利用唾液和转座样本混合进行大规模 SARS-CoV-2 检测

Summary

该协议旨在为考虑大规模 SARS-CoV-2 检测或为未来病毒爆发制定准备计划的大学和其他组织提供蓝图。

Abstract

识别和隔离传染性个体以及隔离密切接触者，对于减缓 COVID-19 的传播至关重要。对 COVID-19 无症状携带者进行大规模监测或筛查检测，既提供了病毒传播的数据，也提供了在疑似疫情爆发期间快速检测个体的后续能力。自 2020 年秋季以来，密歇根州立大学的 COVID-19 早期检测计划一直在利用大规模测试来监测或筛查。此处采用的方法利用了唾液的可靠性、大样本量和自我采集的优势，并结合了经济高效、试剂节省的二维混合方案。该工艺旨在适应供应短缺，试剂盒和检测的许多成分很容易替代。概述的 SARS-CoV-2 样本采集和处理过程可以适用于检测未来唾液中可靠表达的病毒病原体。通过为大学或其他组织提供此蓝图，可以制定未来病毒爆发的准备计划。

Introduction

由 SARS-CoV-2 病毒引起的 COVID-19 大流行迄今已造成超过 620 万人死亡，而且人数每天都在增加¹。SARS-CoV-2 检测的金标准是实时定量 （RT-q） PCR，其引物旨在靶向病毒基因组，例如核衣壳、包膜、刺突和 RNA 依赖性 RNA 聚合酶基因²。在大流行开始时，严重缺乏足够的 SARS-CoV-2 检测能力。其原因在于缺乏经过验证的检测方法、检测组件、临床人员，以及基础设施未准备好迅速扩展以适应大流行级别的大规模检测。由于短缺，检测中心通常需要医生的推荐才能符合检测条件。这些短缺导致检测审批延迟，鼻咽样本采集排长队，以及等待结果的漫长时间。此外，由于这些限制，检测工作无法容纳在不知情的情况下传播 SARS-CoV-2 的症状前、轻度或无症状携带者。缺乏易于获取的广泛检测可能导致 COVID-19 不受控制的传播。

大规模间隔测试可以作为监测或筛查进行。两者都可用于监测高密度或高风险传播地区的当地阳性率，并可用于做出公共卫生决策。监测检测旨在监测人群中疾病的发病率和患病率，不用于个体诊断³。监测结果通常会去标识化，不会返回给参与者;进行监测检测的实验室不需要经过临床认证，也不需要使用 FDA 授权的检测方法。筛查允许将结果返回给个人参与者....

Protocol

为优化早期检测计划方法而进行的研究已获得密歇根州立大学机构审查委员会的批准。所有数字均采用人为样本复制，代表了观察到的人类结果。手稿中显示的数据、信息或结果均来自密歇根州立大学早期检测计划的任何参与者。

1. 试剂盒生产

注:在套件组装过程中，请始终佩戴口罩、手套、护目镜和实验室外套，以防止套件组件污染。

1. 试剂盒组分的制备
   1. 使用永久性记号笔在 25 mL 锥形管上画一条表示 1 mL 的线。使用永久性记号笔，在移液管上画一条表示 1 mL 的线。
   2. 向 5 mL 样品管中加入四个陶瓷珠。将 1 mL RNA 稳定溶液吸入样品管中并关闭试管。将包含唯一识别代码的杠铃贴纸贴在样品管上，顶部是数据矩阵条形码，侧面以字母数字代码重复的标识符。
      注:陶瓷珠不含 RNase/DNase，无需进一步消毒。
2. 将 25 mL 锥形管、5 mL 样品管、移液管和小生物危害袋放入试剂盒盒中（补充图 1）。
   注:锥形管不需要不含 DNase/RNase。RNA 稳定溶液可保持样品的完整性。

2. 试剂盒用于自....

