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方法文章

尿激酶型纤溶酶原激活物诱导的小鼠背痛模型

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⸱

DOI：

10.3791/63997

⸱

2023年9月1日

 ,  ,  , 
1Department of Anesthesiology & Critical Care Medicine, University of New Mexico Health Sciences Center

本文内容

摘要

本文提供了利用尿激酶型纤溶酶原激活物进行韧带内注射，以快速、简便地建立小鼠背痛模型的方法。

摘要

通过本文所述的简单方法，可在小鼠中诱导出持续性下背痛模型。本研究提供了通过注射尿激酶型纤溶酶原激活物（尿激酶）——一种存在于人类及其他动物体内的丝氨酸蛋白酶——快速、简便地建立小鼠持续性背痛模型的逐步操作方法。诱导小鼠持续性下背痛的方法仅需在腰椎韧带附着区域注射尿激酶即可完成。该尿激酶作为炎症刺激剂，可将纤溶酶原激活为纤溶酶。通常情况下，该模型可在10分钟内成功建立，且痛觉过敏状态可持续至少8周。

在持续性模型中，可检测超敏反应、步态障碍以及其他标准的焦虑样和抑郁样指标。 背痛是最常见的疼痛类型。为了提高对背痛的认识，国际疼痛研究协会（IASP）将2021年命名为 "全球背痛年" 和2022年 "全球疼痛知识转化实践年" 疼痛治疗领域在治疗进展上存在一个局限性，即缺乏用于测试持续性和慢性疼痛的合适模型。 该模型的特征 适用于测试旨在减轻背痛及其相关症状的潜在治疗方法，有助于国际疼痛研究协会（IASP）将2022年命名为“将疼痛知识转化为临床实践全球年”。

引言

下背痛是导致残疾的最常见原因之一，全球约每5人中就有1人受其影响1。尽管如此，在疼痛研究领域，尤其是小鼠研究中，目前被广泛采用的可靠背痛动物模型仍然较少。以往的模型几乎 exclusively 使用大鼠来诱导慢性背痛（CBP），例如通过向腰椎小关节注射尿激酶型纤溶酶原激活物（uPA）2,3、向躯干肌肉注射神经生长因子（NGF）4，或向椎间盘内注射单碘乙酸钠（MIA）5 或白细胞介素-1β6。显然，大鼠之所以在这些模型中更受青睐，主要因其体型较大，便于炎症因子注射操作。

需要明确的是，背痛的小鼠模型确实存在，例如多年来用于椎间盘退变研究的 SPARC 基因敲除小鼠模型7，但这些模型的建立成本更高且耗时更长，相比基于注射的模型而言更为复杂。最近一项小鼠研究通过向腰部肌肉注射 NGF 并结合垂直慢性束缚应激，建立了一种下背痛模型8。在以下实验方案中，我们将原本在大鼠中建立的 uPA 诱导的慢性背痛（CBP）模型改进并应用于小鼠2。该模型可在 1 周内诱导出痛觉过敏，且痛觉敏感状态可持续 6–8 周。此外，我们还证实小鼠会表现出类似焦虑和抑郁的行为。鉴于背痛的高发性以及小鼠在分子水平疼痛研究中的更广泛应用，这一稳定可靠的模型可便捷地用于开发新的背痛治疗策略。

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方案

所述所有动物实验程序均符合美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物护理与使用指南》的要求。研究已获得新墨西哥大学健康科学中心机构动物护理和使用委员会（IACUC #23-201364-HSC）的批准。所有研究均遵守《研究中使用动物的OLAW合规保证书》（A3002-01）项下相关政策，具体如第三部分II. 保证与认证所述。动物饲养于由实验室人员及实验动物资源部（DLAR）人员共同维护的动物资源中心（ARC）饲养设施中。安乐死方法（注射100 µL浓度为59 mg/mL的戊巴比妥钠）快速、可靠，可便于后续解剖并采集多种组织用于进一步研究。

