相干反斯托克斯拉曼光谱（CARS）在脑切片髓鞘成像中的应用

摘要

可视化髓鞘化是许多研究神经系统研究人员的重要目标。CARS 是一种可与免疫荧光兼容的技术，能够直接对脑组织等样本中的脂质进行成像，从而揭示髓鞘等特化结构。

摘要

相干反斯托克斯拉曼光谱技术（CARS）是一种经典上由化学家和物理学家使用的技术，用于产生分子特征振动的相干信号。然而，这些振动特征同样存在于脑等解剖组织内的分子中，因此该技术在神经科学领域的应用正变得越来越广泛和实用。例如，CARS 可通过特异性激发这些分子内部的化学键来检测脂质，从而实现对组织不同方面的定量分析，如参与神经传导的髓鞘。此外，与其他常用于髓鞘定量的技术相比，CARS 还可被设置为与免疫荧光技术兼容，从而实现与其他标记物（如钠离子通道或突触传递的其他组分）的共标记。髓鞘化变化在多发性硬化等脱髓鞘疾病，以及脆性 X 染色体综合征或自闭症谱系障碍等其他神经系统疾病中的研究正成为一个新兴的重要领域。总之，CARS 可以以创新的方式被用于解答神经科学中的紧迫问题，并为多种不同神经系统疾病的潜在机制提供证据。

引言

动作电位是大脑中信息的基本单位，动作电位在轴突中的传导构成了信息处理的一个重要基础^1,2,3。神经元通常从多个其他神经元接收传入输入，并在特定的短暂时间窗口内整合这些输入^4,5。因此，轴突中动作电位传导的机制受到了研究者的广泛关注。

动作电位在轴突中传导时，会沿着轴突反复再生，以确保可靠传播⁶。在有颌脊椎动物（gnathostomes）的大多数神经元中，轴突被髓鞘包裹，髓鞘是一种富含脂质的物质，由邻近的少突胶质细胞或施万细胞（均为胶质细胞类型）产生（综述见^7,8）。这种髓鞘对轴突具有电绝缘作用，可降低其电容，从而使动作电位的传导更高效、更快速，并减少能量消耗。髓鞘并非均匀覆盖整个轴突，而是以节段形式包裹轴突，节段之间存在短小的间隙，称为郎飞结（综述见^9,10）。髓鞘的厚度（控制轴突电绝缘程度）以及....

方案

所有实验均遵守所有适用的法律法规、美国国立卫生研究院指南，并已获得科罗拉多大学安舒茨分校机构动物护理和使用委员会的批准。

1. 动物

1. 使用来自杰克逊实验室的 C57BL/6J（货号 #000664）小鼠（Mus musculus）或最初来自查尔斯河的蒙古沙鼠（Meriones unguiculatus）。

2. 组织制备

1. 进行心脏灌注时，使用戊巴比妥钠（120 mg/kg 体重）对目标啮齿类动物实施过量麻醉，随后经心脏灌注磷酸盐缓冲液（PBS；137 mM NaCl，2.7 mM KCl，1.76 mM KH₂PO_4, 10 mM Na₂HPO₄），接着灌注4%多聚甲醛（PFA）²⁴。
   1. 具体操作：使用剪刀打开腹部和肋骨 cage，并用凯利止血钳固定肋骨 cage，以暴露心脏。
   2. 将连接至灌注泵的23号针头插入左心室，并用精细剪刀迅速剪开右心房。
   3. 通过灌注泵和心脏中的针头灌注PBS，持续10分钟，以清除脑部和体内的血液。
   4. 将灌注泵切换至4%....

结果

相较于其他技术，CARS显微成像最大的优势之一是其与荧光成像的兼容性²³。图1展示了CARS光谱与使用免疫荧光标记的尼氏染色光谱的对比，显示两者光谱重叠极少或无重叠。图2展示了CARS与共聚焦显微成像结合时的激光系统设置。图3展示了两个代表性图像，分别为来自沙鼠和小鼠的单层图像和z轴层扫最大投影图像，这些图像可通过CARS成像获得，显示了细胞体（青色）和髓鞘信号（品红色）。

....

