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相干反斯托克斯拉曼光谱（CARS）在脑切片髓鞘成像中的应用

DOI：

10.3791/64013

⸱

2022年7月22日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Integrative Biology, Oklahoma State University, 2Department of Physiology and Biophysics, University of Colorado Anschutz, 3Advanced Light Microscopy Core, University of Colorado Anschutz

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

可视化髓鞘化是许多研究神经系统研究人员的重要目标。CARS 是一种可与免疫荧光兼容的技术，能够直接对脑组织等样本中的脂质进行成像，从而揭示髓鞘等特化结构。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

相干反斯托克斯拉曼光谱技术（CARS）是一种经典上由化学家和物理学家使用的技术，用于产生分子特征振动的相干信号。然而，这些振动特征同样存在于脑等解剖组织内的分子中，因此该技术在神经科学领域的应用正变得越来越广泛和实用。例如，CARS 可通过特异性激发这些分子内部的化学键来检测脂质，从而实现对组织不同方面的定量分析，如参与神经传导的髓鞘。此外，与其他常用于髓鞘定量的技术相比，CARS 还可被设置为与免疫荧光技术兼容，从而实现与其他标记物（如钠离子通道或突触传递的其他组分）的共标记。髓鞘化变化在多发性硬化等脱髓鞘疾病，以及脆性 X 染色体综合征或自闭症谱系障碍等其他神经系统疾病中的研究正成为一个新兴的重要领域。总之，CARS 可以以创新的方式被用于解答神经科学中的紧迫问题，并为多种不同神经系统疾病的潜在机制提供证据。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

动作电位是大脑中信息的基本单位，动作电位在轴突中的传导构成了信息处理的一个重要基础1,2,3。神经元通常从多个其他神经元接收传入输入，并在特定的短暂时间窗口内整合这些输入4,5。因此，轴突中动作电位传导的机制受到了研究者的广泛关注。

动作电位在轴突中传导时，会沿着轴突反复再生，以确保可靠传播6。在有颌脊椎动物（gnathostomes）的大多数神经元中，轴突被髓鞘包裹，髓鞘是一种富含脂质的物质，由邻近的少突胶质细胞或施万细胞（均为胶质细胞类型）产生（综述见7,8）。这种髓鞘对轴突具有电绝缘作用，可降低其电容，从而使动作电位的传导更高效、更快速，并减少能量消耗。髓鞘并非均匀覆盖整个轴突，而是以节段形式包裹轴突，节段之间存在短小的间隙，称为郎飞结（综述见9,10）。髓鞘的厚度（控制轴突电绝缘程度）以及郎飞结的间距（控制动作电位沿轴突再生的频率）均会影响动作电位的传导速度（综述见11）。

大量文献表明，髓鞘厚度会影响轴突中动作电位的传导速度12,13,14。此外，轴突髓鞘化的改变可能导致多种中枢神经系统功能障碍15,16,17,18,19,20,21。因此，许多研究工作的重点集中在轴突髓鞘化的测量与表征上也就不足为奇了。髓鞘厚度的测量通常采用电子显微镜技术，但该方法需要大量的组织制备步骤，且难以与免疫组织化学联合使用。然而，还存在一种更快、更简便的测量轴突髓鞘化的方法，即基于相干反斯托克斯拉曼散射光谱（Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy, CARS）的技术。CARS 激光可调节至不同频率，当调至适合激发脂质的频率时，无需任何额外标记即可实现髓鞘成像22。脂质成像可与标准免疫组织化学相结合，从而实现脂质信号与多个荧光通道的同时成像23。利用 CARS 进行髓鞘成像的速度显著快于电子显微镜，其分辨率虽低于电镜，但已足以检测同类型轴突中细微的髓鞘化差异。

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方案

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所有实验均遵守适用的法律法规、美国国立卫生研究院指南，并经科罗拉多大学安舒茨分校机构动物护理和使用委员会批准。

1. 动物

  1. 使用来自杰克逊实验室的 C57BL/6J（货号 #000664）小鼠（Mus musculus）或最初来自查尔斯河实验室的蒙古沙鼠（Meriones unguiculatus）。