1. 动物

  1. 将成年（约3-4周龄）雄性和雌性BALB/c小鼠（20-25 g）饲养在反向12小时:12小时光照:黑暗循环条件下，使其在黑暗中的活跃期与实验室工作时间重合。
    注：由于啮齿类动物天生为夜行性动物，此方法可确保在动物自然活跃时段内进行各项参数的评估。这减少了昼夜节律时钟变化的干扰，使动物可在其活跃期（现为白天）接受测试。
  2. 每天对动物进行两次监测。
  3. 在评估药物对疼痛相关行为的影响时，应给予普通小鼠繁殖饲料喂养，该饲料的豆粕蛋白含量低于标准啮齿类动物饲料（已知会影响过敏反应）。
  4. 每周称重一次动物，以确保其保持健康的体重增长。
    ​注：在为期8-10周的研究过程中，各组间未观察到体重差异，从而保证了研究的盲法实施。

2. 模型诱导

  1. 在配备有固定稳定约束装置的温暖无菌平面上进行模型诱导，以固定小鼠位置（图1A）。在无菌表面上使用解剖显微镜进行手术。
    注意：若无麻醉吸入装置，可使用化学级通风橱。
  2. 若使用材料表中推荐的底板，可将末端系有橡皮筋的外科缝合丝线或普通纱线固定在板的肋状边缘，作为约束装置。
  3. 在手术装置旁的平面上设置加热垫恢复站，以便注射后立即将小鼠转移至该站（图1B）。
    注意：在注射前至少10分钟，将一个空饲养笼置于加热垫上，使笼子升温至适宜温度（37 °C）。将笼子一半置于垫子上，以便苏醒中的小鼠可选择不同的恢复温度区域。
  4. 将尿激酶用无菌水稀释。用酒精清洁Hamilton注射器，并用无菌水冲洗。提前抽取溶液，以尽量缩短小鼠处于麻醉状态的时间。建模时使用5 µL的2 mg/mL尿激酶原激活剂；假手术组使用5 µL无菌生理盐水。
  5. 为缩短操作时间，将异氟烷麻醉装置设定为4%或更低浓度。将小鼠放入诱导室；通常在1-2分钟内，小鼠快速的呼吸频率会减慢，呼吸运动由上胸部转为下胸部。
  6. 使用1.5 L/min的氧气流速，并配备活化炭F型滤罐，或在生物安全柜或顶部排风罩下操作，以清除异氟烷，避免动物外科操作人员暴露。若无上述设备，应在化学安全通风橱内进行操作。
  7. 迅速将小鼠和麻醉气流转移至置于37°C加热垫上的手术区域，将小鼠鼻部置入鼻罩以维持麻醉水平（图1C、D）。检查确认小鼠对脚趾夹捏无反射性反应，然后将其固定在底板上。
    注意：若仍有任何运动，应将小鼠重新放回诱导室并重复此步骤。
  8. 用酒精棉片清洁小鼠背部皮肤区域。根据需要调节LED照明，以清晰观察麻醉后小鼠的背部。
    注意：如有需要，可使用电动剃毛器去除小鼠背部毛发，以便清晰观察皮下脊柱突起。若实验组小鼠进行了剃毛处理，为保证研究盲法，也应对 naive 和假手术组小鼠的背部进行剃毛。
  9. 在小鼠完全麻醉且固定不动（无翻正反射，无脚趾夹捏回缩反应）时进行注射。用两根手指轻轻触摸小鼠肋骨下缘与脊柱交汇处（图2A）。该点下方为腰段脊柱区域；注射目标位置为L2-L3节段。
  10. 将Hamilton注射器针尖置于脊柱旁（图2B、C）。以约45°角将针头刺入紧邻骨组织的棘间韧带。
    注意：根据小鼠皮肤的坚韧程度，有时依靠重力而非主动加压，并采用90°角进针可能效果更佳。
  11. 轻柔而稳固地将针尖插入棘间韧带（图3B、C）。
    注意：目标并非穿透腹腔，而是将药物注入韧带组织。
  12. 缓慢排空针内全部内容物。若针尖出现液体，表明针头尚未完全穿透皮肤。持续注射直至5 µL液体全部注入。
  13. 保持针头原位约5秒，以防止注射液回流。建议在终末实验或急性预试验中使用蓝色染料进行验证。
    注意：若操作正确，液体应如图所示扩散至韧带内（图3A）。
  14. 轻柔缓慢地拔出针头。确保无血液或分泌物渗出。
  15. 将小鼠放入带笼盖的加热恢复站，直至其苏醒并恢复活动能力后再放回饲养笼。
    注意：若操作迅速，小鼠通常在1分钟内即可苏醒。
  16. 术后1小时内定期检查小鼠，确保其正常运动功能持续存在，作为预防措施。
    注意：若操作正确，本操作不应引起任何并发症。
  17. 术后一周内每日检查小鼠，包括体重评估和注射部位检查，以确保无感染或并发症发生。若小鼠出现行为改变（如体重减轻、嗜睡），则不得用于后续实验。

