方法文章

透射电子显微镜技术：神经母细胞瘤外科病理学诊断工具

DOI：

10.3791/63994

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2022年7月6日

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1Anatomic Pathology Division of EORLA, Children's Hospital of Eastern Ontario, University of Ottawa, 2Department of Laboratory Medicine and Pathology, University of Alberta, 3Department of Pediatrics, University of Alberta, Stollery Children's Hospital, 4Department of Orthopedics, Tianyou Hospital, Wuhan University of Science and Technology, 5Institute of Pathology, Medical University of Innsbruck

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

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儿童小圆蓝细胞肿瘤是一组引人关注且具有挑战性的新生物。因此，在外科病理学中，透射电子显微镜（TEM）以及对儿童肿瘤的专业知识具有极高的诊断价值。本文介绍了一种用于诊断神经母细胞瘤的透射电子显微镜技术方案，神经母细胞瘤是儿童时期最常见的实体瘤之一。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

儿童小圆蓝细胞肿瘤（PSRBCT）是一组引人关注且具有诊断挑战性的肿瘤。小圆蓝细胞肿瘤的光镜检查显示为体积小、呈圆形的细胞，通常具有深染的细胞核以及相对稀少的嗜碱性细胞质。儿童小圆蓝细胞肿瘤包括多种类型，通常涵盖肾母细胞瘤、神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、尤文肉瘤、视网膜母细胞瘤、淋巴瘤以及小细胞骨肉瘤等。即使应用免疫组织化学技术，在光镜下对这些肿瘤进行鉴别诊断仍可能存在争议，微弱的染色或背景模糊可能阻碍病理学家做出准确的诊断判断。此外，分子生物学可能产生大量复杂的数据，难以区分这些肿瘤类型，某些染色体易位可能在多个肿瘤类型中出现。因此，透射电子显微镜（TEM）具有极高的诊断价值。本文重点介绍神经母细胞瘤的现代透射电镜检测方案。若肿瘤细胞显示出含有神经分泌颗粒的胞质突起缠绕结构，则可确诊为神经母细胞瘤。

引言

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病理学家的工作在临床诊断和研究领域都可能极具挑战性。18世纪光学显微镜的发展th 和19th 20世纪非常了不起。电子显微镜的分辨能力主要取决于电子的波长，而电子的波长比光波更短1,2,3在多克隆抗体和单克隆抗体及其在免疫组织化学中应用出现之前，透射电子显微镜（TEM）在小圆蓝细胞肿瘤的诊断中发挥了重要作用。

自20世纪90年代起，免疫组织化学方法已取代形态学工具成为诊断中的主要手段4目前，已有数千种新的多克隆和单克隆抗体靶向小圆蓝细胞肿瘤组的抗原4,6,7,8在高产的20世纪的最后一个十年中th 21世纪初的百年及第一个十年st 世纪，分子生物学，包括荧光 原位 杂交技术，从基因组探针到下一代测序，在多个实验室中似乎已取代了免疫组织化学的重要应用地位....

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方案

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涉及人类受试者的研究中所进行的所有操作均符合机构和/或国家研究委员会的伦理标准，以及1964年《赫尔辛基宣言》及其后续修订版或同等伦理标准。电子显微镜检查是针对送检样本进行常规显微诊断的一部分，无需生物伦理委员会批准。本研究为回顾性研究，且严格保护样本的完全匿名性。

1. 用于福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）回收及戊二醛固定组织样本的透射电镜（TEM）方案

  1. 取出最近的苏木精-伊红染色切片及FFPE组织块。
  2. 使用永久性记号笔在组织切片上标出目标区域，并与组织块上的对应区域进行匹配。
  3. 用新的剃须刀片从组织块上切下选定区域，并在滤纸上精确切割成5 mm的立方体。
  4. 将带有组织样本的滤纸放入已标记的培养皿中，并将培养皿置于60–70 °C的烘箱中15分钟，直至石蜡融化（石蜡由一系列直链固态烃混合而成，熔点范围为48 °C–66 °C（120至150 °F））并被滤纸吸收。
  5. 将去石蜡后的组织转移至含有4 mL 100%甲苯（甲基苯）v/v的闪烁瓶中（100%甲苯指100 mL甲苯）。确保样品在整个脱蜡过程中持续旋转（旋转速度：24转/分钟）。
  6. 使用倾斜旋转装置，进行两次甲苯更换，每次1小时，再进行一次4 mL 100%甲苯更换，每次30分钟。
  7. 接着进行一次4 mL 100%无水乙醇（C2

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结果

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神经母细胞瘤独特的透射电镜特征如图所示。本文将阐述神经母细胞瘤独特的透射电镜特征。

神经母细胞瘤是婴儿期和儿童期最常见的实体恶性肿瘤之一。神经母细胞瘤细胞是起源于原始神经嵴衍生物的恶性细胞，构成这种实体瘤。这种组织发生学解释了该“蓝色肿瘤”的某些生化和形态学特征。然而，神经母细胞瘤确定性的细胞和组织病理学特征可能因分化程度的不同而出现特异性波动，因此其诊断和鉴别诊断可能较为困难。神经母细胞瘤向类神经节细胞成分的分化表现为细胞胞质逐渐增多、出现胞质突起以及核形态的改变（图1A-D）。核增大和可见核仁是神经母细胞瘤分化的特征。有时也可观察到向类施万细胞成分的分化。电镜检查显示，神经分泌颗粒（平均直径100 nm）恒常存在，可伴有或不伴有含微管和细的中间丝的类似神经突的胞质突起26。神经母细胞瘤的一个特征是糖原含量稀少；即使偶见，也从不形成聚集体。分化程度决定了神经母细胞瘤的超微结构特征。神经分泌颗粒或儿茶酚胺颗粒.......

