完整肾脏三维染色技术（CUBIC）

摘要

本方案描述了一种用于肾脏三维（3D）成像的组织透明化方法及整体免疫荧光染色技术。该技术可提供肾脏病理学的宏观视角，有助于获得新的生物学发现。

摘要

尽管传统病理学提供了大量关于肾脏微结构的信息，但由于缺乏三维（3D）信息，仍难以精确了解肾脏内血管、近端小管、集合管、肾小球及交感神经的精细结构。光学透明化是一种克服这一重大障碍的有效策略。通过结合组织透明化与三维成像技术，可在单细胞分辨率下对完整器官中的多个细胞进行分析。然而，适用于完整器官成像的细胞标记方法仍不完善。特别是整体器官染色面临抗体穿透困难的挑战。本方案开发了一种基于CUBIC（透明无阻脑/体组织成像试剂与计算分析）组织透明化方法的小鼠肾脏整体染色技术，用于三维成像。该方案已成功实现从整体视角可视化缺血-再灌注损伤后的肾脏交感去神经化现象，以及糖尿病肾病早期阶段的肾小球肥大。因此，该技术通过提供宏观视角，有望推动肾脏研究领域的新发现。

引言

肾脏由多种细胞群体组成。尽管传统病理学为我们提供了大量关于肾脏微环境的信息，但仍需要三维（3D）成像技术来精确理解肾脏疾病进展过程中的细胞间相互作用。过去，实现全器官三维成像需要进行大量连续切片和图像重建工作¹。然而，该方法耗时耗力，且在可重复性方面存在诸多问题。

光学透明化是克服这一障碍的有效策略^2,3。组织不透明主要源于光的散射和吸收，因为每种器官都由多种物质组成，包括水、蛋白质和脂质。因此，组织透明化的基本策略是用水和脂质可渗透的折射率（RI）匹配试剂替代组织中的水和脂质，使这些试剂的光学性质与蛋白质相匹配⁴。为了观察透明样本，光片荧光显微镜技术非常有用⁵。光片从侧面照射透明样本，激发信号则通过位于垂直位置的物镜采集⁶。该显微技术可在单次扫描中获取横截面信息，不同于共聚焦或双光子荧光显微镜。因此，它能够以较低的光漂白水平快速获取z轴堆叠图像。

透明、无阻碍的脑/全身成像鸡尾酒法及计算分析（Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computati....

方案

所有实验均经东京大学机构审查委员会批准。所有动物实验均按照美国国立卫生研究院的指导原则进行。本研究使用了8周龄的雄性C57BL/6NJcl小鼠，小鼠购自商业来源（见材料表）。

1. 动物准备与肾脏固定

1. 按照以下步骤进行灌注固定。
   1. 通过吸入异氟烷（3%，2.0 L/min）以及腹腔注射盐酸美托咪啶（0.3 mg/kg）、酒石酸布托啡诺（5 mg/kg）和咪达唑仑（4 mg/kg）对小鼠进行麻醉（参见材料表）。
   2. 经心脏左心室灌注20 mL PBS（pH 7.4）和30 mL 4%多聚甲醛（PFA）磷酸盐缓冲液¹²。
2. 在灌注固定及肾脏取样后立即进行浸没固定⁹。
   1. 将肾脏置于4%多聚甲醛中，4 °C条件下继续固定16 h，随后用PBS洗涤2 h（共三次）⁹（图1）。
      ​注意：甲醛和多聚甲醛为有毒刺激物。操作时应在通风橱中进行，并佩戴适当的个人防护装备。

结果

利用该染色方法，可对整只肾脏中的交感神经[抗酪氨酸羟化酶（TH）抗体]和动脉[抗α-平滑肌肌动蛋白（αSMA）抗体]进行可视化观察（图4A、B 和 视频1）⁹。在缺血/再灌注损伤（IRI）后，异常的肾交感神经也可被可视化^9,10（图4C）。此外，利用该方案还可实现对整个脾脏中交感神经的可视化¹³（图4D）。图5展示了对三维免疫荧光数据进行定量分析的一个示例。

此外，成功实现了对完整肾脏中集合管[抗水通道蛋白2（AQP2）抗体]、近端小管S1段[抗钠-葡萄糖协同转运蛋白2.......

讨论

本方案实现了对交感神经、集合管、动脉、近端小管和肾小球等多种结构的全肾三维成像^9,10,11。该染色方法可进行宏观观察，并推动了新的生物学发现，例如通过可视化缺血-再灌注损伤后肾交感神经的变化^9,10，以及糖尿病肾病早期阶段的肾小球肥大¹¹。

组织的不透明性源于其光学上的非均质性⁵。各种组织透明化方法的共同原理是去除导致光散射或吸收的成分，并用折射率匹配的试剂填充所留空间。与基于有机溶剂的方法（如3D成像溶剂透明化器官法（3DISCO/iDISCO）^3,14）相比，CUB.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
14 mL 圆底高透明度聚丙烯试管	Falcon	352059	组织透明化、染色、洗涤
2,3-二甲基-1-苯基-5-吡唑啉酮/安替比林	Tokyo Chemical Industry	D1876	CUBIC-R+
37% 甲醛溶液	Nacalai Tesque	16223-55	后固定
4% 多聚甲醛磷酸盐缓冲液	Nacalai Tesque	09154-85	肾脏固定
Alexa Fluor 555 标记的驴抗羊 IgG 抗体	Invitrogen	A-21436	二抗（1:100）
Alexa Fluor 647 标记的驴抗兔 IgG 抗体	Invitrogen	A-31573	二抗（1:200）
抗水通道蛋白 2（AQP2）抗体	Abcam	ab199975	一抗（1:100）
抗足细胞蛋白抗体	Sigma-Aldrich	P0372	一抗（1:100）
抗钠-葡萄糖共转运蛋白 2（SGLT2）抗体	Abcam	ab85626	一抗（1:100）
抗酪氨酸羟化酶（TH）抗体	Abcam	ab113	一抗（1:100）
抗-α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）抗体	Abcam	ab5694	一抗（1:200）
PBS 中的酪蛋白封闭剂	Thermo Fisher Scientific	37528	染色缓冲液
酒石酸布托啡诺	Meiji	005526	麻醉剂
C57BL/6NJcl	Nippon Bio-Supp.Center	N/A	小鼠品系
Imaris	Bitplane	N/A	成像分析软件
宏变焦显微镜	OLYMPUS	MVX10	定制显微镜的观察单元
盐酸美托咪啶	Kyoritsu-Seiyaku	008656	麻醉剂
咪达唑仑	SANDOZ	27803229	麻醉剂
矿物油	Sigma-Aldrich	M8410	浸油
N-丁基二乙醇胺	Tokyo Chemical Industry	B0725	CUBIC-L, CUBIC-R+
烟酰胺	Tokyo Chemical Industry	N0078	CUBIC-R+
聚乙二醇单对异辛基苯基醚/Triton X-100	Nacalai Tesque	12967-45	CUBIC-L, PBST
硅油 HIVAC-F4	Shin-Etsu Chemical	50449832	浸油
叠氮化钠	Wako	195-11092	染色缓冲液