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完整肾脏三维染色技术（CUBIC）

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DOI：

10.3791/63986

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2022年7月18日

 , 
1Division of Nephrology and Endocrinology, The University of Tokyo

本文内容

摘要

本方案描述了一种用于肾脏三维（3D）成像的组织透明化方法及整体免疫荧光染色技术。该技术可提供肾脏病理学的宏观视角，有助于获得新的生物学发现。

摘要

尽管传统病理学提供了大量关于肾脏微结构的信息，但由于缺乏三维（3D）信息，仍难以精确了解肾脏内血管、近端小管、集合管、肾小球及交感神经的精细结构。光学透明化是一种克服这一重大障碍的有效策略。通过结合组织透明化与三维成像技术，可在单细胞分辨率下对完整器官中的多个细胞进行分析。然而，适用于完整器官成像的细胞标记方法仍不完善。特别是整体器官染色面临抗体穿透困难的挑战。本方案开发了一种基于CUBIC（透明无阻脑/体组织成像试剂与计算分析）组织透明化方法的小鼠肾脏整体染色技术，用于三维成像。该方案已成功实现从整体视角可视化缺血-再灌注损伤后的肾脏交感去神经化现象，以及糖尿病肾病早期阶段的肾小球肥大。因此，该技术通过提供宏观视角，有望推动肾脏研究领域的新发现。

引言

肾脏由多种细胞群体组成。尽管传统病理学为我们提供了大量关于肾脏微环境的信息，但仍需要三维（3D）成像技术来精确理解肾脏疾病进展过程中的细胞间相互作用。过去，实现全器官三维成像需要进行大量连续切片和图像重建工作1。然而，该方法耗时耗力，且在可重复性方面存在诸多问题。

光学透明化是克服这一障碍的有效策略2,3。组织不透明主要源于光的散射和吸收，因为每种器官都由多种物质组成，包括水、蛋白质和脂质。因此，组织透明化的基本策略是用水和脂质可渗透的折射率（RI）匹配试剂替代组织中的水和脂质，使这些试剂的光学性质与蛋白质相匹配4。为了观察透明样本，光片荧光显微镜技术非常有用5。光片从侧面照射透明样本，激发信号则通过位于垂直位置的物镜采集6。该显微技术可在单次扫描中获取横截面信息，不同于共聚焦或双光子荧光显微镜。因此，它能够以较低的光漂白水平快速获取z轴堆叠图像。

透明、无阻碍的脑/全身成像鸡尾酒法及计算分析（Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational Analysis，CUBIC）是一种组织透明化技术，可结合光片荧光显微镜实现整个器官的成像2,7,8。本研究优化了CUBIC技术与整体免疫荧光染色方法，用于可视化小鼠肾脏的三维结构9,10,11。利用该整体染色方法，可在全肾脏中观察到缺血-再灌注损伤后肾交感神经的变化9,10、糖尿病肾病早期的肾小球肿大11，以及血管、近端小管和集合管的结构9。

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方案

所有实验均经东京大学机构审查委员会批准。所有动物实验均按照美国国立卫生研究院的指导原则进行。本研究使用了8周龄的雄性C57BL/6NJcl小鼠，小鼠购自商业来源（见材料表）。

1. 动物准备与肾脏固定

  1. 按照以下步骤进行灌注固定。
    1. 通过吸入异氟烷（3%，2.0 L/min）以及腹腔注射盐酸美托咪啶（0.3 mg/kg）、酒石酸布托啡诺（5 mg/kg）和咪达唑仑（4 mg/kg）对小鼠进行麻醉（参见材料表）。
    2. 经心脏左心室灌注20 mL PBS（pH 7.4）和30 mL 4%多聚甲醛（PFA）磷酸盐缓冲液12。
  2. 在灌注固定及肾脏取样后立即进行浸没固定9。
    1. 将肾脏置于4%多聚甲醛中，4 °C条件下继续固定16 h，随后用PBS洗涤2 h（共三次）9（图1）。
      ​注意：甲醛和多聚甲醛为有毒刺激物。操作时应在通风橱中进行，并佩戴适当的个人防护装备。

2. 脱色与脱脂

  1. 配制用于脱色和脱脂的CUBIC-L溶液，包含10 wt% Triton X-100和10 wt% N-丁基二乙醇胺（参见 材料表），参照先前已发表的报告4,8,9.
  2. 按照以下步骤使用CUBIC-L进行脱色和脱脂。
    1. 将固定好的肾脏置于14 mL圆底管中，加入7 mL 50% (v/v) CUBIC-L（水与CUBIC-L按1:1体积比混合），浸没组织（见 材料表）在室温下轻轻振荡孵育6小时（图2A然后，将其浸入14 mL圆底管中的7 mL CUBIC-L溶液中，在37 °C下轻轻振荡孵育5天。
    2. 在此过程中每天更换CUBIC-L。脱色和脱脂过程结束后，用PBS在室温下洗涤肾脏2小时（共三次）。9 (图1）。使用分液勺进行样品处理（图2B).

