透射电子显微镜技术：神经母细胞瘤外科病理学诊断工具

摘要

儿童小圆蓝细胞肿瘤是一组引人关注且具有挑战性的新生物。因此，在外科病理学中，透射电子显微镜（TEM）以及对儿童肿瘤的专业知识具有极高的诊断价值。本文介绍了一种用于诊断神经母细胞瘤的透射电子显微镜技术方案，神经母细胞瘤是儿童时期最常见的实体瘤之一。

摘要

儿童小圆蓝细胞肿瘤（PSRBCT）是一组引人关注且具有诊断挑战性的肿瘤。小圆蓝细胞肿瘤的光镜检查显示为体积小、呈圆形的细胞，通常具有深染的细胞核以及相对稀少的嗜碱性细胞质。儿童小圆蓝细胞肿瘤包括多种类型，通常涵盖肾母细胞瘤、神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、尤文肉瘤、视网膜母细胞瘤、淋巴瘤以及小细胞骨肉瘤等。即使应用免疫组织化学技术，在光镜下对这些肿瘤进行鉴别诊断仍可能存在争议，微弱的染色或背景模糊可能阻碍病理学家做出准确的诊断判断。此外，分子生物学可能产生大量复杂的数据，难以区分这些肿瘤类型，某些染色体易位可能在多个肿瘤类型中出现。因此，透射电子显微镜（TEM）具有极高的诊断价值。本文重点介绍神经母细胞瘤的现代透射电镜检测方案。若肿瘤细胞显示出含有神经分泌颗粒的胞质突起缠绕结构，则可确诊为神经母细胞瘤。

引言

病理学家的工作在临床诊断和研究领域都可能极具挑战性。18世纪光学显微镜的发展^th 和19^th 20世纪非常了不起。电子显微镜的分辨能力主要取决于电子的波长，而电子的波长比光波更短^1,2,3在多克隆抗体和单克隆抗体及其在免疫组织化学中应用出现之前，透射电子显微镜（TEM）在小圆蓝细胞肿瘤的诊断中发挥了重要作用。

自20世纪90年代起，免疫组织化学方法已取代形态学工具成为诊断中的主要手段⁴目前，已有数千种新的多克隆和单克隆抗体靶向小圆蓝细胞肿瘤组的抗原^4,6,7,8在高产的20世纪的最后一个十年中^th 21世纪初的百年及第一个十年^st 世纪，分子生物学，包括荧光 原位 杂交技术，从基因组探针到下一代测序，在多个实验室中似乎已取代了免疫组织化学的重要应用地位⁴美国食品药品监督管理局（FDA）、加拿大食品检验局（CFIA）、环境保护署（EPA）或其他国家的类似政府机构并不总是批准分子生物学实验方案⁹似乎在病理报告中插入大量可用于治疗目的的信息颇具挑战性，因此审慎选择一个资金充足且运行良好的实验室信息系统至关重要¹⁰与此同时，免疫组织化学已暴露出诸多陷阱，例如上皮性肿瘤表达间充质标志物，反之亦然¹¹上皮-间质转化混淆了某些病理学分类的界限^12,13近年来，电子显微镜技术在全球多个实验室中得到了显著发展¹⁴特别是，采用多种接近单克隆或多克隆抗体染色的方案后，组织样本的周转时间已从数周缩短至仅3天甚至更短^4,10.

此外，将电子相机与电子显微镜联用有助于为病理学家提供可在不同操作系统中灵活使用的快速图像。最后，某些抗体即使经过抗原修复，仍难以在坏死区域或与自噬/缺血相关的改变区域中显现出信号。与此同时，在经验丰富的操作者手中，电子显微镜仍能提供优异的结果，并为未知病理肿瘤的正确分类提供重要线索¹⁵。

