类脑器官为研究器官发育和人类疾病病理提供了前所未有的机会。尽管类脑器官培养系统已取得显著成功，但该技术的应用仍存在操作上的困难。本方案描述了一种类脑器官培养流程，可方便培养基更换和类脑器官转移。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
目前，脑类器官培养技术操作仍较为复杂，难以大规模推广应用，因此有必要寻找一种简便且实用的解决方案。本研究提出了一种更为可行的脑类器官培养方案。为解决早期换液和类器官转移过程中不可避免的操作不便问题，本研究通过应用工程学原理对操作技术进行了优化。采用软光灯对拟胚体（EB）样本进行侧向 illumination，利用增强的漫反射效应，使EB能够通过肉眼直接观察。利用旋转产生的二次流原理，使类器官向孔板中央聚集，从而便于换液或类器官转移操作。与分散的单细胞相比，拟胚体在移液管中沉降速度更快。利用这一现象，可通过简单方式有效去除大部分游离细胞和死亡细胞碎片，避免EB因离心而受到损伤。本研究简化了脑类器官培养的操作流程，有助于推动脑类器官技术的广泛应用。
引言
与二维（2D）培养系统相比，三维（3D）培养系统具有多项优势，包括能够真实地复制并高效地再现某些器官的复杂结构1。因此，脑类器官已成为研究人类大脑发育与疾病2、药物筛选以及细胞治疗等领域的重要辅助方法。
采用旋转悬浮法培养脑类器官有助于其发育和成熟3。尽管脑类器官培养系统已取得显著成功，但仍面临一些关键挑战，限制了其广泛应用。例如，人工培养涉及复杂的操作步骤，阻碍了大规模应用的实现。此外，在脑类器官培养的各个发育阶段，需要更换不同的培养基和细胞因子4。然而，在早期阶段，类器官或拟胚体（EBs）体积微小（约200 µm至300 µm），若无适当设备几乎无法肉眼观察。不可避免的是，在更换培养基时会冲走一定量珍贵的类器官样本。为克服这一问题，已有多种技术在其他类型的类器官培养中被探索，例如将整个类器官芯片浸入培养基中连续培养3天而不进行干预5；利用吸水纸吸除旧培养基后，通过盖玻片添加新鲜培养基5；或采用复杂的微流控管道系统进行液体交换6,7,8。类器官培养早期阶段遇到的另一个障碍是难以通过肉眼直接观察，这可能导致操作不当，进而在类器官转移过程中造成损伤或丢失。因此，有必要建立一种更为可行的方案，以促进培养基更换和类器官转移，从而高效生成类器官。
基于工程学原理，提出了一种相应的优化操作，以克服上述问题，显著且便捷地促进了多种类器官操作的进行。自然界中，当阳光通过窗户缝隙照进屋内时，肉眼可见灰尘在光束中飞舞。这是由于阳光在灰尘上的漫反射，部分光线折射入眼球从而形成视觉图像。受此现象原理的启发9,10，本研究设计了一盏柔光灯，并从侧向照射胚胎体（EBs）。结果发现，EBs在不影響觀察範圍的情況下可視性明顯提高。由于涡流效应11，在旋转培养板时液体中会产生指向中心的二次流，原本分散的EBs会向培养板中心聚集。基于这一现象，并结合类器官沉降速度大于单个细胞的特性，本文提出了一种无需离心即可更换培养基和转移类器官的简便操作方法。通过该转移操作，可有效将培养基中的类器官与游离细胞及死亡细胞碎片分离。
本文提出了一种易于操作的方案，用于从人多能干细胞生成脑类器官。通过应用工程学原理优化了操作技术，使三维培养中的操作与二维培养一样简单可行。改进的液体更换方法和类器官转移操作也有助于其他类型的类器官培养以及自动培养设备的设计。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
本研究遵循《赫尔辛基宣言》进行。实验方案已获得广州医科大学附属第三医院伦理委员会的批准（医学伦理审查[2021]第022号）。实验前，每种培养基均按照Juergen A. Knoblich的配方12（补充表1-4）配制，或使用市售的脑类器官试剂盒（见材料表）。本研究使用的iPSCs由本实验室先前建立，并已获得知情豁免。SCA3-iPSCs来源于一名31岁女性脊髓小脑性共济失调3型（SCA3）患者，其ATXN3基因经基因分型确认含有26/78次CAG重复序列13（补充图1A）。此前文献中提到的正常人iPSCs被选为对照iPSCs（NC-iPSCs）14，其ATXN3基因被鉴定为含有14/14次CAG重复序列（补充图1B）。
1. 诱导性多能干细胞（iPSCs）的制备
- 在志愿者和患者知情同意的情况下，通过静脉穿刺采集 3 mL 外周血。
- 根据 Ficoll-Paque 法分离外周血单个核细胞15。