动物实验的实验室设置；麻醉工作站、小鼠饲养装置和检查设备。
图 1：尿激酶 CBP 诱导的实验装置。 (A) 推荐用于小鼠手术的 Fine Science Tools 基板。基板边缘的肋状结构可用于固定带钩的绳子，以固定小鼠位置。(B) 恢复站。建议使用一个空的饲养笼，一半置于加热垫上，另一半置于加热垫外。底部放置一块干净的布，为小鼠提供舒适的休息区域。(C) 麻醉机设置建议。使用双通道输送系统，将一根管路连接至诱导室，另一根管路连接至手术站。(D) 小鼠固定装置示意图。将两根绳子系在基板的肋状边缘，然后分别轻轻跨过小鼠颈部和后部进行固定。注意不要将小鼠束缚过紧，以确保其仍能正常呼吸。请点击此处查看该图的放大版本。

动物手术设置，特写，无菌区域准备技术，啮齿类动物，实验研究。
图 2：尿激酶注射诱导 CBP。 （A）注射部位定位示意图。如图所示，用手指触诊以找到小鼠肋骨下缘，作为定位 L4-L5 的参考点。（B）注射过程示意图，显示正确注射的角度。（C）此处推荐采用 45° 角度，但可根据实际情况调整，以确保针头到达目标位置。如有需要，可剃除注射部位毛发以获得更清晰的视野。请点击此处查看此图的放大版本。

脊柱解剖图、椎体注射、棘间韧带与横突间韧带、啮齿类动物模型。
图3：注射部位示意图。（A）注射部位位置的实物照片。此处使用墨水标记液体将注入L2与L3椎骨之间棘间韧带的位置。（B）从侧面视角显示针头正确置入位置及注射部位的示意图。（C）从上往下观察椎骨结构的示意图，显示棘间韧带的注射部位。通常注射位于脊柱旁的棘间韧带，但针头也可插入横突间椎骨之间的间隙。建议在预实验中使用蓝色染料，如图（A）所示。请点击此处查看该图的放大版本。

