利用唾液和转座样本混合进行大规模 SARS-CoV-2 检测

Summary

该协议旨在为考虑大规模 SARS-CoV-2 检测或为未来病毒爆发制定准备计划的大学和其他组织提供蓝图。

Abstract

识别和隔离传染性个体以及隔离密切接触者，对于减缓 COVID-19 的传播至关重要。对 COVID-19 无症状携带者进行大规模监测或筛查检测，既提供了病毒传播的数据，也提供了在疑似疫情爆发期间快速检测个体的后续能力。自 2020 年秋季以来，密歇根州立大学的 COVID-19 早期检测计划一直在利用大规模测试来监测或筛查。此处采用的方法利用了唾液的可靠性、大样本量和自我采集的优势，并结合了经济高效、试剂节省的二维混合方案。该工艺旨在适应供应短缺，试剂盒和检测的许多成分很容易替代。概述的 SARS-CoV-2 样本采集和处理过程可以适用于检测未来唾液中可靠表达的病毒病原体。通过为大学或其他组织提供此蓝图，可以制定未来病毒爆发的准备计划。

Introduction

由 SARS-CoV-2 病毒引起的 COVID-19 大流行迄今已造成超过 620 万人死亡，而且人数每天都在增加¹。SARS-CoV-2 检测的金标准是实时定量 （RT-q） PCR，其引物旨在靶向病毒基因组，例如核衣壳、包膜、刺突和 RNA 依赖性 RNA 聚合酶基因²。在大流行开始时，严重缺乏足够的 SARS-CoV-2 检测能力。其原因在于缺乏经过验证的检测方法、检测组件、临床人员，以及基础设施未准备好迅速扩展以适应大流行级别的大规模检测。由于短缺，检测中心通常需要医生的推荐才能符合检测条件。这些短缺导致检测审批延迟，鼻咽样本采集排长队，以及等待结果的漫长时间。此外，由于这些限制，检测工作无法容纳在不知情的情况下传播 SARS-CoV-2 的症状前、轻度或无症状携带者。缺乏易于获取的广泛检测可能导致 COVID-19 不受控制的传播。

大规模间隔测试可以作为监测或筛查进行。两者都可用于监测高密度或高风险传播地区的当地阳性率，并可用于做出公共卫生决策。监测检测旨在监测人群中疾病的发病率和患病率，不用于个体诊断³。监测结果通常会去标识化，不会返回给参与者;进行监测检测的实验室不需要经过临床认证，也不需要使用 FDA 授权的检测方法。筛查允许将结果返回给个人参与者，但美国的筛查实验室必须拥有临床实验室改进修正案 （CLIA） 证书并满足所有适用的 CLIA 要求。

密歇根州立大学 （MSU） 的早期检测计划于 2020 年 9 月启动，已处理超过 350,000 个样本。该计划源于一个研究小组努力设计一种高度敏感的 SARS-CoV-2 检测方法，该检测方法不需要高需求的检测用品 ^4,5,6,7,8。目标是帮助临床实验室提高产能并开发灵活的流程以适应供应短缺，同时制定筛查策略，为 MSU 人类医学学院制定重返工作岗位计划。最初的工作重点是 SARS-CoV-2 的替代收集、提取和定量方法。鼻咽拭子的高需求和随后的短缺导致对用口腔拭子采集的前鼻孔样本进行评估，试剂短缺导致开发了一种根据中国武汉的早期报告改编的样本提取方法⁹。为了提高检测前鼻孔样本中 SARS-CoV-2 的灵敏度，液滴式数字 PCR 取代了 RT-qPCR ^6,7。尽管液滴式数字 PCR 具有高度敏感性，并且可以通过终点读数提供绝对值，但由于该技术缺乏可靠的高通量仪器，因此确定其用于大规模测试是不可行的。此外，基于人 RNase P 水平的前鼻孔样本的自我采集差异极大，表明其质量检测不够可靠。