- 按照仙台病毒重编程试剂盒的方案建立诱导多能干细胞（iPSCs）（参见材料表）。
- 将iPSCs接种于包被有Matrigel（基底膜基质，参见材料表）的35 mm培养皿中，并使用mTeSR1培养基进行培养。每日更换培养基。iPSCs的生长密度不得超过75%。
- 使用PSC解离溶液（参见材料表）消化细胞，并每3-5天以1:5的比例进行传代。
注意：本步骤使用仙台病毒。操作必须在生物安全柜中进行，并采取必要的个人防护措施。应明确了解在当地国家是否允许合法使用该病毒，并严格遵守当地的生物安全法律法规。
2. 胚胎体（EB）制备（第0-1天）
- 用移液器吸去iPSCs中的mTeSR1培养基，并用1 mL 1× PBS洗涤2次。
- 用移液器吸去PBS，加入300 µL细胞解离溶液（见材料表），在37 °C下消化iPSCs为单细胞，持续3–4分钟。
- 将细胞重悬于2 mL EB形成培养基中（补充表1），然后在300 × g下离心5分钟（室温）。
- 用抗黏附冲洗液（500 µL/孔）预处理专用24孔板，处理5分钟（见材料表）。
注意：抗黏附冲洗液对于EB和类球体的最佳形成至关重要。 - 将细胞重悬于含有Y-27632（终浓度10 µM，见材料表）的EB形成培养基中，细胞密度为1.5 × 106 个细胞/mL。
- 吸去抗黏附冲洗液，每孔用2 mL EB形成培养基冲洗一次。
- 以3 × 106 个细胞/孔的密度将细胞加入专用24孔板中（图1A，左图）。
注意：通常每个孔可制备约300个EB。该方法可制备大量大小均一的EB。 - 将培养板在室温下以100 × g离心2分钟，使细胞均匀分布在每个孔的底部（图1A，右图）。
注意：若无合适的离心机，也可直接将培养板放入培养箱中进行静态培养，但EB球体的形成时间将比正常离心条件下延迟数小时。 - 将样品在37 °C、5% CO2条件下培养24小时。若前一步未进行离心，则培养36小时。在此期间保持样品稳定，不得将其从培养箱中取出。
3. 柔性光源灯的制备（第1天）
- 使用厚度为 0.3–0.5 cm、大小为 A5 纸张的透明亚克力板。在亚克力板的正反两面粘贴白色垫片。
- 在板的边缘安装一排白色 LED 灯，使光线从亚克力板的侧面进入，然后平行射出（补充图 2A–F，图 1B）。
注意：由于早期类胚体（EBs）的直径约为 200 µm 至 300 µm，在超净台的荧光灯下肉眼难以清晰观察。相比之下，由于漫反射增强，使用侧向照射的柔光可清晰检测到 EBs（图 1B，C）。后续实验中建议使用 6 孔板进行 EB 培养。但为了更好地展示柔光的视觉效果，本研究中有时采用培养皿而非培养板来拍摄图片和视频，请勿误解。侧向照射的柔光灯同样适用于 6 孔板。
- 在板的边缘安装一排白色 LED 灯，使光线从亚克力板的侧面进入，然后平行射出（补充图 2A–F，图 1B）。
4. 胚胎团转移与培养基更换（第2-5天）
- 准备一个新的6孔低黏附培养板，每孔加入2 mL EB形成培养基。
- 使用1000 µL宽口吸头（见材料表）将EB连同培养基一同吸出，转移至6孔低黏附培养板中（约100个EB/孔）。
注意：操作过程中采用柔光灯（见步骤3）以更清晰地观察EB。关闭其他室内光源，以获得更佳的柔光视觉效果。 - 每天更换等体积的新鲜EB形成培养基。利用二次流将EB聚集至孔中央，然后更换培养基。
- 用移液器缓慢吸取旧培养基至孔边缘，避免用力过猛，否则会同时吸走EB。随后加入新鲜培养基重悬EB。
注意：二次流原理（图1D）。通过沿圆形轨道旋转培养皿诱导涡旋流，由于涡旋流的作用，产生指向中心的二次流。EB或类器官在旋转产生的二次流作用下向孔中央聚集，之后可方便地进行换液或胚胎体转移操作。
- 用移液器缓慢吸取旧培养基至孔边缘，避免用力过猛，否则会同时吸走EB。随后加入新鲜培养基重悬EB。
5. 通过多能性标志物OCT4标记检测多能性（第4天）
注意：当拟胚体（EBs）的直径大于 300 µm 时，取若干拟胚体进行OCT4标志物免疫荧光染色，以检测其多能性。
- 将拟胚体（EBs）置于4%多聚甲醛中，4 °C固定30分钟，随后用1×PBS洗涤3次，每次10分钟。
- 将拟胚体（EBs）转移至含0.3% Triton X-100和3% BSA的室温PBS溶液中，孵育2小时，随后用PBS洗涤3次，每次10分钟。
注意：经Triton X-100处理后，拟胚体（EBs）会漂浮于液面，在清洗过程中容易随液体被吸走。建议在体视显微镜下操作。 - 将OCT4一抗（见材料表）用含1% BSA的1 mL 1×PBS按1:200比例稀释后加入拟胚体（EBs）中，4 °C孵育过夜，然后用PBS洗涤3次，每次10分钟。
