用于评估与 COVID-19 相关中耳病变的高速人颞骨切片技术

摘要

本文介绍了一种利用带有双金刚石刀片的微型锯对人颞骨进行快速切片的技术，可制备出薄切片，用于快速脱钙及颞骨免疫组织化学分析。

摘要

人颞骨切片的组织病理学分析是研究中耳和内耳病理学的基本技术。颞骨切片的制备包括死后获取颞骨、固定、脱钙、包埋和染色等步骤。由于颞骨密度较高，脱钙过程耗时且资源消耗大；完整的组织制备平均可能需要9至10个月。这会延缓耳病理学研究，并阻碍对时间敏感的研究，例如与新型冠状病毒肺炎（COVID-19）大流行相关的研究。本文介绍一种快速制备和脱钙颞骨切片的技术，以加快组织处理进程。

采用标准技术在死后获取颞骨，并用10%福尔马林固定。使用带有双金刚石刀片的精密微型锯将每个样本切成三个较厚的切片。将较厚的颞骨切片在脱钙液中脱钙7-10天，随后包埋于石蜡中，用冷冻切片机切成薄片（10 µm），并贴附于未带电荷的载玻片上。组织样本随后进行脱蜡和再水化处理，用于抗体染色（ACE2、TMPRSS2、Furin）并成像。该技术将从取材到组织分析的时间由9-10个月缩短至10-14天。高速颞骨切片技术可加快耳病理学研究速度，减少组织制备所需的资源，同时有助于开展时间敏感性研究，例如与COVID-19相关的研究。

引言

人类颞骨研究为探索中耳和内耳的病理学及病理生理学提供了宝贵的资源。在19世纪之前，人们对耳科疾病知之甚少。^1,2,3更好地理解耳科疾病以及 "将耳科手术从庸医手中拯救出来" 约瑟夫·图恩比（Joseph Toynbee，1815–1866）开发了研究人颞骨组织学切片的方法³这项工作在19世纪后期由维也纳的亚当·波利策（Adam Politzer，1835–1920）及欧洲其他地区的学者进一步推进，他们利用颞骨切片描述了多种常见耳部疾病的组织病理学特征^2,3,4.

美国首个用于人类颞骨研究的实验室于1927年在约翰斯·霍普金斯医院成立，斯泰西·吉尔德（Stacy Guild，1890–1966）在此建立了颞骨切片技术^5,6。吉尔德所建立的方法包括死后取材、固定、硝酸脱钙、乙醇脱水、火棉胶包埋、切片、染色和封片，整个过程持续9至10个月。此后，哈罗德·舒克内希特（Harold Schuknecht，1917–1996）对该技术进行了改进⁷；然而，该流程的基本步骤至今仍基本保持不变。

维持颞骨实验室所需的大量资源给颞骨研究带来了挑战，这可能是过去30年来该领域研究热度下降的重要原因^4,8。颞骨实验室的大量资源必须投入到长达9至10个月的颞骨制备过程中。其中最耗时的步骤之一是脱钙，因为颞骨是人体中最致密的骨骼。脱钙通常使用硝酸或乙二胺四乙酸（EDTA）进行，耗时数周至数月，并需频繁更换溶液^7,9。此外，对于时效性较强的人耳研究（例如与COVID-19大流行相关的研究），这一缓慢的制备过程可能构成阻碍。本文介绍了一种高速颞骨切片技术，该技术使用金刚石微锯切割出较厚的切片，可在颞骨获取后的10至14天内实现快速脱钙和组织学分析。

方案

本方案已获得机构审查委员会（IRB00250002）批准，并遵循机构关于使用人体组织和传染性材料的政策。每位颞骨捐献者均在生前签署书面同意书，或由其家属在捐献者去世后获得同意。有关本方案中使用的所有材料、设备和软件的详细信息，请参见材料表。