鼻咽和前鼻孔拭子的替代品是收集唾液。SARS-CoV、H1N1 和 MERS 等呼吸道病毒历史上都在唾液中检测到^{10、11、12、13}。随后证明 SARS-CoV-2 14,15,16,17 也是如此。唾液和鼻咽样本之间的直接比较表明，在匹配的样本中，唾液产生的病毒滴度高于鼻咽拭子，并且唾液在重复样本采集中的变异性较小¹⁴。据报道，与 Delta¹⁶ 相比，唾液在某些变体（例如 Omicron）中更敏感。唾液采集的额外好处是在没有高需求用品的情况下相对容易地进行场外自我采集，能够在需要时反复重新检测样本，消除了样本采集的现场人员要求，并避免了参与者排队，这可能会增加病毒传播的可能性。实验室组装的唾液试剂盒是实验室检测开发人员、包装学院专家、大学品牌专家、安全官员以及生产盒子和标签系统的外部制造合作伙伴合作开发的。

虽然唾液样本提供了充足的遗传起始材料，RT-qPCR 提供了灵敏、可靠的结果，但试剂（引物/探针和预混液）的成本使得对单个样本进行大规模检测成为一项昂贵的工作。由于引物/探针和预混液是该工艺中最昂贵的组分，因此目标是寻求能够扩大其使用范围的解决方案，从而降低每个样品的成本。SARS-CoV-2 检测建议根据社区发病率和检测敏感性系统优化样本池大小¹⁸。但是，当任何规模的游泳池都表明存在 SARS-CoV-2 时，游泳池中的所有参与者都必须重新检测，这会导致时间损失和传播机会增加。为了解决这些限制，采用了二维池化方法，就像 Zilinskas 等人¹⁹ 提出的在监视测试的限制下进行第一轮通过的过程一样。在此过程中，将 96 个单独的样品置于由 12 列和 8 行组成的 96 孔板中。每个样品分别位于两个不同反应板的 8 个和 12 个混合池中。这导致每个样本都由两个池唯一表示。基于坐标的池反卷积可识别潜在的正样本。未检测到 SARS-CoV-2 的池中的样本不会从监测检测转为筛查。同时，通过 CLIA 批准的筛查程序重新提取在监测过程中检测呈阳性的个人的样本。如果确认为阳性，个人将获得结果，转介给大学医生办公室，开始接触者追踪，并通知卫生部门。总的来说，在宣布阳性之前，个人的样本会经过三个单独的反应测试，两次在监测池中，一次作为单次确认筛查，从而减少假阳性的机会。与单独运行样品相比，样品混合使用的试剂少 ~80%，因此每个样品的成本为 ~12 美元。

除了唾液试剂盒、混合策略和检测开发流程外，该团队还制定了试剂盒分发、样本采集和结果报告的物流计划。该计划的参与者领取他们的试剂盒，在他们的试管上注册唯一的字母数字代码，制作他们的样本并将其存放在众多投递箱之一中，每天在那里领取并运送到实验室。实验室处理样本，技术主管审查和上传结果，并通知参与者检查结果门户。该过程从样品沉积之日起的周转时间为 24-48 小时。该机构所有部门的合作是成功大规模实施这种混合监测和筛查过程的关键。以下程序和对所需检测计划和基础设施的描述旨在作为如何扩大检测规模以用于未来监测和/或筛查目的的蓝图。

Protocol

为优化早期检测计划方法而进行的研究已获得密歇根州立大学机构审查委员会的批准。所有数字均采用人为样本复制，代表了观察到的人类结果。手稿中显示的数据、信息或结果均来自密歇根州立大学早期检测计划的任何参与者。

1. 试剂盒生产

注:在套件组装过程中，请始终佩戴口罩、手套、护目镜和实验室外套，以防止套件组件污染。

1. 试剂盒组分的制备
   1. 使用永久性记号笔在 25 mL 锥形管上画一条表示 1 mL 的线。使用永久性记号笔，在移液管上画一条表示 1 mL 的线。
   2. 向 5 mL 样品管中加入四个陶瓷珠。将 1 mL RNA 稳定溶液吸入样品管中并关闭试管。将包含唯一识别代码的杠铃贴纸贴在样品管上，顶部是数据矩阵条形码，侧面以字母数字代码重复的标识符。
      注:陶瓷珠不含 RNase/DNase，无需进一步消毒。
2. 将 25 mL 锥形管、5 mL 样品管、移液管和小生物危害袋放入试剂盒盒中（补充图 1）。
   注:锥形管不需要不含 DNase/RNase。RNA 稳定溶液可保持样品的完整性。