- 将相应的二抗（见材料表）用1×PBS按1:500比例稀释，并加入1 mL至拟胚体（EBs）中。
- 室温孵育2小时后，用1×PBS洗涤3次，每次10分钟。
- 吸除PBS，加入含1 µg/mL DAPI的2 mL 1×PBS溶液，室温孵育10分钟，然后用PBS洗涤3次，每次10分钟。
- 将含有少量液体的拟胚体（EBs）转移至载玻片上，用边缘涂有市售凡士林的盖玻片封片（见材料表），随后在荧光共聚焦显微镜下观察并采集图像。
注意：OCT4表达代表拟胚体（EBs）的多能性12。当OCT4表达率低于90%时，应弃用该批拟胚体（EBs），并重新制备。
6. 神经诱导（第5-7天）
- 准备一个新的低黏附6孔板，并向每孔加入3 mL神经诱导培养基（补充表2）。
- 打开侧方柔光灯（见步骤3），并关闭其他室内光源。
- 将拟胚体转移至已加入神经诱导培养基的6孔板中（约100个拟胚体/孔）。尽量减少将原始培养基带入新孔中。
注意：介绍拟胚体转移的基本操作技巧。由于重力作用以及拟胚体密度相对培养基较高，在实施图1E所示操作时，重悬的拟胚体会逐渐沉降，从而可方便地完成转移。由于游离细胞和死亡细胞碎片的沉降速度较拟胚体更慢，因此通过此沉降方法可去除大部分游离细胞和死亡细胞碎片（图1F）。 - 将样品置于37 °C、5% CO2条件下培养24小时。
注意：在显微镜下观察，拟胚体直径约为500 µm，边缘呈半透明状，提示已形成神经上皮层。 - 进入下一步操作。
7. 在基底膜基质中包埋（第7–10天）
- 提前将基质膜置于 4 °C 冰箱中溶解 60 分钟。预先计算所需基质膜的用量。大约 100 个 EB 被包埋于 1.5 mL 基质膜中。
- 打开侧向柔光灯，关闭控制台顶部的光源。
- 将基质膜置于冰上，防止其凝固。
- 每次将少量 EB 转移至含有新鲜扩增培养基（补充表 3）的 60 mm 培养皿中。减少 EB 数量，以便更容易挑取单个 EB。
- 然后使用新的 6 孔低黏附培养板。每次用 200 µL 宽口移液枪头（见 材料表）吸取单个 EB（含约 10 µL 培养基），然后将其加入 6 孔板底部形成液滴。每孔使用五个液滴。
注意：关键是将移液器调节至 50 µL 范围，吸取一个 EB，然后参照 图 1E 的操作。当 EB 沉降至移液枪头孔口时，迅速使枪头轻触孔底，并推出约 10 µL 液体以形成液滴。 - 向每个含有 EB 的液滴中加入 15 µL 基质膜，并迅速混匀。将 EB 球体包埋于液滴中央。
注意：切勿使用标准移液枪头吸取 EB，以免损伤 EB。必须使用 200 µL 宽口移液枪头。 - 将 6 孔板放入 37 °C 培养箱中孵育 30 分钟，使含有 EB 的基质膜液滴凝固。
- 向每孔加入 3 mL 扩增培养基，轻轻吹打使基质膜包埋的 EB 悬浮。
- 在 37 °C、5% CO2 条件下培养 3 天。
注意：若观察到 EB 表面出现芽状结构，则表明已形成扩增的神经上皮16。
8. 类器官成熟（第10-40天）
- 轻轻吸去原始培养基，每孔加入 3 mL 成熟培养基（补充表 4）。
- 将类器官培养板置于 37 °C 培养箱内的水平摇床上。
- 继续水平旋转培养，将摇床调至适当转速。
注意：根据水平摇床制造商的建议（见材料表），在 6 孔板上培养脑类器官时，相对离心力（RCF）为 0.11808 × g 更为合适。根据相对离心力与转速之间的换算关系17,18，RCF = 1.118 × 10−5 × R × rpm2，其中 RCF 为相对离心力（g），rpm 为每分钟转数（r/min），R 为旋转半径（cm），也称为摇动行程。不同摇床的摇动行程参数可能不同，因此可估算转速为 rpm = 299 × (RCF/R)1/2。 - 每 2–3 天更换一次新鲜的成熟培养基。
- 培养 20–30 天后，逐步将脑类器官培养至成熟。
注意：在此期间，类器官可用于实验和检测，例如神经标志物检测和转录组测序19,20,21。
9. 脑类器官的冰冻切片与免疫荧光染色
- 将类器官置于4%多聚甲醛中，4 °C固定16小时，然后用1× PBS洗涤3次，每次10分钟。
- 吸除PBS，将类器官浸入30%蔗糖溶液中，4 °C过夜。
- 将类器官在37 °C下用10%/7.5%明胶/蔗糖溶液包埋1小时，随后迅速转移至包埋模具中。
- 将干冰加入100%乙醇中制备干冰-乙醇混合物，将类器官样品放入其中进行快速冷冻。
