从不同脂肪组织库中分离和鉴定血管内皮细胞用于后续应用

摘要

本方案详细描述了一种小鼠脂肪组织库的解剖方法，以及相应动脉的分离与消化，以释放并鉴定内皮细胞群体。该方法获得的原代细胞可用于后续实验，有助于深入理解血管细胞生物学及血管功能障碍的机制。

摘要

构成血管系统管壁的血管内皮细胞在多种生理过程中发挥着重要作用，包括血管张力调节、屏障功能以及血管生成。内皮细胞功能障碍是严重心血管疾病进展的重要预测标志和主要驱动因素，然而其潜在机制尚不完全清楚。能够以原始形态分离并分析来自不同血管床的内皮细胞，将有助于深入理解心血管疾病的发病过程。本实验方案介绍了从小鼠皮下及肠系膜脂肪组织中分离动脉血管的操作步骤，随后通过特异性消化酶混合液处理，释放出具有功能活性的内皮细胞。利用流式细胞术对消化后的组织进行分析，以CD31+/CD45−细胞作为阳性内皮细胞的鉴定标志。所获得的细胞可直接用于下游功能实验，或用于建立原代细胞系。该从不同血管床分离并消化动脉的技术，为研究人员提供了获取特定动脉来源的新鲜血管细胞 的可行方法，并支持对特定细胞类型开展多种功能检测。

引言

内皮细胞因其在多种生理过程中的重要作用而广为人知，包括屏障功能、血管生成以及血管张力调节^1,2。尽管内皮细胞功能障碍在促进动脉粥样硬化、高血压、糖尿病等疾病中的作用已有充分记载，但驱动内皮功能障碍的潜在机制仍不甚清楚，且可能在不同的血管床之间存在差异^2,3,4。由于难以从组织中获得纯度较高的内皮细胞群体，以及内皮细胞在培养过程中易发生表型改变，使得揭示内皮细胞功能障碍的病理机制面临挑战^5,6。因此，能够在原生状态下分离并分析来自不同血管床的内皮细胞，将有助于深入理解心血管疾病的发病过程。

本方案介绍了从小鼠中分离皮下和肠系膜脂肪组织，并进一步分离其相应动脉血管的操作步骤。通过使用特定的酶混合液，可从动脉管壁释放出具有功能活性的内皮细胞。在消化程序中，特别优化了反应条件，以便从<1 mg的起始组织中获得足够数量的内皮细胞，同时保持其生物分子标志物的完整性，以供后续分析。 随后通过流式细胞术对分离得到的内皮细胞进行鉴定。CD31（PECAM）的表达被用于初步识别内皮细胞。由于CD31也在其他细胞类型（包括多种造血来源且表达CD45的细胞）中表达，因此通过排除同时表达CD31和CD45的细胞，进一步提高了所分离内皮细胞的纯度^5,6,7,8。此外，根据具体的研究问题及后续应用，研究人员应考虑选用更广泛的阳性和阴性筛选标志物组合，以优化目标细胞群体的纯度。

尽管分离和解剖脂肪组织动脉的技术已在先前的文献中被使用^{9,10,11,12,13}，目前尚未有详细描述分离嵌入式动脉的实验方案。展示从特定目标物种的不同血管床中分离和消化动脉的技术，将为研究人员提供评估新鲜分离的血管细胞的可行方案 从目标动脉中分离细胞，使其能够对特定细胞类型进行多种功能检测。检测方法可能包括但不限于流式细胞术，用于细胞分选和膜蛋白表达分析^5,8，用于离子通道活性的电生理学⁹分子谱型分析（蛋白质组学/基因组学分析等）^14,15以及用于药物筛选的原代细胞系的建立 体外^16,17.

