酿酒酵母黏附与琼脂侵袭实验

摘要

我们描述了一种用于检测酵母黏附性和琼脂侵袭性的定性实验方法，以此作为衡量酵母侵袭性及假菌丝分化的指标。该简单实验可用于评估不同突变体的侵袭表型，以及环境信号和信号通路对酵母分化的效应。

摘要

酵母存在于自然形成的生物膜中，许多微生物在其中定植于各种表面。在人工环境中，例如人造物体的表面，生物膜可能降低工业生产效率、破坏结构并威胁人类健康1-3。另一方面，利用生物膜的能力有助于环境修复和可持续能源的生成4-8。 酿酒酵母（S. cerevisiae）能够定植于表面并参与复杂生物膜的形成，这一能力在很长一段时间内未受重视，直到人们重新发现该生物体中由多种信号通路和环境信号触发的分化程序后才引起关注9,10。由于S. cerevisiae作为模式生物在研究信号通路（如Ras-PKA、Kss1 MAPK和Hog1渗透压通路）之间的相互作用与整合方面持续受到关注，使其迅速成为生物膜生物学与信号转导研究的交汇点11-20。在此背景下，酵母细胞分化为长而具有黏附性的假菌丝结构，成为检测多种环境变化下信号转导通路激活情况的便捷表型读出方式。然而，假菌丝形成是一组复杂的表型集合，若将其视为单一简单表型进行检测，容易导致结果误导。过去十年中，一些源自细菌生物膜研究的方法已被成功应用于酵母研究，例如利用MAT形成实验检测菌落在软琼脂上的扩展能力，或采用结晶紫染色法对细胞表面黏附进行定量测定12,21。然而，在用于定性评估酵母在琼脂中黏附与侵袭表型的实验方法上仍存在一些混淆。 本文介绍一种简单且可靠的方法，通过清晰易懂的步骤来分别评估酵母菌株的黏附性和侵袭性，从而将黏附性评估与侵袭性评估区分开来。本方法借鉴自先前的研究10,16，包括在液体培养基中培养细胞，随后将其接种于不同营养条件下以形成较大的菌落斑点，接着用水冲洗以评估黏附性，或彻底擦除琼脂表面的细胞以评估其向琼脂内部的侵袭能力。我们省略了传统的划线接种步骤，因其会影响细胞向琼脂内部的侵袭。总体而言，我们观察到能够侵入琼脂的单倍体菌株均具有黏附性，但并非所有黏附性菌株都能侵入琼脂培养基。本方法可与其他实验联合使用，以深入解析酵母信号转导、分化、群体感应及生物膜形成的各个步骤及其所需条件。

方案

1. 取200 µl处于生长状态的待测菌液，点样于含有相应饥饿条件的合成培养基平板上（例如，SC培养基含2%葡萄糖 versus SC培养基含0.2%葡萄糖）。若各菌液密度差异较大，请调整每200 µl菌液中的细胞数量，使每个点样液滴含有大致相同数量的细胞。
2. 务必记录平板上每个点样位置所对应的菌株。
3. 将平板盖子略微打开，置于室温或30°C环境中，直至液滴完全干燥。
4. 用封口膜和塑料薄膜密封平板（可选），并在30°C下培养3至7天。
5. 记录细胞在平板上的生长情况（通过扫描或拍摄数码照片等方式）。
6. 用高压水（建议使用去离子水）冲洗琼脂表面约1分钟，以洗去细胞，注意避免琼脂层翘起或移位。
7. 将平板轻拍于纸巾上以去除多余水分，并敞开放置使其干燥。
8. 待平板完全干燥后，记录每块平板上的黏附情况（通过扫描或拍摄数码照片）。
9. 戴上手套，用手指在流水下轻轻揉搓约1分钟，将琼脂表面的细胞彻底擦除。
10. 按前述方法再次干燥平板。
11. 若使用解剖显微镜，请在将平板放置于显微镜载物台前先移除针头。
12. 使用10×或40×放大倍数记录侵入性生长情况。对焦时应集中在每个菌落圆圈的中央区域，因为边缘区域过于密集，难以观察单个细胞形态。边缘区域可反映丝状生长的程度，可一并记录以供后续参考。对整个平板进行扫描或拍摄数码照片也可能有所帮助。

讨论

酵母细胞根据营养物质的可利用性和环境条件表现出多种分化模式，包括在饥饿和应激条件下形成孢子、在多种营养胁迫下发生丝状生长，以及发生絮凝。多种酵母，如酿酒酵母（S. cerevisiae）和白色念珠菌（C. albicans），也可存在于由多种微生物形成的生物膜中。尽管丝状生长与侵袭行为之间存在一定的相关性，但目前尚不清楚丝状生长究竟如何导致对表面和组织的侵袭与定植。在自然界以及威胁人类健康的场所（如导管和感染的人体器官）中，均可发现酵母以营养生长形态和丝状形态存在于生物膜中。为了理解酵母用于感染动物以及参与有害或有益生物膜形成的信号通路，我们必须建立易于操作且可靠的检测方法。本文中我们开发了一种检测方法，该方法借鉴了已有的酵母黏附与侵袭检测技术，可定性地评估不同条件下酵母菌株及其突变体的黏附和侵袭表型。本方法避免了将酵母细胞划线接种至琼脂表面的步骤，因为划线操作本身会改变酵母的侵袭性和黏附性。通过显微镜对侵袭细胞进行数字成像，可实现对侵袭和黏附程度的半定量评估。该方法对侵袭性和黏附性细胞的检测可与Sprague实验室开发的单细胞琼脂侵袭实验相辅相成，并可适用于时间序列实验。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Moticam 350	相机	Motic	已停产（新型号：Moticam 352）	一种价格相对低廉的相机，可连接显微镜目镜，用于为 PC 或 Mac 采集数字图像。