- 将冷冻样品储存于−80 °C冰箱中。使用时，切取厚度为20 µm的冷冻切片。
- 参照步骤5.3–5.5进行免疫荧光染色。使用PAX6抗体标记顶端前体细胞，TUJ1抗体（见材料表）标记神经元细胞22,23,24，DAPI用于细胞核DNA染色。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
本研究将诱导性多能干细胞（iPSCs）（图2B）诱导为脑类器官（图2C）。早期培养的拟胚体（EBs）表达OCT4标志物（图2A），表明其具有良好的多能性。在后期阶段，拟胚体发育为成熟的脑类器官（图2D）。研究将来自正常健康个体和脊髓小脑共济失调3型（SCA3）患者的iPSCs培养为脑类器官（图3A）。SCA3又称马查多-约瑟夫病（Machado-Joseph disease, MJD），是一种由ATXN3基因中多聚谷氨酰胺扩展引起的神经退行性疾病25。RNA测序数据（已上传至公共数据库，参见材料表）显示，在神经递质转运、突触形成及调控等通路中，正常脑类器官组与SCA3脑类器官组之间的基因表达谱存在显著差异（图3B
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
类脑器官为医学研究开辟了新的途径。该技术的许多有用应用才刚刚开始被探索28。本研究发现，遗传病类脑器官与正常类脑器官的转录组测序结果能够反映疾病与健康状态之间的差异。例如，RNA-seq数据分析结果（图3B）与多项已报道的脊髓小脑性共济失调3型（SCA3）疾病研究结果一致29,30,31,32。培养类脑器官过程中的实验操作，如换液、拟胚体（EB）转移和包埋等，对于能否制备出均一性良好的类脑器官至关重要33,34。本研究介绍了一种便于换液和类脑器官转移的类脑器官培养方案。使用侧向柔光灯可极大辅助类脑器官培养操作，但若无法获取，也可通过LED绘画灯板并进行简单加工来...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由广东省自然科学基金（项目编号：2020A0505100062）、广州市科技计划重点专题项目（项目编号：201904020025）、国家自然科学基金（项目编号：31872800、32070582、82101937）以及广州市博士后科研资助项目（资助对象：Bangzhu Chen）提供支持。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.2 μm 滤膜 | NEST Biotechnology, 中国 | 331001 | |
| 1000 μL 宽口移液器吸头 | Thermo Fisher Scientific, 美国 | 9405163 | |
| 200 μL 宽口移液器吸头 | Thermo Fisher Scientific, 美国 | 9405020 | |
| 2-巯基乙醇 | Merck, 德国 | 8057400005 | |
| 4% 多聚甲醛 | Servicebio, 中国 | G1101 | |
| 6孔低吸附培养板 | NEST Biotechnology, 中国 | 703011 | 用于拟胚体（EBs）悬浮培养 |
| Acute 细胞解离溶液 | STEMCELL Technologies, 加拿大 | 07920 | 用于将诱导多能干细胞（iPSC）消化为单细胞 |
| AggreWell800 24孔板 | STEMCELL Technologies, 加拿大 | 34811 | 用于拟胚体制备的微孔培养板 |
| 防粘附冲洗液 | STEMCELL Technologies, 加拿大 | 07010 | 用于冲洗培养器皿以防止细胞贴壁 |
| B27-维生素A补充剂 | Thermo Fisher Scientific, 美国 | 12587010 | |
| bFGF | Peprotech, 美国 | GMP100-18B | |
| BSA | 碧云天生物技术, 中国 | ST025 | |
| 离心机 | Eppendorf, 德国 | 5810 R | 可用于各种离心管、试剂瓶和工作板的离心 |
| 盖玻片 | 实泰实验设备, 中国 | 10212020C | |
| DAPI | 碧云天生物技术, 中国 | C1002 | 用于细胞核染色。DAPI与双链DNA结合后，最大激发波长为364 nm，最大发射波长为454 nm |