方案

这些研究中使用动物的方案已获得特拉华大学机构动物护理和使用委员会（#1372）的批准。

1. 组织解剖与清洗

注意：视频方案中使用的是 10 至 12 周龄的 C57BL/6J 小鼠。有关组织解剖及动脉清理的示意图和预期结果，请参见图 1；有关耗材列表及生产厂家信息，请参见材料表。

1. 通过 CO 处死小鼠₂ 窒息后颈椎脱位。
2. 用解剖针固定小鼠，并用70%乙醇喷洒腹面。
3. 分离位于后肢每侧的皮下脂肪组织
   ​注意：所需解剖工具：直型博恩剪刀（9 cm）和钝头弯型格雷费镊。
   1. 用镊子提起生殖器上方的皮肤，并在皮肤上做一个约2 mm的小切口。
   2. 将剪刀尖插入切口处，从初始切口开始沿中线向上作一4-5 cm的切口，解剖至胸骨基底部。注意避免穿透腹腔。
   3. 在前肢正下方、紧邻中线处，做一个向侧方延伸1厘米的切口。
   4. 在后肢与生殖器之间做一条1厘米长的斜切口。
   5. 沿中线皮肤切口做小切口，剥离相关结缔组织，暴露皮下脂肪组织。将皮肤固定。
   6. 确定 "C 形" 皮下脂肪组织以及与腹腔垂直走行的动脉/静脉。
   7. 从C形区域靠近生殖器的底部开始，轻柔地捏住脂肪组织以暴露结缔组织。在结缔组织上做小切口，将脂肪与皮肤分离。注意避免扰动已暴露的血管结构。
   8. 继续剥离结缔组织，直至皮下脂肪组织能够完整移除。小心地将暴露的动脉与周围结缔组织分离。
   9. 将分离的皮下脂肪组织置于冰上的HEPES缓冲液中保存，直至准备分离目标血管床。
   10. 对剩余的后侧皮下脂肪组织库重复执行步骤1.3.3–1.3.5。
4. 肠系膜脂肪组织库的分离
   注意：所需解剖工具包括：直型Bonn剪刀（9 cm）、Graefe镊、#5镊子一对、直型虹膜剪刀和弯型Bonn剪刀（9 cm）。
   1. 使用格雷夫镊子提起膀胱上方的薄层腹膜壁，并用直剪刀做一小切口。
   2. 缓慢提起已穿透的腹腔壁，小心将直型虹膜剪插入切口处，从膀胱开始沿中线向胸骨方向做一长度为4-5 cm的切口。
   3. 用直虹膜剪在中线两侧各做两个1厘米长的横向切口，分别延伸至后肢上方和前肢下方。用格拉夫镊子剥离腹肌，暴露腹膜内脏。
   4. 在另一侧重复步骤 1.4.3。
   5. 使用5号镊子将肠管从体腔中提起，以暴露肠系膜脂肪组织。
   6. 使用弯剪和#5镊子分离沿结肠分布的脂肪组织，从盲肠开始，直至结肠向下消失处。
   7. 返回盲肠，使用弯剪和#5镊子沿小肠分离脂肪组织至胰腺。切除一小部分胰腺，以完全分离肠系膜脂肪组织。
      ​注意：在清除动脉时，连同肠系膜脂肪一并切除少量胰腺组织，可能有助于动脉的清理，因为这可在清理过程中提供稳定性。
   8. 将分离的肠系膜脂肪组织置于冰上的HEPES缓冲液中保存，直至准备分离肠系膜动脉。
5. 从皮下和肠系膜脂肪组织中分离相应动脉
   注意：所需解剖工具包括：解剖皿、带光源的体视显微镜、一对#55镊子和一对#5镊子。
   1. 将约10 mL冷的HEPES缓冲液加入解剖皿中，使用#5镊子将脂肪组织转移至皿内。
   2. 使用体视显微镜在1倍放大倍数下观察并调整脂肪组织的位置，以暴露动脉/静脉对图2).
   3. 使用#55镊子小心地从动脉上剥离实质脂肪组织。每次去除少量脂肪组织，并在体视显微镜下仔细观察动脉/静脉配对结构，以识别并避免损伤目标血管。
      注意： 根据需要调整放大倍数和光源以清理动脉。在去除脂肪组织时，应增加放大倍数和光照强度，以便更清晰地观察动脉。动脉的精细清理应在4x–5x放大倍数下进行。需注意区分结缔组织（胶原）、静脉和动脉。结缔组织和胶原纤维呈无分支的丝状结构，有条纹，颜色偏白。与胶原纤维和结缔组织不同，动脉和静脉呈透明状，具有多个分支和明确的管腔。当周围实质组织被清除后，小动脉和小静脉在外观上可能较为相似。管腔中是否存在血液有助于进一步区分动脉与静脉。静脉的血管壁较薄，管腔较大，且相比同等大小的动脉含有更多的血液。
   4. 重复步骤1.5.3，直至动脉完全去除实质脂肪组织。
   5. 使用5号镊子将清洗后的动脉转移至含有新鲜HEPES缓冲液的新离心管中，置于冰上保存，直至准备进行消化。