3. 行为学实验

  1. von Frey 机械性缩爪反射阈值测试
    注意：机械缩足阈值是指使用一系列8根直径递增、间隔约0.2 g的von Frey单丝纤维，在50%的试验次数中引出反应所需的最小力，其机械力呈对数级变化材料表).
    1. 使用 von Frey 纤维对后肢足底（腰骶神经的支配区域）施加机械刺激进行测试。术前测定足底回缩反应的基线值。术后在慢性实验期间每周测定一次机械阈值。 
    2. 将动物从饲养室转移至测试室，在测试前将其置于原笼中适应环境30分钟。随后，将动物逐一转移至测试桌面上带网盖的透明小隔间内进行固定，固定时间根据动物活动水平决定，为15-20分钟。
      注意：小鼠在适应固定箱内并处于静止状态、不再转动或移动后，方可开始实验。适应固定环境有助于减少由应激引起的影响。若小鼠维持在反向光照周期下饲养，实验应在红光条件下进行。
    3. 按照以下步骤及 Chaplan 等人的方法，使用系列递增强度的 von Frey 纤维进行测试。9.
      1. 使用3.61号von Frey纤维丝，在每只动物足垫的相同位置进行探测，当纤维丝弯曲时可产生0.4 g的刺激力。 g 力（材料清单）。随后使用可引发1.0反应的4.08 von Frey纤维丝进行刺激 g 力
        注意：这两种纤维均不会在未经处理的适应性动物中引发反应。
      2. 每个纤维施加5次 >以5秒间隔垂直作用于足垫，注意避免触碰褶皱/缝隙或毛发。阳性反应定义为在五次刺激中有三次出现足部回缩。依次使用系列中更细的纤维丝，直至动物对机械刺激无反应；此时改用下一规格较粗的纤维丝。若引发反应，则再次使用较细的纤维丝，重复测试直至在足垫机械刺激反应改变后完成四次试验。
      3. 利用曲线拟合算法，根据所得反应模式计算机械缩足阈值，即在50%的次数中引发反应所需的最小力值9与未处理小鼠或动物自身基线相比，引发足部回缩反应所需的力减小，表明动物的敏感性增加。
  2. 热反射反应阈值测试
    注意：热反应阈值和冷反应阈值分别通过 Hargreaves 实验和冷板实验测定。
    1. 哈格里夫斯试验
      1. 将小鼠置于由下方红外发射器加热的玻璃表面的隔间内。记录小鼠从接受红外光照开始至足部回缩的时间（以秒为单位）作为回缩潜伏期。50 °C仪器对小鼠后爪施加刺激，直至小鼠出现缩足反应。
    2. 冷板试验
      1. 将小鼠置于冷却至 - 的冷板装置上9 °C记录小鼠从放置到仪器上至开始抬脚的时间（秒），作为抬足潜伏期。
      2. 或者，将冷却至 - 的冷探针放置9 °C 将小鼠置于金属网笼上方，把装置置于小鼠后爪下方。记录从装置接触后爪至小鼠开始抬足、舔足或抖足所需的时间（秒），作为缩足潜伏期。为避免诱发伤害性反应，需先让小鼠在室温下适应探针的触碰。
  3. 认知与情绪依赖性行为检测
    注意：动物的长期过敏反应会导致情绪和认知依赖性功能障碍。通常在疼痛模型建立后的第6周仅测量一次，以避免练习效应。
    1. 焦虑测试
      注意：焦虑和抑郁也可通过可靠的方法进行检测，以评估模型的有效性。建议至少在造模注射后第4至6周再进行测试，以确保共病症状充分发展。对暗室而非明室的偏好可作为与伤害性感觉相关的焦虑的衡量指标。在零迷宫或十字迷宫测试中，疼痛模型小鼠在开放臂区域停留的时间较未经处理的对照组动物更短，表现出类似焦虑的行为。10,11.
      1. 明暗箱偏好实验：将每只动物放入具有通道连接两个隔室（10 cm × 10 cm × 10 cm）的场所偏好实验箱中3）。装置的一个腔室光线明亮，而另一侧则保持黑暗。每次10分钟测试期间，通过计算机监测动物的位置，以确定其在明暗区域的停留时间及穿梭次数。
        注：也可在测试箱上方安装摄像机，并手动记录在每个箱内停留的时间。
      2. 高架十字迷宫或零迷宫：将模型啮齿动物或未经处理的动物置于迷宫中，使用秒表记录其在迷宫封闭区域停留的时间。分别测定动物在两个有侧壁的“安全”区域和两个无遮挡的“不安全”区域的停留时间。有疼痛表现的动物更倾向于停留在封闭的安全区域。
        注意：焦虑样行为可在零迷宫或加号迷宫中进行检测（10 分钟）。零迷宫为环形跑道，而加号迷宫呈“加号”形状。两者均包含两个开放象限和两个封闭象限，可允许持续的探索行为。两种迷宫均离地 1 m 高，分别为圆形或加号形的环形通道，被划分为四个等大的象限。
    2. 蔗糖喷洒抑郁测试
      注意：蔗糖喷溅实验用于评估抑郁样行为。该实验通过测量因慢性疼痛导致的抑郁症状所引起的正常理毛行为缺失来进行评估。
      1. 记录喷洒10-30%蔗糖溶液于背部毛发后10分钟内理毛行为的频率、持续时间和潜伏期（~250 µL 靠近尾巴基部）。由不知情的观察者通过录像回放统计理毛行为的次数12.
        注意：该指数在慢性轻度应激等啮齿类动物情绪障碍模型中已被报道受到影响，并可被慢性抗抑郁药物治疗所纠正13.
    3. 新物体识别实验
      注意：认知功能障碍可通过新物体实验进行测量。
      1. 将小鼠单独放入一个顶部敞开的透明塑料笼（56 × 30 × 20 cm）中适应环境1小时。在笼子对角的两个角落各放置一个相同的玩具小人，持续5分钟。
      2. 测试当天，将动物再次放入透明笼中适应1小时，随后将两个相同的微型模型放置在笼内相同位置，持续5分钟，之后将动物放回饲养笼中。
      3. 将其中一个原始物体替换为明显不同的新物体，4小时后将小鼠放回测试笼，记录其探索物体所用的时间。
      4. 将探索新物体的时间占总物体探索时间的百分比计算为报告的识别指数（RI）14.
    4. 运动功能评估
      注意：墨迹移动性与步态障碍测试15 评估背痛模型中的运动功能。
      1. 将一张纸巾筒沿一侧纵向剪开，卷成一个隧道状结构。将其展开并平铺在一张干净的打印纸上。
      2. 用毛巾轻轻包裹小鼠，直至其安静。将小鼠的足部置于蘸有无毒印度墨水的印垫上以沾取墨水，或用棉签蘸取墨水涂抹于小鼠足底。将小鼠置于隧道入口处释放，使其沿隧道跑过，并在末端将其捕获。
      3. 根据三个参数对足印进行评分：步长（一个足印后端到下一个足印之间的垂直距离）、步宽（足印之间的水平距离）和趾展（足印对侧脚趾之间的距离）。
        注意：也可使用批准的零食来诱导小鼠穿过隧道。若爪印模糊或不清晰，实验必须重复。