2. 试剂盒用于自采样

1. 根据试剂盒说明，要求参与者在提供样品前 30 分钟不要进食或饮水。要求参与者吐入 25 mL 锥形管中，直到收集到 1 mL 唾液（标记线）。
2. 使用移液管将 1 mL 唾液（直至标记线）转移到含有 RNA 稳定溶液和陶瓷珠的 5 mL 样品管中。关闭并摇动样品管 15 秒。
3. 要求参与者在指定网站上注册分配给样品的字母数字代码。完成后，请他们将样品管放入小生物危害袋中并放入收集箱中。

3. RNA 分离的样品摄入和制备

注:所有步骤均在生物安全柜或带生物安全密封盖的离心机桶中进行。

1. 对仍在生物危害袋中的样品进行消毒和目视检查以进行质量控制。
2. 如果出现以下情况（图 1）:样品为非自然色（即绿色、蓝色）或含有食物残渣或血液，则不合格;样品渗漏或磁珠缺失;样品的预期体积不正确（<1.5 mL 或 >3 mL）;样品没有附加条形码或字母数字代码。
   1. 如果样品被剔除，则扫描样品并将其记录到剔除文件中，并说明样品被剔除的原因。如果样品因没有标识符而被拒绝，请在拒绝文件中将样品记录为 No Barcode。
3. 如果样品未被剔除，请用剪刀剪开生物危害袋并取出样品管。涡旋试管 15 秒，然后将样品管放入用于水平吊篮离心机的试管适配器中。
4. 试管接头装满后，将生物污染密封盖固定在离心机吊篮上并转移到离心机上。将样品以 4,100 x g 离心 2 分钟，然后将样品送回生物安全柜。
   注意:离心用于沉淀碎屑，并将唾液中较粘稠的物质压到管底。这消除了过程中对蛋白酶 K 的需求。一次完整的运行包括 768 个样品（8 个 96 孔板，其中装满了 RNA 分离后的样品）。
5. 在不干扰沉淀材料的情况下，将样品管转移到预先标有运行 ID 的 96 槽试管架中，其中包括试管架编号 （1-8）、日期和样品将用于合并/评估的相应组（表示该组的标识符，即 A 组是当天的第一次运行）。
6. 当 96 槽试管架已满或没有样品残留时，使用手持式条形码扫描仪将试管扫描到板图文件中（完整池为补充文件 1 ; 补充文件 2 用于半大小池）。如果条形码不起作用，请使用试管上的字母数字代码记录样品。
   注意: 需要遮罩以防止扫描相邻的条形码。可以通过在不透明纸上切一个孔，然后层压来制作面具。扫描到板图文件中的条形码将以与 96 插槽支架相同的方向显示。
7. 用 70% 乙醇喷洒架子中的样品管，然后用纸巾轻拍擦干。
   注意:擦拭试管而不是轻拍会损坏条形码。
8. 用运行 ID 标记 2 mL 孔容量的 96 深孔板。将 200 μL 唾液样品从每个样品管转移到 96 深孔板的相应孔中。如果样品太粘稠而无法转移，请涡旋并再次离心。如果问题仍然存在，则拒绝样品。
   注意:如果技术人员不小心，唾液样品可能会很粘稠，并在转移过程中在板上留下蜗牛痕迹。这可能导致初始假阳性和更多样品，最终需要在确认步骤中重新运行（参见第 6 节）。
9. 转移所有样品后，用硅胶垫盖住 96 深孔板，并在室温下储存。保存并储存 96 插槽的样品架和剩余样品，以确认潜在的阳性样品。
   注意:协议可以在此处暂停。

