本方案描述了一种大型动物（猪）循环死亡后捐献模型，随后进行胸腹常温区域灌注，该模型高度模拟了心脏移植中的临床情景，有望促进相关治疗研究和策略的开展。
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方法文章
大动物循环死亡后捐献与常温区域灌注用于心脏评估模型
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
多年来，心脏移植需求的增加促使人们关注循环死亡后捐献（DCD），以扩大器官供体来源。然而，DCD过程因不可避免地存在一段热缺血时间，可能导致心肌组织损伤。常温区域灌注（NRP）可实现 原位 器官评估，从而获取被判定为具有活力的心脏。本文描述了一种具有临床相关性的脑死亡后循环死亡（DCD）大型动物模型，并随后实施常温区域灌注（NRP）。在麻醉猪模型中，通过停止机械通气以建立循环死亡。经过预设的热缺血时间后，使用体外膜氧合（ECMO）进行至少30分钟的NRP。在此再灌注期间，该模型允许采集多种心肌活检样本和血液样本，用于初步的心脏功能评估。在逐步撤离NRP后，可在器官获取前进行生化、血流动力学及超声心动图检查，以评估心脏功能与代谢状态。该方案高度模拟了先前报道的DCD联合NRP用于心脏移植的临床场景，有望推动旨在减轻缺血-再灌注损伤、增强心脏功能保护与恢复的研究。
引言
每年有超过 30 万人死于心力衰竭（HF）；对于部分终末期疾病的患者，心脏移植仍是唯一的治疗选择1历史上，心脏移植的唯一来源是经神经学标准判定死亡（NDD）后获取的供体心脏，但即便如此，仅有约40%的供体心脏适合用于移植2约有15%至20%的患者在等待心脏捐献期间死亡，供体心脏短缺是导致可获得的心脏数量与需求之间存在差距的原因之一2为了扩大器官捐献者群体，一个重要的考虑因素是使用循环死亡后捐献的心脏（DCD）3人们对使用DCD心脏存在顾虑，因为这些器官在血液循环停止后 inevitably 会经历一段无保护的（温）缺血期，可能导致不可逆的损伤。尽管已有成功实施DCD心脏移植并取得良好早期效果的报道4,5因此，有必要开发一种经过验证的评估方法，以确定这些心脏是否可用，并可能预测其移植后的功能表现6,7为缩短心脏停搏供体（DCD）心脏的缺血时间，并在保存与运输过程中对其进行持续监测， 离体 心脏灌注系统已得到开发8然而，该技术依赖于带有灌注设备的复杂机器，且前期成本高昂，无法保证所获取的器官一定适合移植。Messer 等人提出了一种基于常温区域灌注（NRP）的新型 DCD 心脏移植方案。3该技术涉及在心脏仍位于供体体内时恢复心肌灌注，同时阻断脑部血液循环，从而实现对心脏功能的评估。 原位 在采购前3.
在使用大型动物模型时，由于猪心在解剖结构上与人类心脏高度相似，因此是开展心脏外科研究的首选平台之一。然而，使用该模型时需考虑猪心的一些重要特性。例如，猪的心脏组织非常脆弱且易碎，容易发生撕裂，尤其是在肺动脉和右心房部位9。另一个需要重视的因素是，猪心对缺血极为敏感，易发生心律失常，因此建议在实验前常规为每只动物给予抗心律失常药物；尽管如此，猪心仍被视为研究心脏移植中急性缺血的合适模型9。
本手稿描述了一种大型动物（猪）的循环死亡后捐献模型，随后进行胸腹常温区域灌注，该模型 closely 模拟了心脏移植中的临床情景，并有望促进转化研究中的新型治疗研究和策略。
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方案
蒙特利尔大学医院研究中心（CRCHUM）的机构动物护理与使用委员会批准了所有实验方案，动物饲养和使用均遵循《实验动物护理与使用指南》。本方案使用3至4月龄、体重50-60 kg的大型白猪，性别不限。动物的体型可根据研究人员的实验目标进行调整。
1. 动物准备与麻醉诱导
- 使用阿托品（0.04 mg/kg）、咪达唑仑（0.3 mg/kg）和氯胺酮（20 mg/kg）进行肌内注射以对动物进行术前给药。以3 L/min的氧气流速输送1%–3%呼气末浓度的异氟烷2使用面罩进行麻醉诱导和维持。
- 通过测试下颌松弛度以及捏足趾无疼痛反应来确认麻醉充分。确保动物处于仰卧位，并使用加热垫维持正常体温。
- 在确认麻醉效果充分后，按照所述方法使用6.5–8 mm气管导管进行经口插管。 10.