讨论

越来越多的研究文献强调了髓鞘在大脑功能中的重要作用^13,16,21,28。此外，我们知道髓鞘的厚度和分布模式在多种神经系统疾病中会发生改变，例如多发性硬化（综述见²⁹）、衰老（综述见³⁰）、自闭症^20,31以及其他许多疾病。因此，越来越多的研究人员需要在不同的医学状况、动物模型以及日益增多的实验条件下评估脑组织中的髓鞘化情况，这并不令人意外。传统上用于脑组织髓鞘成像的方法包括抗体标记后进行光学显微镜观察，以及电子显微镜（EM）技术。这两种方法均耗时较长，且需要多步骤的组织制备流程，而这些流程可能引入误差并改变组织成分。我们展示了一种替代方法，该方法能够更快地成像髓鞘，从而在.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
麻醉剂：
1 mL 一次性带针注射器，27 GA × 0.5"	Exel int	260040
致命剂量 +	Vortech
手术：
弹簧剪刀 - 8 mm 切割刃	Fine Science Tools	15024-10
标准镊子	Fine Science Tools	11027-12
灌注：
4% 多聚甲醛	Fisher Chemical	SF994 (CS)
精细剪刀 - 锐利型	Fine Science Tools	14063-11
凯利止血钳	Fine Science Tools	13019-14
Millipore H2O
针头尖端，23 GA × 1"	BD precision glide	305193
磷酸盐缓冲液（PBS）：
氯化钾	Sigma	P9333
磷酸二氢钾	Sigma	P5655
带可变流速的泵或等效设备
氯化钠	Fisher Chemical	s271-1
磷酸氢二钠	Sigma	S7907
解剖：
含 4% PFA 的 50 mL 瓶
Bochem 化学勺，180 mm	Bochem	230331000
精细剪刀 - 锐利型	Fine Science Tools	14063-11
Noyes 弹簧剪刀	Fine Science Tools	15011-12
一对精细（Graefe）镊子	Fine Science Tools	11050-10
浅玻璃或塑料托盘，约 10" × 10"
标准镊子	Fine Science Tools	11027-12
外科剪刀 - 钝头型	Fine Science Tools	14000-20
切片：
琼脂，植物来源	RPI	9002-18-0
振动切片机	Leica	VT1000s
多孔板	Alkali Sci.	TPN1048-NT
染色：
AB 培养基：			1n 1,000 mL Millipore H2O
磷酸缓冲液（PB）：
磷酸二氢钾	Sigma	P5655
磷酸氢二钠	Sigma	S7907
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma life science	A2153-100g
氯化钠	Fisher Chemical	s271-1
吐温 X-100	Sigma - Aldrich	x100-500ml
Nissl 435/455	Invitrogen	N21479
CARS：
APE 皮秒翡翠激光器	Angewandte Physik & Elektronik GmbH
带通滤光片（420–520 nm）	Chroma Technology	HQ470/100m-2P
带通滤光片（500–530 nm）	Chroma Technology	HQ515/30m-2P
带通滤光片（640–680 nm）	Chroma Technology	HQ660/40m-2P
共聚焦显微镜	Olympus	FV1000
切片转移移液管	Fisher	13-711-7M
二向色长通滤光片 565 nm	Chroma Technology	565dcxr
二向色长通滤光片 585 nm	Chroma Technology	585dcxr
二向色短通滤光片 750 nm	Chroma Technology	T750spxrxt
玻璃底培养皿	MatTek	P35G-0-10-C
玻璃压片（10 mm × 10 mm 硼硅玻璃棒）	Allen Scientific Glass Inc
多光子短通发射滤光片 680 nm	Chroma Technology	ET680sp-2p8
PBS