Results

迄今为止，实验室收到的绝大多数样品已被接受并通过了最初的目视质量控制步骤。剔除样品的需求仅限于可能对样品处理和/或样品的整体结果产生负面影响的原因。具体来说，试管中的体积不正确、稠度或颜色不是唾液自然的、没有用于帮助样品均质化的陶瓷珠以及缺少条形码都是拒绝样品的原因（图 1）。

还检查了样品条件，以说明样品在收集箱中暴露于室外元素的情况。所选的 RNA 稳定溶液经过长时间暴露于热和冻融循环的测试。将不存在 RNase 的人为 SARS-CoV-2 RNA 样品暴露于不同的温度下，然后进行 RT-qPCR 处理。在 RNA 稳定溶液中，与在 RT、4 °C 或 -20 °C 下储存的样品相比，在 37 °C 下储存 1 周的样品显示出高 1-3 个单位的 Ct 值，具体取决于所检查的探针（补充图 2）。相比之下，在不含 DNase/RNase 的水中人为制备的 RNA 可能比在 RT、4 °C 或 -20 °C 下保存在水中的样品高 5 Ct，比在 RNA 稳定溶液中的样品高出近 8 Ct。.......

Discussion

在样品处理过程中，有一些步骤需要仔细注意。初始质量控制步骤着眼于样品体积、一致性、颜色和添加珠子的存在，对于该过程的整体成功至关重要。样本中含有正确唾液量的试管可能会产生假阴性，因为唾液太少会导致遗传物质不足;相反，过多的唾液与 RNA 缓冲液的比例不正确，可能会发生 RNA 降解。在极少数情况下，单个生物危害袋中会出现液体，表明样品管关闭不当，样品泄漏。这些样品经过截留处理，以消除处理试管可能导致的交叉污染。样品的非典型稠度和颜色也可以预测问题。大块的食物和非天然色样品表明，在采集样品之前可能已经食用了食物或饮料。由于口腔冲洗后唾液的信号低，或引入可能降解 RNA 或使 RNA 提取成为问题的材料，这可能会产生假阴性。粘性样品可能无法流过用于 RNA 提取的色谱柱，可能导致假阴性。血液、组织和粘液（例如痰液样本中的粘液）也可能导致 RNA 提取问题，从而阻止样品流过色谱柱。与粘性样品相关的另一个问题是样品转移期间。在转移到深孔板的过程中，粘性样品可能会部分附着在移液器吸头上并拖过板，留下蜗牛痕迹，从而导致板上的其他孔受到污染。为了防止这种情况，对整个唾液样品进行离心，.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 步 MM，无 ROX	Thermo Fisher	A28523
1.2 mL 深孔板	Fisher	AB0564
100 mL 试剂储液槽	Corning	4872
2.8 mm 陶瓷珠	OMNI	19-646
25 ml 锥形，带螺帽	VWR	76338-496
50 mL V 型底储液槽	Costar	4870
5430-高速离心机	Eppendorf	22620601
5ml Eppendorf 管	Fisher	14282300
用于 QuantStudio 生命技术的 8 联排管		4316567
β 巯基乙醇	Fisher	AC125472500
乙醇 200 Proof，分子生物学级	Fisher	BP28184
微安 Endura 光学 96 孔快速透明反应板，采用	Life 条形码技术	4483485
微安快速光学 96 孔板	Fisher	4346906
迷你微量离心机	康宁医疗	6770
用于联排管的光学盖	Life Technologies	AB-1820
光学薄膜	Thermo Fisher
PCR 板密封膜 非光学	Fisher	AB-0558
PCR 板 半裙边	Fisher	14230244
QuantStudio 3 实时荧光定量 PCR 系统，96 孔，0.1 mL	Thermo Fisher	A28136
快速 RNA 病毒试剂盒确认	Zymo	R1035
试剂储液槽，100 ml	DOT	229298
RNA Shield	Zymo	R1200-1L
小号生物危害袋	Fisher	180000
Taqpath RTPCR COVID19试剂盒	Thermo Fisher	A47814
Thermo Scientific Sorvall ST4R Plus 离心机	Thermo Fisher	75009525
移液管	Fisher	22170404
病毒 96 试剂盒	Zymo	R1041
涡旋混合器	Fisher	2215414