3. 整体免疫荧光染色

  1. 准备染色缓冲液。
    1. 通过将0.5% (v/v) Triton X-100、0.5% 酪蛋白溶于PBS，并加入0.05% 叠氮化钠9，配制用于一抗的染色缓冲液。
    2. 通过将0.5% (v/v) Triton X-100、0.1% 酪蛋白溶于PBS，并加入0.05% 叠氮化钠9，配制用于二抗的染色缓冲液。
  2. 进行一抗染色。
    1. 在染色缓冲液中，加入一抗（1:100 或 1:200，参见材料表），于37 °C、轻柔振荡条件下对脱脂肾脏进行免疫染色，持续7天。
      注意：单个肾脏所需的染色缓冲液体积为500–600 µL（图2C）。
    2. 在室温下，用含0.5% (v/v) Triton X-100的PBS（PBST）洗涤肾脏1天9（图1）。
  3. 进行二抗染色。
    1. 在染色缓冲液中，加入二抗（1:100 或 1:200，参见材料表），于37 °C、轻柔振荡条件下对肾脏进行免疫染色，持续7天。随后在室温下用PBST洗涤肾脏1天9（图1）。
    2. 后固定9：将肾脏浸入含1% 甲醛的PB溶液（37% 甲醛与PB按1:36比例混合）中，固定3小时，随后在室温下用PBS洗涤6小时（图1）。

4. 折射率（RI）匹配

  1. 配制 CUBIC-R+。
    1. 通过混合 45 wt% 的 2,3-二甲基-1-苯基-5-吡唑啉酮/安替比林和 30 wt% 的烟酰胺来配制 CUBIC-R（见材料表）。
    2. 按照先前发表的文献方法4,8,9，向 CUBIC-R 中加入 0.5 v% 的 N-丁基二乙醇胺，配制成用于折射率（RI）匹配的 CUBIC-R+。
  2. 进行折射率匹配。
    1. 将肾脏组织置于含有 7 mL 50%（v/v）CUBIC-R+（水与 CUBIC-R+ 按 1:1 体积比混合）的 14 mL 圆底管中，在室温下轻轻振荡孵育 1 天。随后，将其转移至另一含有 7 mL 纯 CUBIC-R+ 的 14 mL 圆底管中，在室温下继续轻轻振荡孵育 2 天9（图 1）。
      注意：尽管在折射率匹配初期肾脏组织会漂浮于 50% CUBIC-R+ 溶液中，但在 CUBIC-R+ 处理结束时，组织会下沉并变得透明（图 2D）。

5. 图像采集与重建

  1. 在图像采集过程中，将折射率匹配的肾脏浸入硅油（折射率 = 1.555）与矿物油（折射率 = 1.467）按55:45比例混合的溶液中（总体折射率 = 1.51）5（图3）。
  2. 使用自行搭建的9光片荧光显微镜（见材料表）对整个肾脏进行三维成像。所有原始图像数据以16位TIFF格式保存。使用图像分析软件（Imaris，见材料表）对三维重建图像进行可视化观察与图像采集。

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结果

利用该染色方法，可对整只肾脏中的交感神经[抗酪氨酸羟化酶（TH）抗体]和动脉[抗α-平滑肌肌动蛋白（αSMA）抗体]进行可视化观察（图4A、B 和 视频1）9。在缺血/再灌注损伤（IRI）后，异常的肾交感神经也可被可视化9,10（图4C）。此外，利用该方案还可实现对整个脾脏中交感神经的可视化13（图4D）。图5展示了对三维免疫荧光数据进行定量分析的一个示例。

此外，成功实现了对完整肾脏中集合管[抗水通道蛋白2（AQP2）抗体]、近端小管S1段[抗钠-葡萄糖协同转运蛋白2...

