本方案描述了从小鼠皮下脂肪中分离前脂肪细胞、将其分化为成熟脂肪细胞以及诱导胰岛素抵抗的方法。通过蛋白质印迹法检测胰岛素信号通路中相关蛋白的磷酸化/活化水平，以评估胰岛素作用。该方法可直接测定原代脂肪细胞中的胰岛素抵抗/敏感性。
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本文内容
摘要
摘要
胰岛素抵抗是指胰岛素对其靶细胞的作用减弱，通常源于胰岛素受体信号传导的下降。胰岛素抵抗参与了2型糖尿病（T2D）及其他在全球范围内高发的肥胖相关疾病的发生发展。因此，阐明胰岛素抵抗的潜在机制具有重要意义。已有多种模型被用于研究胰岛素抵抗 体内 和 体外；原代脂肪细胞是研究胰岛素抵抗机制、鉴定可拮抗该状态的分子以及胰岛素增敏药物分子靶点的理想选择。本文中，我们建立了使用经肿瘤坏死因子-α（TNF-α）处理的培养原代脂肪细胞构建胰岛素抵抗模型的方法。
通过磁性细胞分离技术，从小鼠皮下脂肪组织经胶原酶消化后分离获得脂肪细胞前体细胞（APCs），并将其分化为原代脂肪细胞。随后，使用促炎性细胞因子TNF-α处理以诱导胰岛素抵抗，该因子可降低胰岛素信号通路中相关蛋白的酪氨酸磷酸化/活化水平。通过蛋白质印迹法（western blot）定量检测胰岛素受体（IR）、胰岛素受体底物（IRS-1）和蛋白激酶B（AKT）的磷酸化水平下降情况。该方法为研究介导脂肪组织中胰岛素抵抗的分子机制提供了优良工具。
引言
胰岛素是由胰岛β细胞产生的一种合成代谢激素，是调节葡萄糖和脂质代谢的关键因子。在众多功能中，胰岛素可调节葡萄糖摄取、糖原合成、糖异生、蛋白质合成、脂质生成以及脂解作用1。胰岛素与其受体（IR）结合后最初的分子信号是激活IR内在的酪氨酸蛋白激酶活性2，导致其自身磷酸化3 ，并继而激活一类被称为胰岛素受体底物（IRS）的蛋白质家族；这些底物与衔接蛋白结合，引发一系列蛋白激酶的级联激活4。胰岛素激活两条主要的信号通路：磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）-蛋白激酶B（AKT） 和Ras-丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）。前者构成一个主要的分支点或节点4,5 ，可激活多种下游效应分子，参与包括能量物质稳态调节在内的多种生理功能；而后者则主要调控细胞生长与分化4,6。胰岛素的作用最终取决于细胞类型及生理环境7。
胰岛素响应性代谢组织之一是脂肪组织。白色脂肪组织是人类和啮齿类动物体内最丰富的脂肪类型....
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方案
所有啮齿类动物实验均经墨西哥国立自治大学神经生物学研究所生物伦理委员会批准，方案编号为075。
1. 小鼠脂肪细胞前体细胞的分离
- 处死 8–10 周龄的雄性 C57BL/6 小鼠（例如通过 CO2 吸入并随后进行颈椎脱位）（每次分离使用四只动物）。用 70% 乙醇擦拭小鼠进行消毒，并在处死后立即获取脂肪组织。
注意：在啮齿类动物安乐死后，应立即分离脂肪组织，并在无菌超净工作台内完成所有操作步骤。小鼠饲养于 12 小时光照/12 小时黑暗循环条件下，可自由摄食和饮水。 - 从小鼠中解剖出腹股沟皮下脂肪组织。仅去除脂肪组织，避免带入肌肉、皮肤或其他任何组织，并将其收集至含有 15 mL I 型胶原酶溶液（1.5 mg/mL）的 50 mL 圆锥形离心管中，置于冰上。将 I 型胶原酶溶解于含高糖和 1% 牛血清白蛋白（BSA）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中，并通过 0.2 µm 注射器滤器过滤。
- 使用无菌手术剪将脂肪组织剪成小块，然后在 37 °C 条件下，于旋转摇床（150 rpm）中用 I 型胶原酶溶液孵育 30 分钟进行消化（将含有脂肪和胶原酶的离心管水平放置，以增大振荡接触面积）。每 10 分钟检查一次消化情况，确保消化有效进行（可见组织降解），并防止过度消化（参见补充图 S1）。 <....