- 将血氧饱和度监测仪置于动物的耳部或下唇，以进行持续监测。调整通气参数，使呼气末正压（PEEP）达到 5 cm H₂O。2O，吸气峰压（PIP）为15 cm H₂O2吸入氧分数（FIO20.5，呼吸频率（RR）为15次/分钟，潮气量（TV）达到6-8 mL/kg，以及正常的氧分压（O₂）2 和 CO2. 调整呼吸频率（RR）以维持呼气末二氧化碳分压（end-tidal CO₂）2 35-45 mmHg 水平。
- 建立外周静脉通路 通过 使用20 G导管经耳静脉给药。开始输注生理盐水溶液（0.9% NaCl）维持，并给予2 g硫酸镁（MgSO₄）4) 作为静脉推注给药，以预防心律失常。
- 充分剃除胸部和腹股沟区域的毛发并进行擦洗以准备手术部位。使用氯己定对腹股沟和颈部进行消毒，并适当铺巾，同时建立静脉和动脉通路。
- 将电凝电极板置于动物背部。将动物置于头低脚高位，以利于中心静脉通路的建立。
- 使用超声定位右侧颈静脉。定位后，用针头以一定角度进入皮肤 45° 角度调整至超声下可见针头进入静脉并见到血液。
- 将导丝置入穿刺针内，然后沿导丝置入7 Fr经皮中心静脉鞘管导入器。
- 在保留鞘管导引器的同时撤出导丝，然后插入Swans-Ganz导管，以确保心输出量测量和右心导管检查。
注意：可使用左侧颈静脉替代右侧颈静脉。若无法建立通路，可在胸骨正中切开术后直接将鞘管插入颈内静脉（左侧或右侧）。此种情况下，务必分离静脉。 - 采用相同技术，将中心静脉导管（如双腔导管）插入左侧颈静脉。
- 使用Seldinger技术，按照步骤1.7至1.10所述，将另一根7 Fr经皮中心静脉鞘管插入器置入右侧股静脉，用于将容积导管经此通路导入右心室（RV）。该操作可通过超声引导下经皮完成，或在正中胸骨切开术后进行。
- 插管和操作后给予10分钟的稳定期，随后测量基线血流动力学和心脏功能参数，包括肺动脉和体循环压力、心输出量、右心室和左心室压力-容积环以及经胸超声心动图。
2. 建立手术通路
- 使用电灼笔从颈部中段至剑突处做正中切口。随后，使用电刀沿正中线逐层分离皮下脂肪组织，直至暴露胸骨后区域。
- 在胸骨切迹周围进行切割，并用手指向下方剥离并清除胸骨后方的软组织。使用骨锯切开胸骨，确保胸骨完全分离，同时注意保护位于胸骨上段下方的静脉。对胸骨断面进行电灼和/或涂抹骨蜡，以确保充分止血。
- 使用电刀将胸腺从心包上分离并切除。电凝来自主动脉和上腔静脉（SVC）的胸腺供血血管，以防止出血。
- 使用电灼笔小心切开心包。在切开心包时，将手指伸入心包下方，以避免损伤心脏。
- 静脉给予肝素 300 单位/kg，以实现全身抗凝。若条件允许，应检测活化凝血时间（ACT），确保其大于 300 秒。
3. 撤除生命支持治疗与死亡宣告
- 静脉注射3 mg/kg剂量的丙泊酚，随后停止机械通气并断开气管插管。
注意：此步骤对应“生命支持撤除”，以启动常温区域灌注。如需实施安乐死条件，请参见第8节。 - 监测动脉压和外周O2饱和度。当收缩压 < 50 mmHg时，开始计算功能性的热缺血时间。
- 当出现心搏停止（或心室颤动）且无动脉搏动时，确立循环停止。在确立循环停止后，至少进行5分钟的观察期（即等待期），随后宣告动物死亡。
4. 胸腹部常温区域灌注的实施
- 使用电凝仔细解剖主动脉-肺动脉间隙。将右心室流出道向下牵拉，肺动脉向左牵拉，主动脉向右牵拉，以避免对后者造成直接损伤。如需协助，可在该步骤中请助手帮忙。
- 解剖并结扎头臂干血管，以阻断和排除脑部灌注。或者，在这些血管上放置一个大型横夹。
- 在双侧颈动脉阻塞远端插入两根18 G导管，以评估脑部潜在血流。在整个实验过程中收集并测量血液，随后重新输注 通过 NRP 电路
- 使用梅岑鲍姆剪和直角止血钳，在上腔静脉与无名动脉之间以及下腔静脉与心包之间进行精细分离。用脐带绳或0号丝线分别绕过上腔静脉和下腔静脉，并以止血带固定。