| DMEM-F12 | Thermo Fisher Scientific, 美国 | 11330032 | |
| 胚胎干细胞级胎牛血清（FBS） | Thermo Fisher Scientific, 美国 | 10270106 | |
| Ficoll Paque | 通用电气公司, 美国 | 17-5442-02 | 根据Ficoll-Paque法分离外周血单个核细胞 |
| 明胶 | 生工生物, 中国 | A609764 | |
| Glutamax补充剂 | Thermo Fisher Scientific, 美国 | 35050061 | |
| Glutamax补充剂 | Thermo Fisher Scientific, 美国 | 17504044 | |
| 山羊抗鸡IgY 二抗 | Abcam, 英国 | ab150171 | 山羊抗鸡IgG。偶联物：Alexa Fluor 647。激发波长：652 nm，发射波长：668 nm。使用稀释比例为1:500 |
| 山羊抗小鼠IgG二抗 | Abcam, 英国 | ab150120 | 山羊抗小鼠IgG。偶联物：Alexa Fluor 594。激发波长：590 nm，发射波长：617 nm。使用稀释比例为1:500 |
| 山羊抗兔IgG二抗 | Abcam, 英国 | ab150077 | 山羊抗兔IgG。偶联物：Alexa Fluor 488。激发波长：495 nm，发射波长：519 nm。使用稀释比例为1:500 |
| 肝素 | Merck, 德国 | H3149 | |
| 水平摇床 | Servicebio, 中国 | DS-H200 | 根据制造商INFORS HT（瑞士）建议，相对离心力（RCF）为0.11808 × g较为合适 |
| 胰岛素 | Merck, 德国 | I9278-5ML | |
| KOSR | Thermo Fisher Scientific, 美国 | 10828028 | |
| Matrigel | Corning, 美国 | 354277 | Matrigel在高于4 °C的环境中会凝固，因此应在低温下分装保存 |
| MEM-NEAA | Thermo Fisher Scientific, 美国 | 11140050 | |
| mTeSR1 | STEMCELL Technologies, 加拿大 | 85850 | iPSC培养基 |
| N2补充剂 | Thermo Fisher Scientific, 美国 | 17502048 | |
| Neurobasal | Thermo Fisher Scientific, 美国 | 21103049 | |
| OCT4一抗 | Abcam, 英国 | ab19857 | 宿主：兔。用500 μL PBS溶解。使用稀释比例为1:200 |
| 病理冷冻切片机 | Leica, 德国 | Leica CM1860 | |
| PAX6一抗 | Abcam, 英国 | ab78545 | 宿主：小鼠。使用稀释比例为1:100 |
| PBS | STEMCELL Technologies, 加拿大 | 37350 | |
| 青霉素-链霉素 | Thermo Fisher Scientific, 美国 | 15140122 | |
| PSC解离溶液 | 北京赛贝生物技术, 中国 | CA3001500 | 无酶解离溶液，可用于iPSC的消化与传代 |
| 仙台病毒重编程试剂盒 | Thermo Fisher Scientific, 美国 | A16518 | 根据仙台病毒重编程试剂盒的操作流程建立iPSC |
| 载玻片 | 实泰实验设备, 中国 | 188105W | |
| 柔光灯 | NUT | NUT | 一种简易自制装置，制备方法参见补充图2 |
| STEMdiff 脑类器官试剂盒 | STEMCELL Technologies, 加拿大 | 8570 | 包含：1. 拟胚体形成培养基；2. 诱导培养基；3. 扩增培养基；4. 成熟培养基 |
| STEMdiff 脑类器官成熟试剂盒 | STEMCELL Technologies, 加拿大 | 8571 | 成熟培养基 |
| 蔗糖 | 生工生物, 中国 | A502792 | |
| 吐温X-100 | Merck, 德国 | X100 | |
| TUJ1一抗 | Abcam, 英国 | ab41489 | 宿主：鸡。使用稀释比例为1:1000 |