通过Von Frey、Hargreaves和冷探针试验进行疼痛敏感性分析；统计柱状图。
图 4CBP 诱导后出现的机械性和热痛超敏反应 疼痛在模型诱导后一周可测量，并持续8周。A冯·弗雷试验。机械阈值检测采用冯·弗雷细丝，通过网格顶板作用于足垫，使用上下法进行测试，持续4周，结果如图所示。 naive雄性小鼠的阈值（绿色）被naive雌性小鼠的蓝色曲线覆盖。CBP小鼠（n = 4只雄性，4只雌性）与naive对照组（n = 2只雄性，2只雌性）相比，表现出显著增强的机械敏感性。对这些数据进行双因素方差分析（Dunnett多重比较检验）：每组n = 4。在 事后 分析，所有数据的邦弗罗尼校正 PCBP与Naïve组的周间比较得到的P值全部为11个 < 0.0011. **** p < 0.0001. (B) Hargreaves试验。使用Hargreaves试验在足底测定热痛阈值（50 °C）。CBP 小鼠（n = 12 只雄性，12 只雌性）与 naive 对照组（n = 6 只雄性，6 只雌性）相比，表现出显著增强的热敏感性。Mann-Whitney 双尾检验 t-检验用于检验显著性（p < 0.0001). (C) 冷敏感性。通过将小鼠置于冷却至 - 的冷板装置上进行冷探针实验9 °C从将小鼠放置于装置上到小鼠开始抬足、舔足或抖足的时间（秒）记录为缩足潜伏期。在所示数据中，冷探针冷却至 -9 °C 将冷板置于小鼠后爪下方，同时将小鼠饲养在金属网格笼顶上。所有小鼠均在注射后1–3周进行测试。与 naive 对照组小鼠（n = 2只雄性，4只雌性）相比，CBP 小鼠（n = 4只雄性，6只雌性）表现出显著增强的冷敏感性。Mann-Whitney 双尾检验 t-检验用于检验显著性（p = 0.0002). 请点击此处以查看此图的放大版本。