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结果
近年来，肥胖症和2型糖尿病（T2D）患病率的上升促使人们深入研究介导脂肪组织胰岛素抵抗的机制。通过本文所述的实验方案，可将脂肪前体细胞（APCs）诱导分化为成熟脂肪细胞，以评估其胰岛素抵抗与敏感性。当APCs达到融合状态后，需10天时间完成向成熟脂肪细胞的分化，并通过TNF-α诱导产生胰岛素抵抗（图1）。
APCs 呈现成纤维细胞样的形态，表现为扁平且细长的形状，并在接种后 48 小时内完成对培养板的贴壁（图 2A）。APCs 需要 2–5 天达到 80% 汇合度（具体时间取决于接种的细胞数量），此时通过加入诱导分化培养基启动分化过程（图 2A）。在接下来的 6–8 天内，开始出现成熟的脂肪细胞。分化后的脂肪细胞具有圆形的形态特征，并在细胞内积累脂滴。在分化过程结束时，多达 80% 的细胞完成分化（图 2B）。
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讨论
本文提供了一种利用经TNF-α处理的原代脂肪细胞培养体系研究胰岛素抵抗的方法。该模型的优势在于，原代脂肪细胞可在定义明确的条件下长期培养，并能严格控制细胞所处的环境因素26。实验周期为15至20天，尽管不同实验间脂肪细胞分化比例可能存在差异。与细胞系相比，原代脂肪细胞具有优势，因其未在体外持续扩增，更能真实反映其来源组织的细胞异质性27。此外，利用原代脂肪细胞可研究来自不同生理-病理背景供体的细胞，例如瘦型与肥胖型、男性与女性、年轻与年老个体，以及来自不同脂肪组织部位的细胞。该方法的另一优势在于，可在分离前脂肪细胞（APCs）后，建立来自CRE和基因敲除小鼠的细胞系。
在 APCs 的分离与分化过程中，一个可能的问题是这些细胞可能会失去分化能力，这种情况很可能在分化过程开始时细胞融合度超过 80% 时发生。培养基的更换也应非常轻柔，尤其是在脂质积累之后，因为已分化的脂肪细胞容易从培养皿上脱落。此外，每一批次的胶原酶都必须检测其消化效率、细胞得率以及细胞毒性
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
感谢Daniel Mondragón、Antonio Prado、Fernando López-Barrera、Martín García-Servín、Alejandra Castilla和María Antonieta Carbajo提供的技术协助，感谢Jessica Gonzalez Norris对稿件的审阅与修改。本方案由墨西哥国家科学技术理事会（CONACYT）教育研究专项基金 资助，项目编号284771（资助对象：Y.M.）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| <强>1. 小鼠脂肪细胞前体细胞的分离 | |||
| ACK裂解缓冲液 | LONZA | 10-548E | |
| 抗生物素微珠 | Miltenyi | 130-090-485 | |
| 抗CD31 | eBioscience | 13-0311-85 | |
| AutoMACS Pro 分离仪 | Miltenyi | ||
| 基底膜基质（Matrigel） | 康宁 | 354234 | |
| bFGF | Sigma | F0291 | 生长因子 |
| BSA | Equitech-Bio, Inc. | BAC63-1000 | |
| CD45单克隆抗体（30-F11）－生物素 | eBioscience | 13-0451-85 | |
| 胶原酶 1 型 | 沃辛顿生物化学 | LS004197 | |
| 地塞米松 | Sigma | D1756 | |
| DMEM | GIBCO | 12800017 | |
| DMEM低糖培养基 | GIBCO | 31600-034 | |
| EGF | Peprotech | 315-09 | 生长因子 |
| FBS | GIBCO | 26140-079 | |
| ITS 混合物 | Sigma | I3146 | |
| L-抗坏血酸-2-磷酸盐 | Sigma | A8960 | |
| LIF | Millipore | ESG1107 | 生长因子 |
| 亚油酸-白蛋白 | Sigma | L9530 | |
| MCDB 201 培养基 | Sigma | M6770 | |
| Normocin | InvivoGen | ant-nr-2 | |
| PDGF-BB | Peprotech | 315-18 | 生长因子 |