| 凡士林 | 生工生物, 中国 | A510146 | |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies, 加拿大 | 72302 | 用PBS配制5 mM储存液，将1 mg溶于624 µL PBS中 |
| 网址链接 | |||
| 原始测序数据 | 国家基因组科学数据中心（Genomics, Proteomics & Bioinformatics 2021）的基因组序列归档库（Genome Sequence Archive, Nucleic Acids Res 2022），中国生物信息中心/中国科学院北京基因组研究所 | GSA-人类：HRA002430 | https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa-human/ |
参考文献
- Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7 (33), (2020).
- Quadrato, G., et al. Cell diversity and network dynamics in photosensitive human brain organoids. Nature. 545 (7652), 48-53 (2017).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Qian, X., et al. et al.Brain-region-specific organoids using mini-bioreactors for modeling ZIKV exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
- Hu, Y., et al. Lung cancer organoids analyzed on microwell arrays predict drug responses of patients within a week. Nature Communications. 12 (1), 2581(2021).
- Jung, D. J., et al. A one-stop microfluidic-based lung cancer organoid culture platform for testing drug sensitivity. Lab on a Chip. 19 (17), 2854-2865 (2019).
- Jalili-Firoozinezhad, S., et al. A complex human gut microbiome cultured in an anaerobic intestine-on-a-chip. Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 520-531 (2019).
- Gkatzis, K., Taghizadeh, S., Huh, D., Stainier, D. Use of three-dimensional organoids and lung-on-a-chip methods to study lung development, regeneration and disease. The European Respiratory Journal. 52 (5), 1800876(2018).
- Ye, Y., Pui, D. Detection of nanoparticles suspended in a light scattering medium. Scientific Reports. 11 (1), 20268(2021).
- Staven, V., Waaseth, M., Wang, S., Grønlie, I., Tho, I. Utilization of the tyndall effect for enhanced visual detection of particles in compatibility testing of intravenous fluids: Validity and reliability. PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology. 69 (2), 270-283 (2015).
