类脑器官为研究器官发育和人类疾病病理提供了前所未有的机会。尽管类脑器官培养系统已取得显著成功，但该技术的应用仍存在操作上的困难。本方案描述了一种类脑器官培养流程，可方便培养基更换和类脑器官转移。
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摘要
摘要
目前，脑类器官培养技术操作仍较为复杂，难以大规模推广应用，因此有必要寻找一种简便且实用的解决方案。本研究提出了一种更为可行的脑类器官培养方案。为解决早期换液和类器官转移过程中不可避免的操作不便问题，本研究通过应用工程学原理对操作技术进行了优化。采用软光灯对拟胚体（EB）样本进行侧向 illumination，利用增强的漫反射效应，使EB能够通过肉眼直接观察。利用旋转产生的二次流原理，使类器官向孔板中央聚集，从而便于换液或类器官转移操作。与分散的单细胞相比，拟胚体在移液管中沉降速度更快。利用这一现象，可通过简单方式有效去除大部分游离细胞和死亡细胞碎片，避免EB因离心而受到损伤。本研究简化了脑类器官培养的操作流程，有助于推动脑类器官技术的广泛应用。
引言
与二维（2D）培养系统相比，三维（3D）培养系统具有多项优势，包括能够真实地复制并高效地再现某些器官的复杂结构1。因此，脑类器官已成为研究人类大脑发育与疾病2、药物筛选以及细胞治疗等领域的重要辅助方法。
采用旋转悬浮法培养脑类器官有助于其发育和成熟3。尽管脑类器官培养系统已取得显著成功，但仍面临一些关键挑战，限制了其广泛应用。例如，人工培养涉及复杂的操作步骤，阻碍了大规模应用的实现。此外，在脑类器官培养的各个发育阶段，需要更换不同的培养基和细胞因子4。然而，在早期阶段，类器官或拟胚体（EBs）体积微小（约200 µm至300 µm），若无适当设备几乎无法肉眼观察。不可避免的是，在更换培养基时会冲走一定量珍贵的类器官样本。为克服这一问题，已有多种技术在其他类型的类器官培养中被探索，例如将整个类器官芯片浸入培养基中连续培养3天而不进行干预5；利用吸水纸吸除旧培养基后，通过盖玻片添加新鲜培养基5；或采用复杂的微流控管道系统进行液体交换6,7,
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方案
本研究遵循《赫尔辛基宣言》进行。实验方案已获得广州医科大学附属第三医院伦理委员会的批准（医学伦理审查[2021]第022号）。实验前，每种培养基均按照Juergen A. Knoblich的配方12（补充表1-4）配制，或使用市售的脑类器官试剂盒（见材料表）。本研究使用的iPSCs由本实验室先前建立，并已获得知情豁免。SCA3-iPSCs来源于一名31岁女性脊髓小脑性共济失调3型（SCA3）患者，其ATXN3基因经基因分型确认含有26/78次CAG重复序列13（补充图1A）。此前文献中提到的正常人iPSCs被选为对照iPSCs（NC-iPSCs）14，其ATXN3基因被鉴定为含有14/14次CAG重复序列（补充图1B）。
1. 诱导性多能干细胞（iPSCs）的制备
- 在志愿者和患者知情同意的情况下，通过静脉穿刺采集 3 mL 外周血。
- 根据 Ficoll-Paque 法分离外周血单个核细胞15。
- 按照仙台病毒重编程试剂盒的方案建立诱导多能干细胞（iPSCs）（....