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结果

伤害性相关行为学测试与数据分析
诱发性检测指标
注射尿激酶后一天内，足垫出现痛觉过敏。一周内，缩足阈值显著降低，并持续至动物被实施安乐死；该现象至少持续至术后第4周（图4A）。缩足潜伏期通过von Frey上下法9和Hargreaves试验进行分析。在所示示例中，慢性骨盆疼痛（CBP）小鼠（雄性4只，雌性4只）与对照组（雄性2只，雌性2只）相比，表现出显著增强的机械敏感性。该模型效应在第6至7周逐渐消退。这一时间进程可用于评估化合物在慢性时间点减轻痛觉过敏的效果，相当于临床上患者经历数年慢性疼痛的情况。当需要评估短效化合物的疗效时，可于单日内多次重复进行反射性von Frey测试。

von Frey 机械敏感性测试
通过记录动物对具有确定抗张强度的系列 von Frey 纤维丝刺激产生的缩足反应次数，来量化足垫的敏感性，从而评估背痛模型的严重程度。最细...

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讨论

这种慢性背痛模型易于诱导，且在1周内建立的痛觉过敏可持续长达（甚至可能超过）8周。这使得研究人员能够准确研究慢性疼痛状态，而不同于其他仅持续一至两周的急性模型。尽管本文以小鼠展示该模型，但uPA诱导的慢性背痛（CBP）模型同样可在大鼠中建立2。该模型的一个优势在于其较长的病程可诱发类似焦虑和抑郁的行为，这与慢性下背痛患者所表现出的症状一致。鉴于背痛的高发性16，该模型能够在分子疼痛研究中更常用的小鼠模型上实施，是一项显著优势。

使用uPA诱导疼痛模型的方法此前已通过关节内注射用于诱导骨关节炎3，但本文所示的方法（韧带内注射）操作更快，且对小鼠造成损伤的风险显著更低。该方法无需缝合，也不存在因穿刺关节腔而导致出血的风险。由于仅需一次注射且准备工作较少，因此也易于对技术人员实施盲法处理，从而获得更准确的结果。

该模型的主要局限性在于小鼠对 von Frey 测试的适当适应；事实上，建议在模...

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披露

作者声明不存在竞争性财务利益。KNW 承认曾无偿为 NeuroChronix、Bessor Pharma 和 USA Elixeria BioPharm, Inc. 提供咨询。

致谢

资助由美国国立卫生研究院（NIH）HEAL UG3 NS123958项目提供。动物饲养设施已通过AAALAC的检查与认证。动物饲养于由实验室工作人员及实验动物资源部（DLAR）工作人员共同维护的动物资源中心（ARC）设施中。行为学测试的操作程序符合美国疼痛学会和国际疼痛研究协会批准的领域内标准方法。安乐死方法遵循美国兽医医学协会安乐死专家组提出的建议。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
<强>动物与耗材
70% 乙醇局部来源
BALB/c 小鼠Envigo20-25 g
棉球Fisher Scientific19-090-702
棉签Fisher Scientific19-062-616
异氟烷吸入麻醉剂MedVetRXISO-250
标签胶带Fisher ScientificNGFP7002
腈类检查手套Fisher Scientific
氧气瓶局部来源
手术铺巾，Steri-Drape 通用型铺巾，吸水防渗型VWR76246-788切成 15 x 15 cm 的片状
内径为3 mm的Tygon管格雷格纳22XH87
<强>仪器设备
#11 碳钢手术刀片VWR21909-612
麻醉诱导室 Summit Medical Equipment CompanyAS-01-0530-LG
高压灭菌局部单元
生物学杜蒙特#5镊子Fine Science Tools11252-30
玻璃珠灭菌器 Germinator 500VWR102095-946
IITC生命科学系列8型PE34热/冷板镇痛仪IITCPE34
Integra Miltex 棉签 &和敷料钳 Safco Dental Supply66-317
OPTIKA CL31 双臂LED照明器 纽约显微镜公司OPCL-31
带红外发射器的足底测试系统，即哈格里夫斯装置Ugo Basile37370-001 和 37370-002
3号手术刀柄VWR25607-947
小型动物加热垫 Valley Vet Supply47375
学生用Vannas弹簧剪，直刃 Fine Science Tools91500-09
便携式动物实验台式麻醉工作站 “PAM”Patterson ScientificAS-01-0007
Von Frey纤维丝Ugo Basile37450-275

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