- 使用3-0缝线，在升主动脉远端外膜上缝制两圈同心荷包缝线；避免穿透血管全层。在右心房（RA）缝制一圈荷包缝线。所有缝线均用束带固定。
- 根据研究者和实验需求安装并预充NRP系统。本方案中，使用带有离心泵的体外膜肺氧合（ECMO）管路，以2 L晶体溶液进行预充，其中包含500 mg甲泼尼龙（Solumedrol）、200 mL 8.4%碳酸氢钠（NaOH）、300单位/kg肝素和2 g硫酸镁（MgSO₄）4.
注意：此处使用的装置与该机构心脏外科部门灌注师所使用的装置类似。 - 使用17至21 F的动脉插管插入主动脉，然后收紧固定荷包缝线的止血带，以确保插管位置固定。
注意：也可采用塞尔丁格技术插入体外膜肺氧合（ECMO）导管，以减少失血。另一种方法是使用标准的旁路动脉导管。随后，将主动脉导管通过3/8-3/8连接器与NRP回路的动脉管路相连；确保充分排气，以避免空气栓塞。 - 在右心房荷包缝合的中心处做一个5 mm的切口，然后使用小角度器械（如直角钳或Snap钳）进行扩张。用手指覆盖切口以防止过度出血。
- 使用双级静脉插管插入右心房，然后使用止血带收紧荷包缝线，以固定插管位置。
- 使用1/2-3/8连接器将套管连接至NRP回路的静脉管路，并确保完全排气，以避免系统内形成气锁。
- 确保在宣布死亡后至少经过15分钟再开始NRP，以涵盖临床实践中准备、铺巾及接触心脏所需的时间。
- 在功能热缺血时间开始后15分钟启动NRP。整个过程中维持常温。逐步调整流速，以达到2.5 L/min/m的灌注指数2重新启动机械通气，设定吸入氧分数（FIO₂）2 50% 和 6 mL/kg 的潮气量。
注意：根据实验设计调整这些设置。 - 持续灌注 10 µg/kg/min 多巴胺和 4 units/min 血管加压素静脉输注。在初始灌注期间使用肾上腺素和去甲肾上腺素，随后根据需要调整剂量，以协助血压调控，同时维持动脉压高于 50 mmHg。
5. 再灌注的维持及脱离支持的目标
- 在尝试脱离NRP前，先对心脏进行30分钟的再灌注。如果脱离失败，额外进行15分钟再灌注以支持NRP，然后再尝试脱离，总的最大再灌注时间不超过180分钟。
- 成功脱离后，进行心脏功能评估。若在此时间内未能实现脱离，则终止实验并报告问题。
注：应根据各研究者的具体目标对此步骤进行调整。 - 评估NRP脱离标准，并确保所有标准均符合表1中所述的详细要求。
6. 心脏功能恢复评估
- 生成压力-容积（PV）环分析以测量心脏收缩功能。导电性导管可实现对左心室-容积（LV-PV）关系的连续测量。
- 获取稳态记录，以生成与容积相关的参数，如每搏功和发育压；并通过脐带结扎阻断下腔静脉（IVC），经由阻断操作生成与容积无关的参数，即前负荷可募集的每搏功。
- 利用实验开始时插入的Swans-Ganz导管测量中心静脉压、肺动脉压、心输出量、右心室压和肺毛细血管楔压。
- 使用标准经食管探头和直接放置在心脏表面的经胸探头，通过超声心动图分析心脏功能。
- 通过采集动脉和静脉血样进行代谢评估。直接从冠状窦取血以特异性评估心脏代谢功能。分析血气和乳酸水平。
- 如有需要，还可采集右心室和左心室的心肌活检样本。根据研究者的目标，获取其他可移植器官（如肺、肝、肾）的相关组织样本。
7. NRP 去除及心脏功能评估
- 当达到脱离灌注标准时，停止NRP。将导管从右心房（RA）中取出，并迅速收紧荷包缝线以尽量减少出血。用打结固定缝线，并采用相同操作步骤移除主动脉导管。
- 在停止NRP后，每30分钟评估一次心脏功能，持续2小时，具体方法如步骤6.1至6.4所述。
8. 实验终止
- 2小时后，将16 G或18 G的停跳液导管插入升主动脉，并将导管连接至NRP循环系统。
- 随后，使用电凝切开下腔静脉以减压右心腔，并切开左心房以减压左心腔。