2. 分离动脉的消化以获取内皮细胞

注意：请参见图2以了解组织消化及内皮细胞分离的示意图，以及材料表以获取本实验方案所需全部耗材的完整列表。

1. 向每个 2 mL 微量离心管中加入 1 mg 的分散酶（dispase）和弹性蛋白酶（elastase）。向每根管中加入 2 mL 解离溶液。涡旋混匀，并在 37 °C 下孵育至完全溶解。使用 #5 镊子将清洗后的动脉（步骤 1.5.5）转移至相应的样品管中。每种酶的终浓度为 0.5 mg/mL。
2. 在 37 °C 下孵育 1 小时，每 10–15 分钟轻轻颠倒混匀一次，使动脉悬浮于溶液中，以确保酶与动脉之间持续且均匀地接触。
3. 按每份样品称取 1 mg I 型胶原酶（collagenase type I），并加入新的离心管中。
4. 让动脉沉降至管底。小心移除顶部 500 µL 缓冲液，避免扰动动脉，将其转移至含有胶原酶的指定管中。涡旋混匀后，将溶液重新加回到原始样品管中的相应样品中。I 型胶原酶的终浓度为 0.5 mg/mL。
5. 在 37 °C 下孵育 15 分钟。轻微振荡样品管后，应观察到动脉分解成碎片。若扰动后动脉未分解成碎片，则以 5 分钟为间隔继续孵育，直至可见动脉明显解离。
6. 使用玻璃移液管剧烈吹打消化后的组织 10–15 次，以机械方式解离细胞。
7. 将溶液和消化后的组织通过 70 µm 细胞滤网或流式细胞术管滤网过滤，以获得单细胞悬液。

3. 流式细胞术前内皮细胞的染色

注意：内皮细胞的染色和处理步骤均在冰上进行，以提高细胞活力，除非另有说明。将5 mL聚苯乙烯圆底管在室温（RT）下以1,163 × g 离心3分钟。

1. 将单细胞悬液在室温下以 1,163 × g 离心 3 分钟。
2. 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 1 mL PBS + 5% BSA 中，在室温下孵育 30 分钟。
   注意：研究人员应根据细胞类型、目标分子及所用抗体，考虑是否阻断 Fc 受体^18,19。
3. 加入 1 µL 细胞活力染料（激发波长 405 nm）（材料表），避光孵育 30 分钟，室温下进行。
4. 将细胞悬液在室温下以 1,163 × g 离心 3 分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 200 µL PBS + 1% BSA 中。
5. 向样品中加入与 CD31（CD31-PE，每样品 0.75 µg）和 CD45（CD45-FITC，每样品 2.5 µg）偶联的一抗抗体，用铝箔包裹样品后，在冰箱中于摇床上孵育 15 分钟。
   注意：为识别和/或获得纯度较高的内皮细胞群体，应使用具有不同激发/发射荧光特性的 CD31 和 CD45 偶联一抗对 CD31 和 CD45 进行检测，并分选或设门获取 CD31⁺CD45⁻ 表型的细胞。根据所用荧光染料的不同，可能需要进行补偿调节^18,20,21。
6. 直接向细胞悬液中加入 1 mL PBS + 1% BSA 洗涤细胞。
7. 将细胞悬液在室温下以 1,163 × g 离心 3 分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于含 0.1% BSA 的 200 µL 1% 甲醛溶液中。用铝箔包裹后置于冰箱中保存，直至进行流式细胞术分析。
   注意：减少洗涤和离心步骤有助于提高细胞得率。具体操作可能需根据实验目的进行调整。固定后的样品应在 24 小时内完成分析。