1. 颞骨采集

1. 在使用本方案前，需获得当地机构审查委员会（IRB）的批准，查阅机构关于使用人体组织和传染性材料的政策，并取得组织捐献的知情同意。
2. 在处理来自 COVID-19 阳性颞骨捐献者的组织前，应穿戴适当的个人防护装备（PPE）。确保 PPE 包括 N-95 呼吸器和面罩（或 alternatively 使用正压空气净化系统）、防护服以及两副手套。在开始本方案前，应复习正确穿戴和脱卸 PPE 的技术¹⁰。
3. 在捐献者死亡后 12–24 小时内获取颞骨组织。若尸体未冷藏，应确保在死亡后 8 小时内完成取材。
   1. 在尸检过程中，使用骨凿采用四切口整块法获取颞骨⁷。
      1. 开颅后，移除脑组织，并锐性切断至内听道的脑神经。
      2. 使用骨凿在鳞部颞骨的平行位置且略偏内侧处进行第一处骨切口。
      3. 在颞骨内侧边缘处，与第一切口平行进行第二处骨切口。
      4. 然后，在岩嵴前方 3–4 cm 处，与岩嵴平行进行第三处切口。
      5. 第四处切口大致与第三切口平行，位于岩嵴后方约 2 cm 处。
         注意：确保所有切口均穿透颅底。
      6. 随后，通过锐性解剖分离标本下缘的软组织附着，取出颞骨。若在获取颞骨后需进行尸体灌注固定，应结扎颈动脉残端。

2. 组织固定、脱钙与切片

1. 立即将组织置于 200–300 mL 的 10% 缓冲福尔马林（甲醛）溶液中，确保组织完全浸没。在室温下固定组织至少 72 小时，每天更换一次溶液。将组织储存在密闭容器中，并在通风橱内佩戴适当的个人防护装备（PPE）进行溶液更换，以防止病毒扩散。
   注意：经过 72 小时固定后，标本不再具有传染性。
2. 使用带有双金刚石刀片的精密微切锯，将每个标本切成三个"厚"切片，以加快组织脱钙速度。将双金刚石刀片间距设置为 5 mm，使颞骨中央部分切片厚度为 5 mm。确保两端组织切片厚度为 3–5 mm。
3. 将厚切片置于 200–300 mL 的 23% w/w 甲酸脱钙液中，在室温下处理 7–10 天，直至组织足够柔软以进行石蜡包埋。每天更换一次溶液。通过触诊标本检查脱钙是否充分，标本应感觉柔软。
   注意：也可通过 X 射线验证脱钙效果。
4. 将标本置于流水下冲洗 24 小时，方法是将其放入大烧杯中，并置于持续流动的水龙头下。
5. 使用浓度递增的系列酒精对组织进行脱水⁷。将组织浸入 100–200 mL 的 70% 乙醇中 1.5 小时，随后分别用 95% 和 100% 乙醇各清洗三次，每次 1.5 小时。接着用二甲苯清洗 3 次，每次 1.5 小时。
6. 将厚切片进行石蜡包埋，共处理四次，每次 45 分钟。
7. 使用切片机切割薄切片（10 µm）。调整组织位置，使其沿轴向切片。如需要，可切割较厚切片（20 µm）。

3. 免疫组织化学与成像

1. 如果需要进行传统的苏木精-伊红染色（本文未描述），应在将切片贴附到载玻片之前完成染色⁷。
2. 将切片贴附于带正电荷的玻璃载玻片上。
3. 将载玻片置于60 °C的加热板上烘烤20分钟。
4. 将载玻片放入支架中，并浸入含有有机溶剂（本实验中为二乙醇胺）和乙醇的商用预处理液中，以进行脱蜡、再水化及抗原修复。
   注意：此步骤对于福尔马林固定石蜡包埋组织的免疫组织化学获得满意结果是必要的。
5. 将载玻片置于高压锅中，在高压力下加热20分钟。
6. 将载玻片置于湿化孵育盒中，使用商用封闭液对组织进行封闭处理。
7. 使用针对血管紧张素转换酶2（ACE2；1:50）、跨膜丝氨酸蛋白酶2（TMPRSS2，1:1,000）以及弗林蛋白酶（Furin，1:250）的一抗孵育组织切片。
   注意：选用ACE2、TMPRSS2和Furin抗体是因为这些蛋白被认为在SARS-CoV-2感染性中发挥作用^11,12，本方案旨在探讨SARS-CoV-2可能感染中耳的潜在机制¹³。
8. 使用HRP标记的抗兔二抗（ACE2、Furin；1:100稀释）或抗山羊二抗（TMPRSS2；1:100稀释）进行孵育。
9. 用70%水溶性苏木精对切片进行复染。
10. 使用配备数字相机的光学显微镜采集图像。分别以20倍和10倍放大倍数获取中耳黏膜和咽鼓管的图像。

