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尿激酶型纤溶酶原激活物诱导的小鼠背痛模型

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DOI：

10.3791/63997

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2023年9月1日

 ,  ,  , 
1Department of Anesthesiology & Critical Care Medicine, University of New Mexico Health Sciences Center

本文内容

摘要

本文提供了利用尿激酶型纤溶酶原激活物进行韧带内注射，以快速、简便地建立小鼠背痛模型的方法。

摘要

通过本文所述的简单方法，可在小鼠中诱导出持续性下背痛模型。本研究提供了通过注射尿激酶型纤溶酶原激活物（尿激酶）——一种存在于人类及其他动物体内的丝氨酸蛋白酶——快速、简便地建立小鼠持续性背痛模型的逐步操作方法。诱导小鼠持续性下背痛的方法仅需在腰椎韧带附着区域注射尿激酶即可完成。该尿激酶作为炎症刺激剂，可将纤溶酶原激活为纤溶酶。通常情况下，该模型可在10分钟内成功建立，且痛觉过敏状态可持续至少8周。

在持续性模型中，可检测超敏反应、步态障碍以及其他标准的焦虑样和抑郁样指标。 背痛是最常见的疼痛类型。为了提高对背痛的认识，国际疼痛研究协会（IASP）将2021年命名为 "全球背痛年" 和2022年 "全球疼痛知识转化实践年" 疼痛治疗领域在治疗进展上存在一个局限性，即缺乏用于测试持续性和慢性疼痛的合适模型。 该模型的特征 适用于测试旨在减轻背痛及其相关症状的潜在治疗方法，有助于国际疼痛研究协会（IASP）将2022年命名为“将疼痛知识转化为临床实践全球年”。

引言

下背痛是导致残疾的最常见原因之一，全球约每5人中就有1人受其影响1。尽管如此，在疼痛研究领域，尤其是小鼠研究中，目前被广泛采用的可靠背痛动物模型仍然较少。以往的模型几乎 exclusively 使用大鼠来诱导慢性背痛（CBP），例如通过向腰椎小关节注射尿激酶型纤溶酶原激活物（uPA）2,3、向躯干肌肉注射神经生长因子（NGF）4，或向椎间盘内注射单碘乙酸钠（MIA）5 或白细胞介素-1β6。显然，大鼠之所以在这些模型中更受青睐，主要因其体型较大，便于炎症因子注射操作。

需要明确的是，背痛的小鼠模型确实存在，例如多年来用于椎间盘退变研究的 SPARC 基因敲除小鼠模型7，但这些模型的建立成本更高且耗时更长，相比基于注射的模型而言更为复杂。最近一项小鼠研究通过向腰部肌肉注射 NGF 并结合垂直慢性束缚应激，建立了一种下背痛模型8。在以下实验方案中，我们将原本在大鼠中建立的 uPA 诱导的慢性背痛（CBP）模型改进并应用于小鼠2。该模型....

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方案

所述所有动物实验程序均符合美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物护理与使用指南》的要求。研究已获得新墨西哥大学健康科学中心机构动物护理和使用委员会（IACUC #23-201364-HSC）的批准。所有研究均遵守《研究中使用动物的OLAW合规保证书》（A3002-01）项下相关政策，具体如第三部分II. 保证与认证所述。动物饲养于由实验室人员及实验动物资源部（DLAR）人员共同维护的动物资源中心（ARC）饲养设施中。安乐死方法（注射100 µL浓度为59 mg/mL的戊巴比妥钠）快速、可靠，可便于后续解剖并采集多种组织用于进一步研究。

1. 动物

  1. 将成年（约3-4周龄）雄性和雌性BALB/c小鼠（20-25 g）饲养在反向12小时:12小时光照:黑暗循环条件下，使其在黑暗中的活跃期与实验室工作时间重合。
    注：由于啮齿类动物天生为夜行性动物，此方法可确保在动物自然活跃时段内进行各项参数的评估。这减少了昼夜节律时钟变化的干扰，使动物可在其活跃期（现为白天）接受测试。
  2. 每天对动物进行两次监测。
  3. 在评估药物对疼痛相关行为的影响时，应给予普通小鼠繁殖饲料喂养，该饲料的豆粕蛋白含量低于标准啮齿类动物饲料（已知会影响过敏反应）。
  4. 每周称重一次动物，以确保其保持健康的体重增长。
    ​注：在为期8-10周的研究过程中，各组间未观察到体重差异，从而保证了研究的盲....