结果

工作流程示意图见图1。该示意图突出了在实验方案文本中更详细描述的各步骤。图2展示了皮下脂肪组织（图2A，左）在解剖后的图像，以及实质组织清理后的皮下动脉弓（图2A，右）图像。图2还展示了肠系膜脂肪组织（图2B，左）在解剖后的图像，以及实质组织清理后的肠系膜动脉弓（图2B，右）图像。

本文所述方案旨在帮助可能对以下方面感兴趣的科研人员：a）在基础科学研究和/或疾病模型中比较不同脂肪组织血管床；b）在分离目标血管细胞用于后续应用之前，对血管床进行消化处理；以及 c）利用流式细胞术鉴定目标血管细胞（图3），其应用范围广泛，包括但不限于本文所进行的蛋白质表达分析（图4）。图3 详细展示了我们通过流式细胞术从消化后的小鼠动脉中鉴定内皮细胞的示例。在固定前，对来自消化后的皮下脂肪动脉（图3A）或肠系膜脂肪动脉（图3B）获得的细胞悬液，使用CD31-PE、CD45-FITC及细胞活力染料进行染色，随后通过流式细胞术鉴定活的CD31+CD45−内皮细胞，该方法与已有文献报道的方法类似⁸。细胞活力染色可确保仅分析在分离和消化过程后仍保持活性的细胞。采用本方法可使研究人员评估目标活体血管细胞的表达水平或功能状态。

为了确定从不同脂肪组织血管床分离的内皮细胞在膜蛋白表达上是否存在差异，对分离的细胞进行了脂肪酸转位酶CD36的检测图4），因为最近的研究表明，这种膜蛋白在内皮介导的脂肪酸向组织的分布过程中起着关键作用²²因此，确定不同血管床中膜CD36的相对表达差异可能：a）支持现有关于不同组织对脂肪酸利用存在差异偏好的数据，和/或 b）揭示在健康与疾病状态下脂肪酸组织分布中潜在的新差异。上述结论基于文中所示消化后血管细胞制备样本得出 图3，鉴定出皮下组织中的CD31+CD45−CD36+内皮细胞图4A）和肠系膜（图4B脂肪组织，并在每个血管床的该细胞群中定量了CD36的表达。 图 4C 和 图4D 结果显示，与肠系膜内皮细胞相比，皮下内皮细胞中表达CD36的细胞比例以及CD36表达强度均更高。这些初步发现支持我们采用该方法来识别不同血管床之间的差异。

图1从皮下和内脏脂肪组织中分离内皮细胞用于下游应用的工作流程 (A)10-12周龄的C57BL/6J小鼠经安乐死后用于演示本实验操作。生物首先，去除皮下脂肪组织。Bii随后，去除肠系膜（内脏）脂肪组织。白色虚线分别指示皮下（左侧）和肠系膜（右侧）脂肪组织在分离和去除后的解剖位置。相应动脉被分离出来用于后续实验应用。C在本方案中，分离的动脉接下来将使用特定的酶混合液进行消化，这是获得功能完整的内皮细胞的第一步。D通过使用偶联抗体在流式细胞术分析前对CD31+和CD45−细胞进行检测，以鉴定分离的内皮细胞。具有CD31表达特征的细胞⁺/CD45⁻ 是额外分析所关注的内皮细胞。 请点击此处以查看该图的放大版本。