4. RNA 分离

1. 用运行 ID 标记 96 孔 RNA 分离柱，并将其放在空收集板的顶部。
   注:此时可以从生物安全柜中取出含有样品的板。
2. 从 96 深孔板上取下硅胶垫。将 400 μL 病毒上样缓冲液转移到 96 深孔板的每个孔中。
3. 轻轻上下吹打 2 至 4 次，混合每个样品，然后将整个样品转移到 96 孔 RNA 分离柱中的相应色谱柱中。
   注意:大量混合会产生气泡，如果随意作，可能会导致相邻孔的污染。以有意识的方式混合可以降低这种风险并保护下游加工的完整性。
4. 将收集板顶部的 RNA 分离柱以 4,100 x g 离心 10 分钟，以将样品加载到柱上。将 RNA 分离柱转移到干净的收集板上。
5. 向 RNA 分离柱的每个孔中加入 500 μL 洗涤缓冲液，并以 4,100 x g 离心 5 分钟。将 RNA 分离柱转移到干净的收集板中。
6. 向 RNA 分离柱的每个孔中加入 500 μL 洗涤缓冲液，并以 4,100 x g 离心 5 分钟。将 RNA 分离柱转移到干净的收集板中。
7. 向 RNA 分离柱的每个孔中加入 500 μL 100% 乙醇，并以 4,100 x g 离心 5 分钟。将 RNA 分离柱转移到干净的收集板中。
   注:如果此时样品尚未完全通过色谱柱，则样品太粘稠或样品中的小碎片堵塞了色谱柱。需要将样品从小柱中完全去除，以免污染下游混合过程，并将样品编号添加到剔除文件中。
8. 将收集板顶部的 RNA 分离柱以 4,100 x g 离心 5 分钟以干燥色谱柱。将 RNA 分离柱转移到标有 Run ID 和 row 字样的干净洗脱板上，然后将两者放在干净的收集板顶部。
9. 向 RNA 分离柱的每个孔中加入 25 μL 不含 DNase/RNase 的分子级水。以 4,100 x g 离心 10 分钟以洗脱 RNA。如果样品未完全洗脱，则重新离心样品 5 分钟。
10. 将洗脱板转移到预冷的冷板上并盖上盖子。立即进行样品混合和 RT-qPCR。

5. 样本混合和 RT-qPCR

注意:该过程在两板系统中设置（如图 2 所示）。洗脱 RNA 板号对应于生成的柱板号和行板字母（A = 1、B = 2、C = 3 等）。出于反卷积目的，柱板行字母将对应于 RNA 洗脱板的行字母，行板列号将对应于 RNA 洗脱板列号。例如，位于 C4 位置的 RNA 板 #6 中的样品将位于行反应板位置 F4 和色谱柱反应板位置 C6 中。

1. 用运行 ID 和单词 row 标记新的洗脱板，然后放在预冷的冷板上。将 10 μL RNA 从行洗脱板上的每个孔转移到柱洗脱板上的相应行，从而复制原始洗脱板（图 2）。
   注:标记为 column 的洗脱板将沿列方向合并，标记为 row 的洗脱板将沿行方向合并。
2. 对于柱混合板，将整个体积从板的每个孔转移到与 Run ID 板号对应的柱号中。对于行合并板，将整个体积从每个孔向上或向下转移到与运行 ID 板号相对应的行号中（1 = A、2 = B 等; 图 2）。
3. 将 13 μL 每个混合样品转移到 96 孔反应板的相应列或行中（图 2）。
4. 对于该方案，使用针对核衣壳 （N）、ORF1ab 和刺突 （S） 基因的三个探针来检测 SARS-CoV-2，并使用针对 MS2 噬菌体的第四个引物探针作为内部对照。在混合样品中，将 MS2 噬菌体阳性对照加标到预混液中。在单独运行的样品中，将 MS2 噬菌体加标到 RNA 分离柱上的样品中，并用作提取对照。
   注:预混液、引物探针、荧光染料和淬灭剂将根据测定结果而有所不同。每个实验室应确定适当的比例和荧光通道。
5. 向反应板上的阳性对照孔中加入 2 μL 阳性对照溶液和 11 μL 不含 DNase/RNase 的分子级水，制备阳性对照（图 2）。
6. 向反应板上的阴性对照孔中加入 13 μL 不含 DNase/RNase 的分子级水，制备无模板对照。
7. 根据制造商的说明制备预混液，并在 MS2 噬菌体阳性对照中加入加标。将 7 μL 预混液分配到包含样品或对照的 96 孔反应板的每个孔中。限制暴露在荧光灯下。
8. 用光学膜覆盖反应板并涡旋 2 分钟以充分混合样品。将反应板以 650 x g 离心 5 分钟。
9. 将板转移至 RT-PCR 系统中，并使用适合预混液的循环参数运行。对于此处使用的预混液，运行以下循环:25 °C 2 分钟，53 °C 10 分钟，95 °C 2 分钟，95 °C 40 个循环 3 秒，60 °C 30 秒。
10. 运行样本后，对池进行反卷积，以手动（图 3）和 R Script Shiny 应用程序识别潜在的阳性样本。
    1. 将列和行反应板的结果导出为电子表格文件。打开池反卷积 R 脚本 Shiny 应用程序（源代码可从 https://github.com/kochman1/JoVE-MSU-COVID-EDP 获取）。
    2. 将板图、列和行文件拖放到应用程序中，然后运行应用程序。保存从应用程序生成的列表。
       注意:应用程序生成的列表包含输入到板图中的所有条形码，以及根据矿池反卷积脚本，它们可能是正的还是负的。这些标记为潜在阳性的样品将单独重新处理。