- 插入导管后，夹闭升主动脉，并向心脏灌注1.5 L、4 °C的Del Nido停跳液，确保灌注压力为50 mmHg。
- 开始停跳后，停止机械通气，并在胸腔内放置冰屑（0.9% NaCl）以进行降温。停跳液输注完成后，按传统方法进行心脏切除术。
- 利用获取的心脏组织进行广泛的心肌活检，以用于评估和分析；根据实验设计和研究目的，还可对其他器官（如肺、肝、肾）进行额外的活检。
注意：图1 总结了本方案的步骤，Table 1 列出了本研究中使用的参数和标准的定义。
图1：实验方案的示意图总结。 缩写：NRP = 常温区域灌注。 请点击此处查看该图的放大版本。
| 定义/标准 | |
| 功能性热缺血期 | 从收缩压 < 50 mmHg 开始，至启动 NRP 时结束。在本方案中，该时期持续 15 分钟 |
| 循环停止 | 当心脏处于停搏或心室颤动时即确立 |
| 间隔期 | 从循环停止开始，至宣布死亡结束。在本方案中，该时期持续 5 分钟 |
| 成功脱离 NRP | 最小程度使用正性肌力药物和血管加压药 |
| CI > 2.2 L/min/m2 | |
| MAP > 55 mmHg | |
| RAP < 15 mmHg | |
| PCWP < 15 mmHg | |
| 左心室和右心室功能正常 |
表1：本方案中使用的参数和标准的代表性定义。 缩写：CI = 心脏指数；MAP = 平均动脉压；NRP = 常温区域灌注；PCWP = 肺毛细血管楔压；RAP = 右心房压。
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结果
该临床前模型已在我们机构的多项实验中成功应用。首先，我们证实了在移植后功能恢复方面，采用常温区域灌注（NRP）进行初始再灌注的DCD心脏与采用冷保存的常规搏动心脏捐献相比，具有相似的效果。此外，我们利用该方案证明了NRP后的心脏功能评估可预测移植后的恢复情况。最后，我们还研究了循环停止后NRP对脑灌注及肺脏保存的影响。
图2展示了使用肺动脉导管在基线水平以及心脏死亡后捐献（DCD）和常温机械灌注（NRP）后测得的心脏功能的代表性结果。由此可见，DCD后心脏功能显著下降；然而，与传统移植心脏（即心脏跳动状态下捐献后进行冷保存）相比，这些器官在移植后表现出相似的功能恢复情况。图3显示了在主动脉弓上血管夹闭期间进行NRP时脑部氧合的测量结果；测量数据证实脑组织灌注不足。图4则展示了NRP期间及脱离支持后的肺顺应性测量结果，显示在NRP期间肺顺应性与基线水平相比无显著变化。
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讨论
本论文描述了一种大动物模型的循环死亡后器官捐献（DCD），随后进行胸腹常温区域灌注。在本实验中，心脏在体外膜肺氧合（ECMO）回路支持下再灌注，时间至少30分钟，最长可达3小时，之后脱离ECMO系统。脱离支持后，心脏自主工作2小时，从而实现对心脏功能的短期有效评估。因此，本方案的主要局限性在于随访时间较短；然而，长期评估将耗费大量资源且成本高昂。该操作聚焦于急性缺血-再灌注损伤，可作为评估供体心脏在供体体内功能状态的可靠方法，并用于判断器官是否适合移植。此外，该模型也可作为合适的临床前模型，用于研究可能改善心脏功能恢复的新型药物性和非药物性干预措施，而这些干预此前仅在小动物模型中得到验证11,12,13,14,15,16。根据研究者的目标或遇到问...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们衷心感谢 Melanie Borie、Caroline Landry、Henry Aceros 和 Ahmed Menaouar 提供的宝贵帮助与支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 胺碘酮 | 根据机构现有情况提供 | ||