结果

中耳黏膜和咽鼓管的苏木精-伊红染色显示，经过处理后中耳黏膜及黏膜下组织结构得以保留（图1）。免疫组织化学图像显示，中耳黏膜和咽鼓管中存在ACE2、TMPRSS2和Furin蛋白的表达（图1）。这些蛋白在中耳内的存在提示了SARS-CoV-2可能通过此途径感染中耳呼吸上皮^11,12,13。此外，这些蛋白在咽鼓管中的表达可能解释了病毒经由鼻咽部通过咽鼓管进入中耳的传播途径。

讨论

人类颞骨研究对于探讨中耳和内耳病理至关重要，但该研究仍耗时且耗费资源。本文介绍了一种利用金刚石微锯制备较厚颞骨切片的技术，该切片可在进一步切片前快速脱钙，从而使组织从获取到研究的时间由9至10个月缩短至10至14天。该技术可能减少颞骨处理所需的资源，并促进对时间敏感的研究，例如与新型冠状病毒（COVID-19）相关的中耳和内耳病理研究¹³，这正是开发本实验方案的动因。本方案实现了对中耳和咽鼓管内ACE2、TMPRSS2和Furin表达的可视化，揭示了SARS-CoV-2可能通过咽鼓管从鼻咽部传播进而感染中耳的潜在机制。

本方案的主要创新之处在于使用金刚石锯在脱钙前对组织进行切割，从而产生"较厚"的颞骨切片，通过增加组织暴露于脱钙剂的表面积，可实现快速脱钙。该步骤使组织脱钙时间缩短至7–10天，而传统方案通常需要1–2个月才能完成脱钙。使用金刚石锯制备的"较厚"组织切片也比标准的颞骨组织块脱水更快，从而缩短了脱钙与包埋之间的时间。此外，本方案采用石蜡作为包埋介质，而非需要约3个月才能硬化的火棉胶

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗ACE-2抗体（1:50稀释）	Novus Biologicals	SN0754
抗Furin抗体（1:250稀释）	Abcam	EPR 14674
抗TMPRSS2抗体（1:1,000稀释）	Novus Biologicals	NBP1-20984
BX43手动系统显微镜	Olympus Life Science Solutions
CBN/金刚石复合切片刀片	Pace Technologies	WB-007GP
Collin骨锤 - 8英寸	Surgical Mart	SM1517
DS-Fi3显微镜相机	Nikon
双重内源性酶阻断剂（商用封闭液）	Dako	S2003
伊红染色液	Sigma-Aldrich	548-24-3
中性缓冲福尔马林溶液（10%）	Sigma-Aldrich	HT501128
Formical-4脱钙剂（甲酸脱钙液）	StatLab	1214-1 GAL
苏木精染色液	Sigma-Aldrich	H9627
HRP标记的抗兔二抗（1:100稀释）	Leica Biosystems	PV6119
ImmPRESS HRP马抗山羊IgG检测试剂盒，过氧化物酶（1:100稀释）	Vector Laboratories	MP-7405
Lambotte骨刀	Surgical Mart	SM1553
金相PICO 155P精密切割锯	Pace Technologies	PICO 155P	microsaw
NIS Elements软件版本4.6	Nikon
Paraplast Plus	Sigma-Aldrich	P3683	paraffin
带白色磨砂端的正电荷载玻片	Walter Products	1140B15
Thermo Shandon Crytome FSE冷冻切片机	New Life Scientific Inc.	A78900104	cryotome
Triology预处理溶液（商用预处理液）	Sigma-Aldrich	920P-05
二甲苯	Sigma-Aldrich	920P-05