儿童小圆蓝细胞肿瘤组包含多种肿瘤，主要为神经母细胞瘤、肾母细胞瘤（Wilms瘤）、横纹肌肉瘤和尤因肉瘤。由于所采用技术的复杂性，儿童小圆蓝细胞肿瘤相关的分子生物学数据可能非常庞杂。在常规染色（苏木精和伊红染色）下，这些小圆蓝细胞之间的形态差异可能不大，且某些肿瘤可能具有异常的免疫表型特征。自透射电子显微镜（TEM）发现以来，分子生物学领域取得了巨大进展。在小圆蓝细胞肿瘤组中，某些肿瘤的临床出现频率可能高于其他类型，但仍需全面考虑所有可能性。尽管乳头状肾细胞癌本质上并非小圆蓝细胞肿瘤，其主要特征为乳头状结构，但有时可出现圆形细胞区域，需借助多种辅助技术与其他典型的小圆蓝细胞肿瘤（例如Wilms瘤）进行鉴别¹⁶。最终，还应将肾源性间质肿瘤纳入鉴别诊断范畴¹⁷。横纹肌样瘤是一种特别具有侵袭性的儿童恶性肿瘤，可分为肾内型和肾外型两种亚型¹⁸。

神经母细胞瘤是婴儿期和儿童期最常见的实体恶性肿瘤之一。神经母细胞瘤细胞是一种恶性细胞，起源于原始神经嵴的衍生物，其发生较为隐匿。该病的诊断及鉴别诊断可能较为困难。近几十年来，人们对神经母细胞瘤的天然生物学特性取得了显著进展。叉头框转录因子家族的特征是具有一个独特的"forkhead"结构域（FOXO3/FKHRL1）。这些转录因子通过激活细胞死亡相关基因的表达，作为细胞凋亡（程序性细胞死亡）的启动因子发挥作用。FOXO3/FKHRL1可被5-aza-2-脱氧胞苷激活，并诱导沉默的caspase-8表达，该复合物在神经母细胞瘤中发挥关键作用。核内定位的FOXO3可预测不良的临床预后，并促进神经母细胞瘤的肿瘤血管生成^7,19。尽管分子病理学已取得进展，Shimada分类法仍是病理学家和儿科肿瘤学家所遵循的标准，对于区分良好与不良组织学类型至关重要^20,21,22,23。

制定一种针对疑似神经母细胞瘤肿瘤进行电子显微镜检查的简便方案，其依据在于组织样本超微结构检查的可行性和可靠性。与免疫组织化学相比，该方法极少受到常见技术问题的干扰。这一方案及其理论基础已被多部教科书及儿科病理学和电子显微镜领域的科学文献所采纳^4,24,25。本方案凝聚了作者三十年来的实践经验，将重点讨论少数原始神经外胚层肿瘤（PSRBCT），并结合个人经验与文献综述进行阐述。

方案

涉及人类受试者的研究中所进行的所有操作均符合机构和/或国家研究委员会的伦理标准，以及1964年《赫尔辛基宣言》及其后续修订版或同等伦理标准。电子显微镜检查是针对送检样本进行常规显微诊断的一部分，无需生物伦理委员会批准。本研究为回顾性研究，且严格保护样本的完全匿名性。

1. 用于福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）回收及戊二醛固定组织样本的透射电镜（TEM）方案