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结果
本研究将诱导性多能干细胞（iPSCs）（图2B）诱导为脑类器官（图2C）。早期培养的拟胚体（EBs）表达OCT4标志物（图2A），表明其具有良好的多能性。在后期阶段，拟胚体发育为成熟的脑类器官（图2D）。研究将来自正常健康个体和脊髓小脑共济失调3型（SCA3）患者的iPSCs培养为脑类器官（图3A）。SCA3又称马查多-约瑟夫病（Machado-Joseph disease, MJD），是一种由ATXN3基因中多聚谷氨酰胺扩展引起的神经退行性疾病25。RNA测序数据（已上传至公共数据库，参见材料表）显示，在神经递质转运、突触形成及调控等通路中，正常脑类器官组与SCA3脑类器官组之间的基因表达谱存在显著差异（图3B
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讨论
类脑器官为医学研究开辟了新的途径。该技术的许多有用应用才刚刚开始被探索28。本研究发现，遗传病类脑器官与正常类脑器官的转录组测序结果能够反映疾病与健康状态之间的差异。例如，RNA-seq数据分析结果（图3B）与多项已报道的脊髓小脑性共济失调3型（SCA3）疾病研究结果一致29,30,31,32。培养类脑器官过程中的实验操作，如换液、拟胚体（EB）转移和包埋等，对于能否制备出均一性良好的类脑器官至关重要33,34。本研究介绍了一种便于换液和类脑器官转移的类脑器官培养方案。使用侧向柔光灯可极大辅助类脑器官培养操作，但若无法获取，也可通过LED绘画灯板并进行简单加工来.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由广东省自然科学基金（项目编号：2020A0505100062）、广州市科技计划重点专题项目（项目编号：201904020025）、国家自然科学基金（项目编号：31872800、32070582、82101937）以及广州市博士后科研资助项目（资助对象：Bangzhu Chen）提供支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.2 μm 滤膜 | NEST Biotechnology, 中国 | 331001 | |
| 1000 μL 宽口移液器吸头 | Thermo Fisher Scientific, 美国 | 9405163 | |
| 200 μL 宽口移液器吸头 | Thermo Fisher Scientific, 美国 | 9405020 | |
| 2-巯基乙醇 | Merck, 德国 | 8057400005 | |
| 4% 多聚甲醛 | Servicebio, 中国 | G1101 | |
| 6孔低吸附培养板 | NEST Biotechnology, 中国 | 703011 | 用于拟胚体（EBs）悬浮培养 |
| Acute 细胞解离溶液 | STEMCELL Technologies, 加拿大 | 07920 | 用于将诱导多能干细胞（iPSC）消化为单细胞 |
| AggreWell800 24孔板 | STEMCELL Technologies, 加拿大 | 34811 | 用于拟胚体制备的微孔培养板 |
| 防粘附冲洗液 | STEMCELL Technologies, 加拿大 | 07010 | 用于冲洗培养器皿以防止细胞贴壁 |
| B27-维生素A补充剂 | Thermo Fisher Scientific, 美国 | 12587010 | |
| bFGF | Peprotech, 美国 | GMP100-18B | |
| BSA | 碧云天生物技术, 中国 | ST025 | |
| 离心机 | Eppendorf, 德国 | 5810 R | 可用于各种离心管、试剂瓶和工作板的离心 |
| 盖玻片 | 实泰实验设备, 中国 | 10212020C | |
| DAPI | 碧云天生物技术, 中国 | C1002 | 用于细胞核染色。DAPI与双链DNA结合后，最大激发波长为364 nm，最大发射波长为454 nm |
| DMEM-F12 | Thermo Fisher Scientific, 美国 | 11330032 | |
| 胚胎干细胞级胎牛血清（FBS） | Thermo Fisher Scientific, 美国 | 10270106 | |
| Ficoll Paque | 通用电气公司, 美国 | 17-5442-02 | 根据Ficoll-Paque法分离外周血单个核细胞 |
| 明胶 | 生工生物, 中国 | A609764 | |
| Glutamax补充剂 | Thermo Fisher Scientific, 美国 | 35050061 | |
| Glutamax补充剂 | Thermo Fisher Scientific, 美国 | 17504044 | |