- Fukuma, Y., Inui, T., Imashiro, C., Kurashina, Y., Takemura, K. Homogenization of initial cell distribution by secondary flow of medium improves cell culture efficiency. PloS One. 15 (7), 0235827(2020).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
- Ouyang, S., et al. CRISPR/Cas9-targeted deletion of polyglutamine in spinocerebellar ataxia type 3-derived induced pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 27 (11), 756-770 (2018).
- Xian, Y., et al. The safety and effectiveness of genetically corrected iPSCs derived from β-thalassaemia patients in nonmyeloablative β-thalassaemic mice. Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 288(2020).
- Kanof, M. E., Smith, P. D., Zola, H. Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood. Current Protocols in Immunology. , Chapter 7, Unit 7.1 (2001).
- Knight, G. T., et al. Engineering induction of singular neural rosette emergence within hPSC-derived tissues. eLife. 7, 37549(2018).
- Rieder, H. L., Smithwick, R. W. RPM or RCF. The American Review of Respiratory Disease. 132 (6), 1371(1985).
- Dole, V. P., Cotzias, G. C. A nomogram for the calculation of relative centrifugal force. Science. 113 (2941), 552-553 (1951).
- Velasco, S., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570 (7762), 523-527 (2019).
- Jacob, F., et al. Human pluripotent stem cell-derived neural cells and brain organoids reveal SARS-CoV-2 neurotropism predominates in choroid plexus epithelium. Cell Stem Cell. 27 (6), 937-950 (2020).
- Kathuria, A., et al. Transcriptomic landscape and functional characterization of induced pluripotent stem cell-derived cerebral organoids in schizophrenia. JAMA Psychiatry. 77 (7), 745-754 (2020).
- Paşca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nature Methods. 12 (7), 671-678 (2015).
- Hu, B. Y., et al. Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (9), 4335-4340 (2010).
- Tang, X. Y., et al. DSCAM/PAK1 pathway suppression reverses neurogenesis deficits in iPSC-derived cerebral organoids from patients with Down syndrome. The Journal of Clinical Investigation. 131 (12), 135763(2021).
- Costa, M., Paulson, H. L. Toward understanding Machado-Joseph disease. Progress in Neurobiology. 97 (2), 239-257 (2012).
- Trapnell, C., et al. Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nature Biotechnology. 28 (5), 511-515 (2010).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (12), 550(2014).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Klockgether, T., et al. Age related axonal neuropathy in spinocerebellar ataxia type 3/Machado-Joseph disease (SCA3/MJD). Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 66 (2), 222-224 (1999).
- Khan, L. A., et al. Expanded polyglutamines impair synaptic transmission and ubiquitin-proteasome system in Caenorhabditis elegans. Journal of Neurochemistry. 98 (2), 576-587 (2006).
- Teixeira-Castro, A., et al. Serotonergic signalling suppresses ataxin 3 aggregation and neurotoxicity in animal models of Machado-Joseph disease. Brain: A Journal of Neurology. 138, Pt 11 3221-3237 (2015).
- Joers, J. M., et al. Neurochemical abnormalities in premanifest and early spinocerebellar ataxias. Annals of Neurology. 83 (4), 816-829 (2018).
- Sivitilli, A., Ghiasi, P., Attisano, L. Production of phenotypically uniform human cerebral organoids from pluripotent stem cells. Bio-protocol. 11 (8), 3985(2021).
- Sivitilli, A. A., et al. Robust production of uniform human cerebral organoids from pluripotent stem cells. Life Science Alliance. 3 (5), (2020).
- Camp, J. G., Treutlein, B. Human development: Advances in mini-brain technology. Nature. 545 (7652), 39-40 (2017).
- Giandomenico, S. L., Sutcliffe, M., Lancaster, M. A. Generation and long-term culture of advanced cerebral organoids for studying later stages of neural development. Nature Protocols. 16 (2), 579-602 (2021).
- Yoon, S. J., et al. Reliability of human cortical organoid generation. Nature Methods. 16 (1), 75-78 (2019).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125(2014).
- Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