图 2：分离的皮下和内脏脂肪组织及其相应的动脉。 （A）左：从后肢分离的“C形”皮下脂肪组织。当去除实质脂肪组织后，可见皮下脂肪动脉的一个主要分支（箭头所示，1）。右：分离的皮下脂肪动脉。（B）左：从肠道分离的肠系膜（内脏）脂肪组织。右：通过去除实质组织分离出相应的动脉弓。脂肪组织图像（5 mm）与动脉图像（1 mm）采用不同的比例尺。请点击此处查看此图的放大版本。

图3：通过流式细胞术鉴定动脉组织消化后的内皮细胞。 代表性图显示从分离的（A）皮下或（B）肠系膜脂肪动脉中释放出的细胞。在固定前，细胞与靶向CD31（PE）和CD45（FITC）胞外表位的偶联抗体孵育。使用流式细胞术鉴定CD31+CD45−内皮细胞群体。使用细胞活力染料仅筛选出在分离和消化过程中存活的细胞，用于后续分析。此外，若已知目标细胞类型的大小，在此阶段进行适当的设门可进一步将目标细胞群体与污染细胞区分开来。请点击此处查看该图的放大版本。

图 4：通过流式细胞术分析皮下与肠系膜脂肪动脉内皮细胞中 CD36 膜表达。 代表性细胞群图谱和直方图显示内皮细胞 CD36（APC）膜表达在（A）皮下或（B）肠系膜脂肪动脉中的情况。（C）表达 CD36 的内皮细胞（ECs）在皮下与肠系膜 ECs 中的比例（n = 5，3 名男性，2 名女性；*p < 0.05，经 Student's t 检验）。（D）皮下与肠系膜脂肪动脉内皮细胞膜 CD36 表达的标准化结果（n = 5，3 名男性，2 名女性；*p < 0.05，经 Student's t 检验）。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

内皮功能障碍是严重疾病状态的前兆，可能促进动脉粥样硬化、高血压和中风的发生发展^3,23尽管在特定病理状态下内皮功能障碍所涉及的已知机制众多，但不同的血管床可能受到病理状态的不同影响。^4,24此外，不同的心血管危险因素（如肥胖、高血压、血脂异常、吸烟、糖尿病）通过多种不同的机制引起功能障碍。^23,25因此，从已建立的疾病动物模型或可获取的人体组织中分离内皮细胞群体，并对刚分离的细胞立即进行检测至关重要 体内 环境。以这种方式分离细胞相较于在培养条件下研究细胞具有独特优势，因为其避免了由培养引起的表型改变^5,6此外，包含异质性的内皮细胞群体，正如所观察到的那样 体内^26,27 （并可通过流式辅助细胞分选进一步分离）来自活体生物的样本能更准确地反映 体内 最后，该方法适用于多种动物模型的研究，并有望用于人体组织，如有需要，还可用于建立原代细胞系。

本方案中的关键步骤，也是针对本文未涉及的不同血管床或细胞类型最需要调整的步骤，是血管组织的消化。该步骤必须在不降低细胞得率的前提下优化细胞活性。所使用的特定酶种类及消化时间对于优化细胞活性和得率至关重要，以确保能够充分进行后续检测。为了鉴定皮下和肠系膜内皮细胞中CD36的膜表达（通过流式细胞术检测，图4），我们开发了一种改良的消化方案，其最初是为膜片钳电生理实验设计的²⁸。该改良方案将胶原酶I的消化时间延长至30分钟，以提高细胞得率，更好地满足流式细胞术相较于膜片钳研究更高的细胞数量需求。由于此修改可能在一定程度上影响细胞活性，因此在流式细胞术分析中使用了细胞活力染料，以确保仅对本方案处理后存活的内皮细胞进行评估（图3）。建议在开展从血管组织中分离细胞的研究时，在评估目标指标前应包含细胞活力标记物。