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讨论

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在这篇附带实验方案的叙述性综述中，我们重点介绍了神经母细胞瘤独特的超微结构特征。最后，我们认为电子显微镜远非一种"过时"或陈旧的技术，若将其与单细胞组学技术相结合，有望发现其新的应用价值。本文旨在强调电子显微镜在小儿病理学中始终不可替代的重要作用4,27。该技术的关键步骤、改进方法、故障排除以及局限性将在下文详细说明。

本方案中有几个关键步骤。首先，必须精确切割用于电子显微镜观察的所需区域。应调整金刚石刀刃的方向，使其尽可能正对样品块面。这一步骤要求操作者具备极高的手部稳定性。使用铜网捞取漂浮切片时需格外小心。

该技术的改进与故障排除需考虑若干方面。每种样本的特性（如密度和性质）各不相同，具有可变性。根据材料的性质和密度，并非所有组织样本都以相同方式切片。例如，某些神经母细胞瘤样本可能未分化或分化程度较低，而其他样本则可能表现出较高程度的分化以及不同程度的钙化。有时需要切出多个切片，才能获得少数.......

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披露

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第一作者从以下出版社获得版税：Springer（https://link.springer.com/book/10.1007/978-3-662-59169-7；ISBN：978-3-662-59169-7）和Nova（https://novapublishers.com/shop/science-culture-and-politics-despair-and-hopes-in-the-time-of-a-pandemic/；ISBN：978-1-53619-816-4）。所有版税均捐赠给儿童慈善机构。

致谢

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我们感谢理查德·弗兰德博士（Dr. Richard Vriend）的专业知识和大力支持，他此前曾任职于加拿大阿尔伯塔省健康服务部门，工作单位为阿尔伯塔大学医院；同时感谢史蒂文·乔伊（Steven Joy，1972–2019）的贡献，他生前同样在阿尔伯塔大学医院担任阿尔伯塔省健康服务部门的员工。本研究谨献给乔伊先生，以纪念这位在超微结构研究领域经验丰富的高级技术专家，他不幸于数年前英年早逝。乔伊先生是加拿大阿尔伯塔省大多数电子显微镜研究工作的中坚力量。我们向他及其家人致以深切的思念与祈祷。我们亦衷心感谢莱斯莉·伯内特女士（Ms. Lesley Burnet）所提供的帮助与建议。C. 萨吉博士（Dr. C. Sergi）的研究经费来自以下机构的慷慨资助：安大略省渥太华东部安大略儿童医院、斯托勒儿童医院基金会，以及通过妇女与儿童健康研究所（WCHRI，项目编号：2096）支持霍尔妇女医院的捐赠者；湖北工业大学湖北省自然科学基金（“百人计划”外国专家引进项目总经费：基于数字PCR与NGS的感染与肿瘤诊断研究，2017–2022年）；奥地利蒂罗尔癌症援助基金会（Österreichische Krebshilfe Tyrol，即蒂罗尔癌症协会，奥地利蒂罗尔癌症研究所，2007年与2009年——"DMBTI与胆管细胞癌" 及 "胰腺癌中的Hsp70与HSPBP1"）；奥地利科学基金（Fonds zur Förderung der wissenschaftlichen Forschung，FWF，项目编号：L31....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
丙酮，ACS级试剂Electron Microscopy Sciences10014符合美国化学学会（ACS Reagent）标准的试剂。
全自动组织处理仪Electron Microscopy SciencesL12600LYNX II 全自动组织处理仪，用于组织学与显微观察。
数码相机软件GatanL12600Digital Micrograph
Spurr树脂Electron Microscopy Sciences14300包埋树脂，具有优异的组织渗透性和快速浸润能力。树脂块修切和切片性能良好，超薄切片在电子束下表现出较强的耐受性。
乙醇Electron Microscopy Sciences15058含分子筛的100%乙醇，以及50%和70%乙醇。
戊二醛，25%电子显微镜级水溶液（血清瓶装）Electron Microscopy Sciences16214用25%戊二醛配制的0.1 M卡可基酸缓冲液（pH 7.2–7.4），终浓度为2.5%，作为透射电镜组织样本的初级固定剂。
四氧化锇Electron Microscopy Sciences19110透射电镜组织处理过程中的二次固定剂，使用蒸馏水配制的OsO4溶液
聚乙烯包埋胶囊Electron Microscopy Sciences70021平底包埋胶囊，00号规格
闪烁体探测器Electron Microscopy Sciences82010Phillip Quad探测器
单刃剃刀片Electron Microscopy Sciences71952-10洁净室用刀片，10片/盒
卡可基酸钠缓冲液Electron Microscopy Sciences116550.4 M卡可基酸钠缓冲液，pH 7.2，由三水合卡可基酸钠配制而成
单宁酸，试剂级，ACS级，电子显微镜级Electron Microscopy Sciences21700符合美国化学学会（ACS Reagent）标准的试剂。
透射电子显微镜（1）HitachiHitachi 7100使用高压75 kV条件
透射电子显微镜（2）JEOLJEM-1010使用高压38 kV条件
甲苯Electron Microscopy Sciences22030符合美国化学学会（ACS Reagent）标准的试剂
超薄切片机Leica11865766超薄切片机（Ultramicrotome）
醋酸铀酰Electron Microscopy Sciences22400Uranyless，醋酸铀酰的替代染色剂

参考文献

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  1. Nitta, R., Imasaki, T., Nitta, E. Recent progress in structural biology: lessons from our research history. Microscopy (Oxford). 67 (4), 187-195 (2018).
  2. Moser, T. H., et al. The role of electron irradiation history in liquid cell t....

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