源
    1. 样品采集 白纹伊蚊 幼虫。在本研究中， 白纹伊蚊 2020年8月，在中国贵州省都匀市（北纬26.25，东经107.52）的居民区采集了幼虫。
    2. 根据分布、幼虫和成虫的形态特征 白纹伊蚊，鉴定 白纹伊蚊 如下：栉水母动物门的基部为 白纹伊蚊 幼虫具有细长的尾部；尾鞍不完整；呼吸管黑色，短而粗；成虫的 白纹伊蚊 为中小型蚊子。雌蚊体型中等，呈黑色。中胸盾片具有一条白色纵纹，通常在后端逐渐变细，并在小盾片前区呈叉状分叉。足部关节基部有白色环纹，第5节足关节全部或大部分为白色。这些蚊子被鉴定为 白纹伊蚊 由本单位寄生虫学与蚊类专业教师讲授。
    3. 在25 ± 1 °C温度、70% ± 10%相对湿度条件下常规饲养，以80 W荧光灯作为光源（光:暗 = 14 h:10 h）。
    4. 用鸡肝粉喂养幼虫，用10%蔗糖水喂养成虫。
  2. 蚊虫卵的采集
    1. 当幼虫的 白纹伊蚊 发育成蛹后，使用一次性塑料巴斯德吸管将蛹吸出，并转移至成蚊饲养笼中。
    2. 雌雄成蚊羽化后3-5天内进行交配。此时，让雌蚊吸血4-8小时。
      注意：加入抗凝剂的血液被置于培养皿中，用37 °C温水加热，并覆盖一层纱布，供雌蚊吸血。
    3. 收集卵子 白纹伊蚊 使用一个集卵杯（自制：300 mL 直壁不透明塑料杯，内盛 250 mL 蒸馏水，将滤纸沿杯内壁半周浸入水中）。
      注意：虫卵的 白纹伊蚊 可保存3至6个月。
  3. 蚊子孵化与喂养
    1. 在实验过程中， 白纹伊蚊 通常提前1周孵化。将卵置于 白纹伊蚊 在瓷盘中加入1000 mL自来水，静置超过24小时。虫卵在1至2天内孵化成幼虫。
    2. 幼虫每1-2天蜕皮一次，即增加一个龄期。选取在实验室中连续繁殖2-3代、未接触任何化学杀虫剂的试虫，在其三龄末期或四龄初期选取1000头幼虫用于试验。
      ​注意：若幼虫密度过高，需将其分装至多个培养皿中，以保证幼虫正常生长。

3. 毒性效应的检测 C. abrotanoides L. 煎煮对 Ae. albopictus 通过浸渍法处理幼虫

  1. 设置分组
    1. 实验组：制备三种药物浓度（120 mg/mL、240 mg/mL 和 360 mg/mL）的C. abrotanoides L. 煎剂（50 mL）。
    2. 空白对照组：使用与药液等体积的去氯水（自制：自来水静置超过24小时）。
    3. 阳性对照组：配制常用化学杀虫剂溴氰菊酯，终浓度为0.05 mg/mL。
  2. 加药
    1. 取数个容积大于200 mL的一次性塑料杯，在50 mL去氯水中各加入35只处于三龄末期或四龄初期的Ae. albopictus 幼虫。
    2. 实验组中加入50 mL各浓度的C. abrotanoides L. 精制水煎剂，轻轻振荡混匀，总体积为100 mL。此时C. abrotanoides L. 精制水煎剂的终浓度分别为60 mg/mL、120 mg/mL 和 180 mg/mL。
    3. 空白对照组中加入50 mL去氯水，总体积为100 mL，并标记为空白对照。
    4. 阳性对照组中加入50 mL浓度为0.1 mg/mL的溴氰菊酯溶液，轻轻振荡混匀，总体积为100 mL，终浓度为0.05 mg/mL，并标记为阳性对照。
  3. 观察
    1. 将标记好的塑料杯轻轻转移至观察室，在相同饲养环境下，分别于12 h、24 h、36 h 和 48 h 记录各实验组和对照组中Ae. albopictus 幼虫的死亡数。在显微镜下观察死亡个体，并与正常Ae. albopictus 幼虫进行比较。
    2. 在上述观察时间点，若用尖细针轻搅幼虫后其无法逃逸或无反应，则判定为死亡。重复实验三次。
      ​注意：若对照组幼虫死亡率超过20%，则实验结果无效，需重新进行。整体实验流程总结于图2中。