1. 取出最近的苏木精-伊红染色切片及FFPE组织块。
2. 使用永久性记号笔在组织切片上标出目标区域，并与组织块上的对应区域进行匹配。
3. 用新的剃须刀片从组织块上切下选定区域，并在滤纸上精确切割成5 mm的立方体。
4. 将带有组织样本的滤纸放入已标记的培养皿中，并将培养皿置于60–70 °C的烘箱中15分钟，直至石蜡融化（石蜡由一系列直链固态烃混合而成，熔点范围为48 °C–66 °C（120至150 °F））并被滤纸吸收。
5. 将去石蜡后的组织转移至含有4 mL 100%甲苯（甲基苯）v/v的闪烁瓶中（100%甲苯指100 mL甲苯）。确保样品在整个脱蜡过程中持续旋转（旋转速度：24转/分钟）。
6. 使用倾斜旋转装置，进行两次甲苯更换，每次1小时，再进行一次4 mL 100%甲苯更换，每次30分钟。
7. 接着进行一次4 mL 100%无水乙醇（C₂H₅OH）更换，持续1小时，随后进行两次4 mL 100%无水乙醇更换，每次30分钟；然后再进行一次4 mL 70%乙醇中30分钟的更换。
8. 进行一次4 mL 0.1 M卡考基酸钠缓冲液更换，持续30分钟。将样本转移至4 mL 2.5%戊二醛中，并在4 °C下保存直至处理。
9. 使用自动组织处理机按以下步骤标准化处理流程：0.1 M卡考基酸钠缓冲液5分钟，2%四氧化锇1小时50分钟，dH₂O 5分钟，50%乙醇15分钟，70%乙醇30分钟，100%乙醇15分钟（三次），100%乙醇30分钟（三次），100%乙醇45分钟，丙酮50分钟，树脂1小时（两次），新鲜树脂过夜。所有溶液的体积均为15 mL。
10. 从组织处理机中取出新鲜树脂后立即进行包埋。
    1. 将聚乙烯包埋胶囊置于带有编号纸条的支架中。向胶囊内滴加新鲜树脂，将样本转移至相应的包埋块中，并将包埋块在60 °C（140 °F）烘箱中过夜保存。
11. 在加热板上使用1%甲苯胺蓝对半薄切片（500 nm）染色，最低加热档位加热30秒，用dH₂O冲洗，然后加盖盖玻片。
12. 此处使用Ultracut切片机（UCM）进行半薄切片。
    1. 取树脂包埋块并将其安装在UCM的包埋块夹持器中，然后将夹持器安装在UCM载物台上并拧紧。
    2. 使用单刃涂层剃须刀片和目镜，在样本周围切除多余的树脂，将包埋块切面修整为梯形。
    3. 将包埋块夹持器从载物台上取下，牢固地安装在UCM臂上。接着将刀片夹持器安装在UCM载物台上，最后将玻璃刀牢固地固定在刀片夹持器上。
    4. 利用UCM提供的目镜和光源，缓慢移动玻璃刀刃，尽可能接近树脂块表面以进行切割。将刀片夹持器在载物台上固定到位。
    5. 将UCM的切片厚度设为500 nm，修切树脂块直至切面露出75%面积。
    6. 更换为新的玻璃刀，并向玻璃刀的储液槽中加入无菌水。
    7. 在载玻片上标记病例编号，并在玻片上放置四滴独立的无菌水。
    8. 仍保持500 nm设置，从包埋块上切下四片切片。使用精细镊子将每片切片依次转移至玻片上的水滴中，每滴水含一片切片。将玻片置于加热板最低档加热至干燥（30秒）。
13. 采用甲苯胺蓝法染色，水洗后加盖盖玻片。在光学显微镜下观察甲苯胺蓝染色切片。若可见所需组织结构，则进行超薄切片；若未见所需结构，则继续切取更深的切片，并重复染色步骤，直至所需结构在甲苯胺蓝切片上清晰显现。
14. 当从甲苯胺蓝切片中确定电镜观察的目标区域后，开始在铜网上切取超薄切片。 使用超薄切片机（ultramicrotome）切取超薄切片（用于透射电镜观察的样本必须切成极薄的切片（80 nm））。
    1. 取树脂包埋块并将其安装在UCM的包埋块夹持器中，然后将夹持器安装在UCM载物台上并拧紧。
    2. 使用目镜和单刃涂层剃须刀片，切除目标电镜观察区域周围的树脂，将包埋块切面修整为梯形，面积不超过1 mm²。若因光线反光导致目标区域难以辨认，可用少量氯仿擦拭以突出树脂块中的结构。
    3. 将包埋块夹持器从载物台上取下，牢固地安装在UCM臂上。接着将刀片夹持器安装在UCM载物台上，最后将金刚石刀牢固地固定在刀片夹持器上。
    4. 利用UCM提供的目镜和光源，缓慢移动金刚石刀刃，尽可能接近树脂块表面以进行切割。将刀片夹持器在载物台上固定到位。
    5. 使用UCM的螺丝调节金刚石刀的不同角度，确保刀刃与包埋块表面尽可能完美对齐。向金刚石刀的储液槽中加入无菌水。
    6. 将UCM设置为80 nm切片厚度和1 mm/s切速。此处使用自动功能进行超薄切片。在UCM上设定切片窗口（即包埋块切面的上下边界）。
    7. 按下UCM的开始按钮启动切片，切片将漂浮在金刚石刀的无菌储液槽中。
    8. 当切得足够数量的切片后，使用氯仿蒸气使切片展平。将棉签浸入氯仿后，在切片上方轻轻挥动，切勿接触切片。
15. 使用精细镊子将铜网先浸入100%乙醇，再浸入无菌水中。每次使用前需清洁每个铜网，并将切片捞取至若干铜网上。
16. 将带有切片的铜网放置在标记好的滤纸上，将滤纸放入培养皿中，并置于60 °C烘箱中30分钟，使切片在铜网上充分干燥。
17. 随后进行对比染色。
    1. 将铜网在醋酸铀酰或任何环境友好型替代染色剂中染色1分钟，然后用注射用无菌水冲洗（每次醋酸铀酰和柠檬酸铅染色后均需在四个不同的水容器中各冲洗40次）。柠檬酸铅染色步骤同样为1分钟。
18. 将铜网插入透射电子显微镜（TEM），使阴极发射高电压电子束，并通过磁透镜聚焦。电子束部分穿透薄的（电子半透明）样本后，在屏幕上形成TEM图像信息（见下文）。