本方案足以从源自小鼠的≤1 mg动脉样本中释放出具有活性的内皮细胞，用于分析及后续应用；然而，如果目标动脉来源于不同组织或生物体（例如人类），导致动脉质量显著不同，则需要优化消化酶的成分和孵育时间，以高效分离目标细胞群体。对于某些起始组织量比本研究中提供的皮下和肠系膜血管床更少的血管床（例如冠状动脉），每个样本可能需要合并多只小鼠的动脉。事实上，鉴于该实验方法要求相对较高的细胞得率，这可能是针对任何特定血管床所必需的步骤。一个主要局限性在于，由于每个样本消化过程存在个体差异，即使来自同一血管床，不同批次间的细胞得率有时也可能存在显著差异。这在数据分析时可能引发问题，应通过适当的归一化方法予以校正。例如，由于皮下和肠系膜脂肪动脉各个样本间细胞得率的波动，CD36的原始数据表现出极大的变异性。因此，原始数据被归一化至CD31+CD45−的平均荧光强度，假设该方法可校正批次间的差异（图4）。当然，根据具体实验设计，可能需要采用更复杂的统计分析和归一化方法。

综上所述，本文介绍了一种从小鼠分离皮下和肠系膜动脉并进行消化的方法，以研究内皮靶标分子的表达和/或功能。通过对本方案进行适当修改，还可用于研究不同的血管床及细胞类型（例如平滑肌细胞）。该方案可作为多种现有实验方法的基础，有望推动对血管细胞生物学及血管功能障碍机制的理解。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
组织解剖工具
5号镊子（2把）	Fine Science Tools	11252-00	用于肠系膜脂肪库的分离及动脉转移
55号镊子（2把）	Fine Science Tools	11295-51	用于实质脂肪组织的去除
弯头Bonn剪刀	Fine Science Tools	14061-10	用于肠系膜脂肪库的分离
Graefe镊子	Fine Science Tools	11051-10	用于常规解剖步骤及皮下脂肪库的分离
直头Bonn剪刀	Fine Science Tools	14060-09	用于常规解剖步骤及皮下脂肪库的分离
带光源体视显微镜	Laxco	Z230PT40	用于实质脂肪组织的去除及动脉分离
动脉消化用消化酶
胶原酶I型	Wothington-BioChem	LS004194
分散酶（中性蛋白酶）	Wothington-BioChem	LS02110
弹性蛋白酶	Wothington-BioChem	LS002292
溶液配方
HEPES缓冲液，pH 7.4			终浓度
二水合氯化钙	J.T.Baker	1332-1	2 mM
无水右旋糖（D-葡萄糖）	Fisher	D16-500	10 mM
HEPES	Fisher	BP310-500	10 mM
氯化镁	Fisher	M33-500	1 mM
氯化钾	Fisher	P217-500	5 mM
氯化钠	Oxoid	LP0005	145 mM
解离溶液，pH 7.30–7.40
无水右旋糖（D-葡萄糖）	Fisher	D16-500	10 mM
HEPES	Fisher	BP310-500	10 mM
氯化镁	Fisher	M33-500	2 mM
氯化钾	Fisher	P217-500	56 mM
氯化钠	Oxoid	LP0005	55 mM
L-谷氨酸钠一水合物	TCI	G0188	80 mM
流式细胞术分析
5 mL 聚苯乙烯圆底试管（带细胞筛网帽）	Falcon	352235
CD31-PE	Miltenyi Biotec	130-119-653	0.75µg/样本
CD36-APC	R&D Systems	AF2519	2.5µg/样本
CD45-FITC	BioLegend	103108	2.5µg/样本
活/死细胞可固定紫染试剂盒（细胞活力染色）	Invitrogen	L34955	1µL/样本