| 青霉素-链霉素 | BioWest | L0022-100 | |
| 预分离滤器（70 µm) | Miltenyi | 130-095-823 | |
| 纯化大鼠抗小鼠 CD16 / CD32 | BD Pharmingen | 553142 | |
| 胰蛋白酶-EDTA | GIBCO | 25300062 | |
| <强>2. 脂肪细胞分化与胰岛素抵抗诱导 | |||
| 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤 [IBMX] | Sigma | I5879 | 分化诱导剂混合物 |
| BMP4 | R&D Systems | 5020-BP-010 | 分化诱导剂混合物 |
| 地塞米松 | Sigma | D1756 | 分化诱导剂混合物 |
| 胰岛素 | Sigma | I9278 | |
| 罗格列酮 | Cayman | 71742 | 分化诱导剂混合物 |
| TNFα | R&D Systems | 210-TA-005 | |
| <强>3. 通过蛋白质印迹法评估胰岛素信号通路 | |||
| 抗β微管蛋白抗体 | Abcam | ab6046 | |
| 溴酚蓝 | 伯乐（BioRad） | 161-0404 | Laemmli缓冲液 |
| EDTA | Sigma | E5134 | RIPA缓冲液 |
| EGTA | Sigma | E4378 | RIPA缓冲液 |
| FluorChem E 系统 | ProteinSimple | ||
| 甘油 | Sigma | G6279 | Laemmli缓冲液 |
| 甘氨酸 | Sigma | G7126 | 运行与转膜缓冲液 |
| Igepal | Sigma | I3021 | RIPA缓冲液 |
| 2-巯基乙醇 | Sigma | M3148 | Laemmli缓冲液 |
| 甲醇 | JT Baker | 907007 | 转移缓冲液 |
| NaCl | JT Baker | 3624-05 | TBS-T |
| NaF | Sigma | 77F-0379 | RIPA缓冲液 |
| NaOH | JT Baker | 3722-19 | |
| Na4P2O7 | Sigma | 114F-0762 | RIPA缓冲液 |
| Na₃VO₄ | Sigma | S6508 | RIPA缓冲液 |
| 硝酸纤维素膜 | BioRad | 1620112 | |
| 脱脂奶粉 | 伯乐（BioRad） | 1706404 | 封闭液 |
| 预染蛋白质标准品 | 伯乐（BioRad） | 1610395 | |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma | P8340-5ML | |
| 辣根过氧化物酶标记的驴抗兔IgG（H+L） | 杰克逊免疫研究公司 | 711-035-132 | |
| 磷酸化胰岛素受体 β | 细胞信号传导 | 3024 | |
| 磷酸化 Akt（Ser473）抗体 | 细胞信号传导 | 9271 | |
| 磷酸化 IRS1（Tyr608）抗体 | Millipore | 9432 | |
| 蔗糖 | JT Baker | 407205 | RIPA缓冲液 |
| SDS | 伯乐（BioRad） | 1610302 | 跑胶与Laemmli缓冲液 |
| SuperSignal West Pico PLUS 化学发光底物 | 赛默飞世尔科技 | 34577 | |
| Tris碱 | Promega | H5135 | 跑胶、转膜与Laemmli缓冲液 |
| Tris-HCl | JT Baker | 4103-02 | RIPA缓冲液 - TBS |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | TBS-T |
参考文献
- Elmus, G. B. Insulin signaling and insulin resistance. Journal of Investigative Medicine. 61 (1), 11-14 (2013).
- Kasuga, M., Zick, Y., Blithe, D. L., Crettaz, M., Kahn, C. R. Insulin stimulates tyrosine phosphorylation of the insulin receptor in a cell-free system. ....
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