2. 扫描和拍摄样本的透射电子显微镜（TEM）实验方案

1. 网格上的切片染色完成后，使用电子显微镜进行观察。在电子显微镜上，将加速电压（ACC voltage）调至预设值（200–300 kV），具体数值取决于所使用的电子显微镜型号。
2. 在计算机上启动数码相机软件，并输入病例编号。这一点非常重要，因为显微照片将保存在对应的病例文件中。
3. 将网格装入电子显微镜，将样品杆拉出一半，然后将开关拨至AIR位置，使样品杆腔室内的真空逐渐充入环境空气（室温空气）。
4. 待腔室内完全充满空气后，将样品杆完全取出，放置在专用支架上。然后打开样品杆尖端的网格 holder。
5. 将网格正确放入 holder 中，关闭 holder 并确保网格已固定稳妥。
6. 将样品杆重新插入样品室至一半位置，然后将开关拨至EVAC位置，以在样品室中重新建立真空。
7. 当样品室达到真空状态时，绿色指示灯将亮起。随后，小心地将样品杆完全推入电子显微镜镜筒中，注意推进速度不可过快，否则可能损坏样品杆尖端的样品。
8. 当网格在电子显微镜镜筒中就位后，将灯丝开启至中间（预设）饱和状态。
9. 通过ON/OFF开关打开相机。在计算机上，点击成像软件中的Live Image按钮。
10. 在电子显微镜上按下Low Magnification按钮，并打开物镜光阑，以便选择所需的观察区域。接着，使用电子显微镜镜筒两侧的两个控制杆，将切片中目标区域移至计算机屏幕中央。
11. 在电子显微镜上按下Zoom按钮，并关闭物镜光阑，以获得更好的对比度。
12. 开始以 2,500 倍放大倍数拍摄显微照片，进行切片筛查。然后，使用电子显微镜上的 wobbler 按钮和亮度按钮调节焦距，确保显微照片质量。
13. 在计算机上点击Final Image 按钮以拍摄显微照片。若图像颜色不均匀，需在相机软件中执行背景校正。此外，在保存显微照片前，使用软件调整最终图像的对比度。
14. 保存显微照片时，需再次核对病例编号和放大倍数，以确保显微照片的正确标识。
    注意：在某些情况下，用户还可添加额外说明文字，同时需录入电子显微镜 技术员的姓名首字母缩写。
15. 对整个待筛查区域完成显微摄影操作。在以 2,500 倍放大倍数保存足够数量的显微照片覆盖目标区域后，继续拍摄 4,000 倍和 8,000 倍放大倍数的显微照片，并以正确的病例编号保存至计算机。
16. 若收到特别详细的筛查指示，需对切片特定区域进行高倍放大拍摄，以获取特定的超微结构细节。如有需要，使用更高放大倍数测量并保存特定超微结构的尺寸数据至计算机。
17. 当样品筛查完成后，依次关闭灯丝、相机、高压电源及相机软件。随后，从电子显微镜镜筒中取出网格，使空气重新进入样品杆腔室。
18. 将网格存入明胶胶囊中，并将胶囊与同一病例的树脂块一起放入正确标记的盒子中保存。将样品杆重新放回枪室，并储存在阴凉干燥的环境中，以保护所用材料。
19. 将数字显微照片传输至常用的协作平台（例如 SharePoint）或内部服务器，以便病理医生查看。
20. 在实验室信息系统（LIS）中录入工作量单位。
21. 若需要更特定的显微照片，可取出原网格并重复使用，以进行额外筛查或回答特定问题。