6. 阳性样本的验证

1. 为每个需要检测的样品标记两个 1.5 mL 微量离心管和一个 RNA 提取柱。使用一根微量离心管混合样品、MS2 噬菌体和病毒上样缓冲液，使用第二根微量离心管进行 RNA 洗脱步骤。
2. 向 1.5 mL 微量离心管中加入 5 μL MS2 噬菌体 RNA。将 200 μL 潜在阳性样品转移到试管中，并向试管中加入 400 μL 病毒上样缓冲液，通过移液混合。
3. 将全部内容物转移到干净的收集管中的预标记 RNA 提取柱中。以 10,000 x g 离心 2 分钟。从收集管中吸出液流。
4. 向 RNA 提取柱中加入 500 μL 洗涤缓冲液，并以 10,000 x g 离心 2 分钟。从收集管中吸出液流。
5. 向 RNA 提取柱中加入 500 μL 洗涤缓冲液，并以 10,000 x g 离心 2 分钟。从收集管中吸出液流。
6. 向 RNA 提取柱中加入 500 μL 100% 乙醇，并以 10,000 x g 离心 1 分钟。将 RNA 提取柱转移到干净的收集管中，并以 10,000 x g 离心 1 分钟以干燥柱。
7. 将 RNA 提取柱转移到预先标记的 1.5 mL 微量离心管中进行洗脱。向 RNA 提取柱中加入 25 μL 不含 DNase/RNase 的分子级水。以 10,000 x g 离心 2 分钟以收集 RNA 并将试管转移至湿冰中。
8. 根据制造商的说明制作预混液。将 7 μL 预混液分配到包含样品的 96 孔反应板的每个孔中。将 13 μL 每种分离的 RNA 转移到反应板中。
   注:预混液与混合样品方案中使用的预混液相同，但不包括 MS2 噬菌体 RNA 加标。
9. 向反应板上的阳性对照孔中加入 2 μL 阳性对照溶液和 11 μL 不含 DNase/RNase 的分子级水，制备阳性对照。向反应板上的阴性对照孔中加入 13 μL 不含 DNase/RNase 的分子级水，制备无模板对照。
10. 用光学膜覆盖反应板并涡旋 2 分钟以充分混合样品。将反应板以 650 x g 离心 5 分钟。将板转移至 RT-PCR 系统中，并使用适合预混液的循环参数运行。
    1. 对于此处所述的预混液，使用 25 °C 2 分钟，53 °C 10 分钟，95 °C 2 分钟，95 °C 40 次循环 3 秒，60 °C 30 秒。