| 20G 安全型留置针 | BD | 381704 | |
| 阿托品 0.4 mg/mL | 根据机构现有情况提供 | ||
| Biomedicus 离心泵 | Medtronic | ||
| 心脏停搏液（Del Nido 配方） | 机构自制 | 研究者可根据需要选用其他配方 | |
| 电凝笔 | Covidien | E2515H | |
| 双腔中心静脉导管 | Cook Medical | C-UDLM-501J-LSC | |
| 7 Fr 中心静脉鞘导入器 | |||
| 导纳导管 | |||
| 体外循环包（CPB pack） | Medtronic | ||
| DLP 主动脉根部插管 | Medtronic | 12218 | |
| DLP 双腔静脉插管（29 或 37 F） | Medtronic | ||
| 多巴酚丁胺 | 根据机构现有情况提供 | ||
| 多巴胺 | 根据机构现有情况提供 | ||
| Polyhesive 电极 | Covidien | E7507 | |
| EOPA 动脉插管（17 或 21 F） | |||
| 肾上腺素 | 根据机构现有情况提供 | ||
| 氧气面罩 | 根据机构现有情况提供 | ||
| 中号腈类手套 | Fischer | 27-058-52 | |
| 肝素 1000 IU/mL | 根据机构现有情况提供 | ||
| 吸入用异氟烷 | 由机构动物设施提供 | ||
| 16 或 18 G Jelco 导管 | |||
| 氯胺酮注射液 50 mL 瓶装（100 mg/mL） | 加拿大卫生部 | 需获得加拿大卫生部批准 | |
| 利多卡因/赛罗卡因 1% | 根据机构现有情况提供 | ||
| 硫酸镁 5 g/10 mL | 根据机构现有情况提供 | ||
| 咪达唑仑注射液 10 mL 瓶装（5 mg/mL） | 加拿大卫生部 | 需获得加拿大卫生部批准 | |
| MPS Quest 给药一次性套装 | Quest Medical | 5001102-AS | |
| 去甲肾上腺素 | 根据机构现有情况提供 | ||
| 生理盐水（0.9% NaCl）1L 袋装 | Baxter | JB1324 | |
| 1 mL 移液器吸头 | Fisherbrand | 02-707-405 | |
| 丙泊酚 1 mg/mL | 根据机构现有情况提供 | ||
| 罗库溴铵 | 根据机构现有情况提供 | ||
| 带止回阀的 NF PB 静脉输液装置 | Smith Medical | 21-0442-25 | |
| 碳酸氢钠（NaOH）8.4% | 根据机构现有情况提供 | ||
| Sofsil 0 蜡涂层缝线 | Covidien | S316 | |
| 甲泼尼龙 500 mg/5 mL | 根据机构现有情况提供 | ||
| 吸引头 | Covidien | 8888501023 | |
| 吸引管 1/4'' × 120'' | Med-Rx | 70-8120 | |
| 3.0 Prolene 蓝色缝线 M SH | Ethicon | 8523H | |
| 5.0 Prolene BB 缝线 | Ethicon | 8580H | |
| Prolene Blum 4-0 SH 36 缝线 | Ethicon | 8521H | |
| BB 4.0 Prolene 缝线 | Ethicon | 8881H | |
| 气管插管，6.5 mm | Mallinckrodt | 86449 | |
| 血管加压素 | 根据机构现有情况提供 |
参考文献
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