结果

神经母细胞瘤独特的透射电镜特征如图所示。本文将阐述神经母细胞瘤独特的透射电镜特征。

神经母细胞瘤是婴儿期和儿童期最常见的实体恶性肿瘤之一。神经母细胞瘤细胞是起源于原始神经嵴衍生物的恶性细胞，构成这种实体瘤。这种组织发生学解释了该“蓝色肿瘤”的某些生化和形态学特征。然而，神经母细胞瘤确定性的细胞和组织病理学特征可能因分化程度的不同而出现特异性波动，因此其诊断和鉴别诊断可能较为困难。神经母细胞瘤向类神经节细胞成分的分化表现为细胞胞质逐渐增多、出现胞质突起以及核形态的改变（图1A-D）。核增大和可见核仁是神经母细胞瘤分化的特征。有时也可观察到向类施万细胞成分的分化。电镜检查显示，神经分泌颗粒（平均直径100 nm）恒常存在，可伴有或不伴有含微管和细的中间丝的类似神经突的胞质突起²⁶。神经母细胞瘤的一个特征是糖原含量稀少；即使偶见，也从不形成聚集体。分化程度决定了神经母细胞瘤的超微结构特征。神经分泌颗粒或儿茶酚胺颗粒...

讨论

在这篇附带实验方案的叙述性综述中，我们重点介绍了神经母细胞瘤独特的超微结构特征。最后，我们认为电子显微镜远非一种"过时"或陈旧的技术，若将其与单细胞组学技术相结合，有望发现其新的应用价值。本文旨在强调电子显微镜在小儿病理学中始终不可替代的重要作用^4,27。该技术的关键步骤、改进方法、故障排除以及局限性将在下文详细说明。

本方案中有几个关键步骤。首先，必须精确切割用于电子显微镜观察的所需区域。应调整金刚石刀刃的方向，使其尽可能正对样品块面。这一步骤要求操作者具备极高的手部稳定性。使用铜网捞取漂浮切片时需格外小心。

该技术的改进与故障排除需考虑若干方面。每种样本的特性（如密度和性质）各不相同，具有可变性。根据材料的性质和密度，并非所有组织样本都以相同方式切片。例如，某些神经母细胞瘤样本可能未分化或分化程度较低，而其他样本则可能表现出较高程度的分化以及不同程度的钙化。有时需要切出多个切片，才能获得少数...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
丙酮，ACS级试剂	Electron Microscopy Sciences	10014	符合美国化学学会（ACS Reagent）标准的试剂。
全自动组织处理仪	Electron Microscopy Sciences	L12600	LYNX II 全自动组织处理仪，用于组织学与显微观察。
数码相机软件	Gatan	L12600	Digital Micrograph
Spurr树脂	Electron Microscopy Sciences	14300	包埋树脂，具有优异的组织渗透性和快速浸润能力。树脂块修切和切片性能良好，超薄切片在电子束下表现出较强的耐受性。
乙醇	Electron Microscopy Sciences	15058	含分子筛的100%乙醇，以及50%和70%乙醇。
戊二醛，25%电子显微镜级水溶液（血清瓶装）	Electron Microscopy Sciences	16214	用25%戊二醛配制的0.1 M卡可基酸缓冲液（pH 7.2–7.4），终浓度为2.5%，作为透射电镜组织样本的初级固定剂。
四氧化锇	Electron Microscopy Sciences	19110	透射电镜组织处理过程中的二次固定剂，使用蒸馏水配制的OsO4溶液
聚乙烯包埋胶囊	Electron Microscopy Sciences	70021	平底包埋胶囊，00号规格
闪烁体探测器	Electron Microscopy Sciences	82010	Phillip Quad探测器
单刃剃刀片	Electron Microscopy Sciences	71952-10	洁净室用刀片，10片/盒
卡可基酸钠缓冲液	Electron Microscopy Sciences	11655	0.4 M卡可基酸钠缓冲液，pH 7.2，由三水合卡可基酸钠配制而成
单宁酸，试剂级，ACS级，电子显微镜级	Electron Microscopy Sciences	21700	符合美国化学学会（ACS Reagent）标准的试剂。
透射电子显微镜（1）	Hitachi	Hitachi 7100	使用高压75 kV条件
透射电子显微镜（2）	JEOL	JEM-1010	使用高压38 kV条件
甲苯	Electron Microscopy Sciences	22030	符合美国化学学会（ACS Reagent）标准的试剂
超薄切片机	Leica	11865766	超薄切片机（Ultramicrotome）
醋酸铀酰	Electron Microscopy Sciences	22400	Uranyless，醋酸铀酰的替代染色剂