Results

迄今为止，实验室收到的绝大多数样品已被接受并通过了最初的目视质量控制步骤。剔除样品的需求仅限于可能对样品处理和/或样品的整体结果产生负面影响的原因。具体来说，试管中的体积不正确、稠度或颜色不是唾液自然的、没有用于帮助样品均质化的陶瓷珠以及缺少条形码都是拒绝样品的原因（图 1）。

还检查了样品条件，以说明样品在收集箱中暴露于室外元素的情况。所选的 RNA 稳定溶液经过长时间暴露于热和冻融循环的测试。将不存在 RNase 的人为 SARS-CoV-2 RNA 样品暴露于不同的温度下，然后进行 RT-qPCR 处理。在 RNA 稳定溶液中，与在 RT、4 °C 或 -20 °C 下储存的样品相比，在 37 °C 下储存 1 周的样品显示出高 1-3 个单位的 Ct 值，具体取决于所检查的探针（补充图 2）。相比之下，在不含 DNase/RNase 的水中人为制备的 RNA 可能比在 RT、4 °C 或 -20 °C 下保存在水中的样品高 5 Ct，比在 RNA 稳定溶液中的样品高出近 8 Ct。...

Discussion

在样品处理过程中，有一些步骤需要仔细注意。初始质量控制步骤着眼于样品体积、一致性、颜色和添加珠子的存在，对于该过程的整体成功至关重要。样本中含有正确唾液量的试管可能会产生假阴性，因为唾液太少会导致遗传物质不足;相反，过多的唾液与 RNA 缓冲液的比例不正确，可能会发生 RNA 降解。在极少数情况下，单个生物危害袋中会出现液体，表明样品管关闭不当，样品泄漏。这些样品经过截留处理，以消除处理试管可能导致的交叉污染。样品的非典型稠度和颜色也可以预测问题。大块的食物和非天然色样品表明，在采集样品之前可能已经食用了食物或饮料。由于口腔冲洗后唾液的信号低，或引入可能降解 RNA 或使 RNA 提取成为问题的材料，这可能会产生假阴性。粘性样品可能无法流过用于 RNA 提取的色谱柱，可能导致假阴性。血液、组织和粘液（例如痰液样本中的粘液）也可能导致 RNA 提取问题，从而阻止样品流过色谱柱。与粘性样品相关的另一个问题是样品转移期间。在转移到深孔板的过程中，粘性样品可能会部分附着在移液器吸头上并拖过板，留下蜗牛痕迹，从而导致板上的其他孔受到污染。为了防止这种情况，对整个唾液样品进行离心，...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 步 MM，无 ROX	Thermo Fisher	A28523
1.2 mL 深孔板	Fisher	AB0564
100 mL 试剂储液槽	Corning	4872
2.8 mm 陶瓷珠	OMNI	19-646
25 ml 锥形，带螺帽	VWR	76338-496
50 mL V 型底储液槽	Costar	4870
5430-高速离心机	Eppendorf	22620601
5ml Eppendorf 管	Fisher	14282300
用于 QuantStudio 生命技术的 8 联排管		4316567
β 巯基乙醇	Fisher	AC125472500
乙醇 200 Proof，分子生物学级	Fisher	BP28184
微安 Endura 光学 96 孔快速透明反应板，采用	Life 条形码技术	4483485
微安快速光学 96 孔板	Fisher	4346906
迷你微量离心机	康宁医疗	6770
用于联排管的光学盖	Life Technologies	AB-1820
光学薄膜	Thermo Fisher
PCR 板密封膜 非光学	Fisher	AB-0558
PCR 板 半裙边	Fisher	14230244
QuantStudio 3 实时荧光定量 PCR 系统，96 孔，0.1 mL	Thermo Fisher	A28136
快速 RNA 病毒试剂盒确认	Zymo	R1035
试剂储液槽，100 ml	DOT	229298
RNA Shield	Zymo	R1200-1L
小号生物危害袋	Fisher	180000
Taqpath RTPCR COVID19试剂盒	Thermo Fisher	A47814
Thermo Scientific Sorvall ST4R Plus 离心机	Thermo Fisher	75009525
移液管	Fisher	22170404
病毒 96 试剂盒	Zymo	R1041
涡旋混合器	Fisher	2215414