4. 室外模拟实验

  1. 应用三种浓度的 C. abrotanoides L. 汤剂 白纹伊蚊 在室外条件下观察幼虫死亡情况，比较其毒效与实验室条件下的差异。
  2. 应用三种浓度的 C. abrotanoides L. 在室外条件下，将精制水煎剂给予野生鲫鱼，观察其对鲫鱼生长的影响，以初步判断该制剂是否具有影响 C. abrotanoides L.精制水煎剂对生态环境造成破坏。
    ​注意：浓度与步骤 3.2.2 中提到的浓度相似。所用时间点分别为 12 h、24 h、36 h 和 48 h。通过比较死亡率来判断模拟场实验的效果 Ae. albopictus 处理 C. abrotanoides L. 在实验室饲养条件和室外自然条件下的煎煮

5. 统计分析

  1. 定量数据以均值 ± 标准差（Mean ± SD）表示，计数数据以百分比（%）表示。
    注意：此处使用的统计推断方法为 p < 0.05，差异具有统计学意义。
  2. 使用适当的软件对数据及三种不同浓度的毒性进行统计分析 C. abrotanoides L. 汤剂 白纹伊蚊 幼虫被用于初步确定哪种浓度的煎剂对目标生物的毒性最强 白纹伊蚊 幼虫

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结果

此处，整株草本植物 C. abrotanoides L. 本研究中的样本采自野外（图1）。在鉴定出 C. abrotanoides L.，该汤剂的煎煮液 C. abrotanoides L. 通过煎煮法获得（图2）并配制成不同浓度（60 mg/mL、120 mg/mL 和 180 mg/mL）。将其应用于 白纹伊蚊 采用幼虫浸渍法处理幼虫，发现24小时后，120 mg/mL条件下 C. abrotanoides L. 煎煮处理可使死亡的幼虫变黑，并通过形态学评估观察到僵硬现象（图3）。随后，在不同时间点（12 h、24 h、36 h 和 48 h）检测了幼虫经不同浓度（60 mg/mL、120 mg/mL 和 180 mg/mL）药液处理后的死亡率。结果发现，120 mg/mL 浓度处理 36 h 可...

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讨论

目前，Ae. albopictus 已成为全球100种最具入侵性的物种之一。根据世界卫生组织（WHO）的统计数据，2020年亚洲受Ae. albopictus影响最严重的地区约占全球疾病负担的70%12。作为登革热、黄热病及其他蚊媒传播疾病的重要传播媒介，Ae. albopictus可在世界范围内广泛分布，对公共卫生构成严重威胁。因此，开发新型植物源杀虫剂以控制和减少Ae. albopictus数量，可提供更安全且环境友好的防控选择。本研究建立了一种制备植物源杀虫剂的新方法，用于评估C. abrotanoides L. 对Ae. albopictus幼虫的毒杀效应，旨在筛选出一种具有潜力的植物候选物种，为设计植物源杀虫剂提供依据。

作为一种传统中药 C. abrotanoides L. 可用于治疗瘀伤和发热。其提取物对环境友好，可作为安全性良好的植物源杀虫剂使用。已有研究表明...

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披露

作者声明无任何利益冲突。

致谢

感谢明尼苏达大学的王新茹博士（Dr. Xin-Ru Wang）提供的深刻建议和 指导。本工作得到黔南民族医学高等专科学校科研基金（Qnyz202112、QNYZ202205）以及贵州省卫生健康委员会科技基金（qwjh [2022] No. 101，项目编号 gzwkj2023-251）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
丙酮（分析纯）上海申波化学有限公司
鲫鱼广州云峰水产养殖有限公司
鸡肝粉自制
去氯水自制自来水静置超过24小时
溴氰菊酯原药南京乐生生物科技有限公司纯度：94.62%
一次性塑料杯贵州富强科技包装有限公司220ML-A1
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参考文献

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