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结果

伤害性相关行为学测试与数据分析
诱发性检测指标
注射尿激酶后一天内，足垫出现痛觉过敏。一周内，缩足阈值显著降低，并持续至动物被实施安乐死；该现象至少持续至术后第4周（图4A）。缩足潜伏期通过von Frey上下法9和Hargreaves试验进行分析。在所示示例中，慢性骨盆疼痛（CBP）小鼠（雄性4只，雌性4只）与对照组（雄性2只，雌性2只）相比，表现出显著增强的机械敏感性。该模型效应在第6至7周逐渐消退。这一时间进程可用于评估化合物在慢性时间点减轻痛觉过敏的效果，相当于临床上患者经历数年慢性疼痛的情况。当需要评估短效化合物的疗效时，可于单日内多次重复进行反射性von Frey测试。

von Frey 机械敏感性测试
通过记录动物对具有确定抗张强度的系列 von Frey 纤维丝刺激产生的缩足反应次数，来量化足垫的敏感性，从而评估背痛模型的严重程度。最细.......

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讨论

这种慢性背痛模型易于诱导，且在1周内建立的痛觉过敏可持续长达（甚至可能超过）8周。这使得研究人员能够准确研究慢性疼痛状态，而不同于其他仅持续一至两周的急性模型。尽管本文以小鼠展示该模型，但uPA诱导的慢性背痛（CBP）模型同样可在大鼠中建立2。该模型的一个优势在于其较长的病程可诱发类似焦虑和抑郁的行为，这与慢性下背痛患者所表现出的症状一致。鉴于背痛的高发性16，该模型能够在分子疼痛研究中更常用的小鼠模型上实施，是一项显著优势。

使用uPA诱导疼痛模型的方法此前已通过关节内注射用于诱导骨关节炎3，但本文所示的方法（韧带内注射）操作更快，且对小鼠造成损伤的风险显著更低。该方法无需缝合，也不存在因穿刺关节腔而导致出血的风险。由于仅需一次注射且准备工作较少，因此也易于对技术人员实施盲法处理，从而获得更准确的结果。

该模型的主要局限性在于小鼠对 von Frey 测试的适当适应；事实上，建议在模.......

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披露

作者声明不存在竞争性财务利益。KNW 承认曾无偿为 NeuroChronix、Bessor Pharma 和 USA Elixeria BioPharm, Inc. 提供咨询。

致谢

资助由美国国立卫生研究院（NIH）HEAL UG3 NS123958项目提供。动物饲养设施已通过AAALAC的检查与认证。动物饲养于由实验室工作人员及实验动物资源部（DLAR）工作人员共同维护的动物资源中心（ARC）设施中。行为学测试的操作程序符合美国疼痛学会和国际疼痛研究协会批准的领域内标准方法。安乐死方法遵循美国兽医医学协会安乐死专家组提出的建议。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
<强>动物与耗材
70% 乙醇局部来源
BALB/c 小鼠Envigo20-25 g
棉球Fisher Scientific19-090-702
棉签Fisher Scientific19-062-616
异氟烷吸入麻醉剂MedVetRXISO-250
标签胶带Fisher ScientificNGFP7002
腈类检查手套Fisher Scientific
氧气瓶局部来源
手术铺巾，Steri-Drape 通用型铺巾，吸水防渗型VWR76246-788切成 15 x 15 cm 的片状
内径为3 mm的Tygon管格雷格纳22XH87
<强>仪器设备
#11 碳钢手术刀片VWR21909-612
麻醉诱导室 Summit Medical Equipment CompanyAS-01-0530-LG
高压灭菌局部单元
生物学杜蒙特#5镊子Fine Science Tools11252-30
玻璃珠灭菌器 Germinator 500VWR102095-946
IITC生命科学系列8型PE34热/冷板镇痛仪IITCPE34
Integra Miltex 棉签 &和敷料钳 Safco Dental Supply66-317
OPTIKA CL31 双臂LED照明器 纽约显微镜公司OPCL-31
带红外发射器的足底测试系统，即哈格里夫斯装置Ugo Basile37370-001 和 37370-002
3号手术刀柄VWR25607-947
小型动物加热垫 Valley Vet Supply47375
学生用Vannas弹簧剪，直刃 Fine Science Tools91500-09
便携式动物实验台式麻醉工作站 “PAM”Patterson ScientificAS-01-0007
Von Frey纤维丝Ugo Basile37450-275

参考文献

  1. O'Sullivan, P. B., et al. Back to basics: 10 facts every person should know about back pain. British Journal of Sports Medicine. 54 (12), 698-699 (2020).
  2. Nauta, H. J., McIlwrath, S. L., Westlund, K. N.

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Von Frey Hargreaves

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