本协议描述了用于三维(3D)肾脏成像的组织清除方法和全安装免疫荧光染色。这种技术可以为肾脏病理学提供宏观视角,从而带来新的生物学发现。
尽管常规病理学提供了大量关于肾脏微观结构的信息,但由于缺乏三维(3D)信息,很难知道肾脏中血管,近端小管,集合管,肾小球和交感神经的精确结构。光学清除是克服这一巨大障碍的好策略。通过结合组织清除和3D成像技术,可以以单细胞分辨率分析整个器官中的多个细胞。然而,用于全器官成像的细胞标记方法仍然不发达。特别是,由于抗体穿透困难,整个安装器官染色具有挑战性。本协议开发了一种全安装小鼠肾脏染色,用于使用CUBIC(透明,无阻碍的脑/身体成像混合物和计算分析)组织清除方法进行3D成像。该方案能够从综合的角度可视化糖尿病肾病早期缺血再灌注损伤和肾小球肿大后的肾交感神经去神经。因此,这种技术可以通过提供宏观视角来导致肾脏研究的新发现。
肾脏由各种细胞群组成。虽然常规病理学为我们提供了许多关于肾脏微环境的信息,但需要三维(3D)成像来精确了解肾脏疾病进展过程中的细胞间串扰。过去,全器官3D成像需要进行大量的连续切片和图像重建1。然而,这种方法需要太多的努力,并且在重现性方面存在问题。
光学清除是克服这一障碍的好策略2,3。组织混浊主要是由于光散射和吸收,因为每个器官由各种物质组成,包括水、蛋白质和脂质。因此,组织清除的基本策略是用折射率(RI)匹配试剂代替组织中的水和脂质,这些试剂具有与蛋白质相同的光学特性4。为了观察透明标本,光片荧光显微镜是有用的5。光片从侧面照亮透明标本,激发信号通过位于垂直位置的物镜6采集。该显微镜在单次扫描中获取横截面信息,这与共聚焦或多光子荧光显微镜不同。因此,它可以快速获取具有低光漂白水平的z-stack图像。
清晰、无阻碍的脑/身体成像混合物和计算分析 (CUBIC) 是一种组织清除方法,可通过光片荧光显微镜2,7,8 进行全器官成像。在本研究中优化了立方体和全安装免疫荧光染色,以可视化小鼠肾脏3D结构9,10,11。使用这种全安装染色方法,在糖尿病肾病早期的缺血再灌注损伤 9,10 和肾小球肿大11 以及整个肾脏中的血管、近端小管和集合管9 后,可以看到肾交感神经的改变。
该协议允许对各种结构进行全肾3D成像,例如交感神经,集合管,动脉,近端小管和肾小球9,10,11。这种染色方法提供了宏观观察,并通过可视化缺血再灌注损伤9,10后肾交感神经的改变和糖尿病肾病初始阶段肾小球肿大11,带来了新的生物学发现。
<p class="jove…The authors have nothing to disclose.
这项工作的一部分是通过与Hiroki R. Ueda教授(东京大学),Etsuo A. Susaki教授(顺天堂大学),Tetsuhiro Tanaka教授(东北大学),Masafumi Fukagawa教授,Takehiko Wada博士和Hirotaka Komaba博士(东海大学)合作进行的。
14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube | Falcon | 352059 | Tissue clearing, staining, wash |
2,3-dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone/antipyrine | Tokyo Chemical Industry | D1876 | CUBIC-R+ |
37%-Formaldehyde Solution | Nacalai Tesque | 16223-55 | Post fixation |
4%-Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution | Nacalai Tesque | 09154-85 | Kidney fixation |
Alexa Flour 555-conjugated donkey anti-sheep IgG antibody | Invitrogen | A-21436 | Secondary antibody (1:100) |
Alexa Flour 647-conjugated donkey anti-rabbit IgG antibody | Invitrogen | A-31573 | Secondary antibody (1:200) |
Anti-aquaporin 2 (AQP2) antibody | Abcam | ab199975 | Primary antibody (1:100) |
Anti-podocin antibody | Sigma-Aldrich | P0372 | Primary antibody (1:100) |
Anti-sodium glucose cotransporter 2 (SGLT2) antibody | Abcam | ab85626 | Primary antibody (1:100) |
Anti-tyrosine hydroxylase (TH) antibody | Abcam | ab113 | Primary antibody (1:100) |
Anti-α-smooth muscle actin (α-SMA) antibody | Abcam | ab5694 | Primary antibody (1:200) |
Blocker Casein in PBS | Thermo Fisher Scientific | 37528 | Staining buffer |
Butorphanol Tartrate | Meiji | 005526 | Anesthetic |
C57BL/6NJcl | Nippon Bio-Supp.Center | N/A | Mouse strain |
Imaris | Bitplane | N/A | Imaging analysis software |
Macro-zoom microscope | OLYMPUS | MVX10 | The observation unit of the custom-built microscope |
Medetomidine Hydrochloride | Kyoritsu-Seiyaku | 008656 | Anesthetic |
Midazolam | SANDOZ | 27803229 | Anesthetic |
Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | Immersion oil |
N-buthyldiethanolamine | Tokyo Chemical Industry | B0725 | CUBIC-L, CUBIC-R+ |
Nicotinamide | Tokyo Chemical Industry | N0078 | CUBIC-R+ |
Polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether/Triton X-100 | Nacalai Tesque | 12967-45 | CUBIC-L, PBST |
Silicon oil HIVAC-F4 | Shin-Etsu Chemical | 50449832 | Immersion oil |
Sodium azide | Wako | 195-11092 | Staining buffer |