| 山羊抗鸡IgY 二抗 | Abcam, 英国 | ab150171 | 山羊抗鸡IgG。偶联物：Alexa Fluor 647。激发波长：652 nm，发射波长：668 nm。使用稀释比例为1:500 |
| 山羊抗小鼠IgG二抗 | Abcam, 英国 | ab150120 | 山羊抗小鼠IgG。偶联物：Alexa Fluor 594。激发波长：590 nm，发射波长：617 nm。使用稀释比例为1:500 |
| 山羊抗兔IgG二抗 | Abcam, 英国 | ab150077 | 山羊抗兔IgG。偶联物：Alexa Fluor 488。激发波长：495 nm，发射波长：519 nm。使用稀释比例为1:500 |
| 肝素 | Merck, 德国 | H3149 | |
| 水平摇床 | Servicebio, 中国 | DS-H200 | 根据制造商INFORS HT（瑞士）建议，相对离心力（RCF）为0.11808 × g较为合适 |
| 胰岛素 | Merck, 德国 | I9278-5ML | |
| KOSR | Thermo Fisher Scientific, 美国 | 10828028 | |
| Matrigel | Corning, 美国 | 354277 | Matrigel在高于4 °C的环境中会凝固，因此应在低温下分装保存 |
| MEM-NEAA | Thermo Fisher Scientific, 美国 | 11140050 | |
| mTeSR1 | STEMCELL Technologies, 加拿大 | 85850 | iPSC培养基 |
| N2补充剂 | Thermo Fisher Scientific, 美国 | 17502048 | |
| Neurobasal | Thermo Fisher Scientific, 美国 | 21103049 | |
| OCT4一抗 | Abcam, 英国 | ab19857 | 宿主：兔。用500 μL PBS溶解。使用稀释比例为1:200 |
| 病理冷冻切片机 | Leica, 德国 | Leica CM1860 | |
| PAX6一抗 | Abcam, 英国 | ab78545 | 宿主：小鼠。使用稀释比例为1:100 |
| PBS | STEMCELL Technologies, 加拿大 | 37350 | |
| 青霉素-链霉素 | Thermo Fisher Scientific, 美国 | 15140122 | |
| PSC解离溶液 | 北京赛贝生物技术, 中国 | CA3001500 | 无酶解离溶液，可用于iPSC的消化与传代 |
| 仙台病毒重编程试剂盒 | Thermo Fisher Scientific, 美国 | A16518 | 根据仙台病毒重编程试剂盒的操作流程建立iPSC |
| 载玻片 | 实泰实验设备, 中国 | 188105W | |
| 柔光灯 | NUT | NUT | 一种简易自制装置，制备方法参见补充图2 |
| STEMdiff 脑类器官试剂盒 | STEMCELL Technologies, 加拿大 | 8570 | 包含：1. 拟胚体形成培养基；2. 诱导培养基；3. 扩增培养基；4. 成熟培养基 |
| STEMdiff 脑类器官成熟试剂盒 | STEMCELL Technologies, 加拿大 | 8571 | 成熟培养基 |
| 蔗糖 | 生工生物, 中国 | A502792 | |
| 吐温X-100 | Merck, 德国 | X100 | |
| TUJ1一抗 | Abcam, 英国 | ab41489 | 宿主：鸡。使用稀释比例为1:1000 |
| 凡士林 | 生工生物, 中国 | A510146 | |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies, 加拿大 | 72302 | 用PBS配制5 mM储存液，将1 mg溶于624 µL PBS中 |
| 网址链接 | |||
| 原始测序数据 | 国家基因组科学数据中心（Genomics, Proteomics & Bioinformatics 2021）的基因组序列归档库（Genome Sequence Archive, Nucleic Acids Res 2022），中国生物信息中心/中国科学院北京基因组研究所 | GSA-人类：HRA002430 | https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa-human/ |
参考文献
- Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7 (33), (2020).
- Quadrato, G., et al. Cell diversity and network dynamics in photosensitive human brain organoids. Nature.
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