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讨论

本方案实现了对交感神经、集合管、动脉、近端小管和肾小球等多种结构的全肾三维成像9,10,11。该染色方法可进行宏观观察，并推动了新的生物学发现，例如通过可视化缺血-再灌注损伤后肾交感神经的变化9,10，以及糖尿病肾病早期阶段的肾小球肥大11。

组织的不透明性源于其光学上的非均质性5。各种组织透明化方法的共同原理是去除导致光散射或吸收的成分，并用折射率匹配的试剂填充所留空间。与基于有机溶剂的方法（如3D成像溶剂透明化器官法（3DISCO/iDISCO）3,14）相比，CUB...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作部分是通过与东京大学的Hiroki R. Ueda教授、顺天堂大学的Etsuo A. Susaki教授、东北大学的Tetsuhiro Tanaka教授、东海大学的Masafumi Fukagawa教授、Takehiko Wada博士以及Hirotaka Komaba博士合作完成的。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
14 mL 圆底高透明度聚丙烯试管Falcon352059组织透明化、染色、洗涤
2,3-二甲基-1-苯基-5-吡唑啉酮/安替比林Tokyo Chemical IndustryD1876CUBIC-R+
37% 甲醛溶液Nacalai Tesque16223-55后固定
4% 多聚甲醛磷酸盐缓冲液Nacalai Tesque09154-85肾脏固定
Alexa Fluor 555 标记的驴抗羊 IgG 抗体InvitrogenA-21436二抗（1:100）
Alexa Fluor 647 标记的驴抗兔 IgG 抗体InvitrogenA-31573二抗（1:200）
抗水通道蛋白 2（AQP2）抗体Abcamab199975一抗（1:100）
抗足细胞蛋白抗体Sigma-AldrichP0372一抗（1:100）
抗钠-葡萄糖共转运蛋白 2（SGLT2）抗体Abcamab85626一抗（1:100）
抗酪氨酸羟化酶（TH）抗体Abcamab113一抗（1:100）
抗-α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）抗体Abcamab5694一抗（1:200）
PBS 中的酪蛋白封闭剂Thermo Fisher Scientific37528染色缓冲液
酒石酸布托啡诺Meiji005526麻醉剂
C57BL/6NJclNippon Bio-Supp.CenterN/A小鼠品系
ImarisBitplaneN/A成像分析软件
宏变焦显微镜OLYMPUSMVX10定制显微镜的观察单元
盐酸美托咪啶Kyoritsu-Seiyaku008656麻醉剂
咪达唑仑SANDOZ27803229麻醉剂
矿物油Sigma-AldrichM8410浸油
N-丁基二乙醇胺Tokyo Chemical IndustryB0725CUBIC-L, CUBIC-R+
烟酰胺Tokyo Chemical IndustryN0078CUBIC-R+
聚乙二醇单对异辛基苯基醚/Triton X-100Nacalai Tesque12967-45CUBIC-L, PBST
硅油 HIVAC-F4Shin-Etsu Chemical50449832浸油
叠氮化钠Wako195-11092染色缓冲液

参考文献

  1. Velez-Fort, M., et al. The stimulus selectivity and connectivity of layer six principal cells reveals cortical microcircuits underlying visual processing. Neuron. 83 (6), 1431-1443 (2014).
  2. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  3. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
  4. Tainaka, K., et al. Chemical Landscape for Tissue Clearing Based on Hydrophilic Reagents. Cell Reports. 24 (8), 2196-2210 (2018).
  5. Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).
  6. Keller, P. J., Dodt, H. U. Light sheet microscopy of living or cleared specimens. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 138-143 (2012).
  7. Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).
  8. Kubota, S. I., et al. Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution. Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).
  9. Hasegawa, S., et al. Comprehensive three-dimensional analysis (CUBIC-kidney) visualizes abnormal renal sympathetic nerves after ischemia/reperfusion injury. Kidney International. 96 (1), 129-138 (2019).
  10. Hasegawa, S., Inoue, T., Inagi, R. Neuroimmune interactions and kidney disease. Kidney Research and Clinical Practice. 38 (3), 282-294 (2019).
  11. Hasegawa, S., et al. The oral hypoxia-inducible factor prolyl hydroxylase inhibitor enarodustat counteracts alterations in renal energy metabolism in the early stages of diabetic kidney disease. Kidney International. 97 (5), 934-950 (2020).
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