2. 组织制备

  1. 进行心脏灌注时，使用戊巴比妥钠（120 mg/kg 体重）对目标啮齿类动物实施过量麻醉，随后经心脏灌注磷酸盐缓冲液（PBS；137 mM NaCl，2.7 mM KCl，1.76 mM KH2PO4，10 mM Na2HPO4），接着灌注4%多聚甲醛（PFA）24。
    1. 具体操作：使用剪刀打开腹部和肋骨 cage，并用凯利止血钳固定肋骨 cage，以暴露心脏。
    2. 将连接至灌注泵的23号针头插入左心室，并用精细剪刀迅速剪开右心房。
    3. 通过灌注泵和心脏中的针头灌注PBS，持续10分钟，以清除脑部和体内的血液。
    4. 将灌注泵切换至4% PFA，继续灌注10分钟，并检查四肢和尾巴是否僵硬，以确认灌注成功。
  2. 灌注完成后，将动物断头，取出颅内脑组织。将脑组织在4% PFA中固定过夜，然后转移至PBS中。将脑干包埋于4%琼脂糖（溶于PBS）中，使用振动切片机进行冠状面切片，厚度为200 µm。

3. 染色

  1. 在抗体孵育液（AB 液：0.1 M 磷酸盐缓冲液（PB：50 mM KH2PO4，150 mM Na2HPO4），150 mM NaCl，3 mM Triton-X，1% 牛血清白蛋白（BSA））中对游离漂浮切片进行尼氏（Nissl）染色，以显示细胞体（1:100），在室温下于普通实验室摇床上孵育 30 分钟25。
    1. 使用铝箔和/或盖子保护切片免受光照。波长在 550 nm 及以下适用于 CARS 成像（图 1）。
      注意：尽管我们认为 Triton-X 或其他试剂对脂质的 CARS 成像无显著影响，但使用特定抗体孵育液时仍建议增加相应的对照实验。
  2. 暂停点：将游离漂浮切片（避光保存）置于 PBS 中，直至成像。脑组织切片制备后，应在两周内完成成像。

光谱发射与吸收图，显示光子分析中的强度与波长关系。
图 1：CARS 成像可与免疫荧光成像结合使用。 图中显示，CARS 成像发生在 660/640 nm 的红光信号光谱范围26。该波长与绿光、蓝光或紫外光范围相距足够远，因此可将 CARS 信号与这些波段的免疫荧光信号结合使用。具体而言，图中还标示了用蓝色荧光染料标记的尼氏体（Nissl）的激发和发射光谱，本研究在获取代表性结果时即结合了该标记与 CARS 成像。 请点击此处查看此图的放大版本。

4. 成像

注意：CARS 激光系统包含一个提供 80 MHz 时钟的光纤激光器，以及一个可调谐范围为 770–990 nm 的 OPO（光学参量振荡器）激光器，斯托克斯光束固定在 1031 nm，这些是采集 CARS 信号所必需的。两个光束共用一个光阑。

  1. 在将样品送至显微镜之前，打开CARS激光器并预热至少1小时，对CARS激光进行校准，并对显微镜的聚光镜光学系统和光圈进行科勒照明（Koehler）调节，以实现前向CARS成像。
    注意：此步骤对CARS显微镜的正常运行至关重要。
    1. 为实现两束激光（泵浦光和斯托克斯光）的空间对准，通过CARS激光器的图形用户界面（GUI）访问两个内部的位置敏感探测器（PSD）。
    2. 利用CARS激光器GUI中的延迟功能实现时间对准，该功能可帮助重叠由于波长不同而产生不同色散的两束激光（泵浦光和斯托克斯光）的脉冲。因此，泵浦光和斯托克斯光的时空重叠均通过用户在GUI中的输入完成。
    3. 调节外部的潜望镜系统（装置中的最后两个反射镜），将空间上重叠的两束激光对准显微镜扫描头的反射镜中心。
    4. 为实现最佳的前向CARS非共焦检测，确保聚光镜已完成科勒照明调节（即聚光镜已居中并对焦于光圈，以实现均匀照明）。
  2. 对于免疫荧光共聚焦成像和CARS成像，将配备前向和背向CARS非共焦探测器（NDDs）的CARS激光系统，与一台带有可见光激光器用于荧光成像的共聚焦显微镜整合（图2）。
  3. 将组织切片置于带有盖玻片的培养皿中（用于倒置显微镜观察），加入PBS以防止组织干燥，并使用玻璃压片使组织紧贴盖玻片。
  4. 使用60倍、数值孔径（NA）为1.2、经红外校正的水浸物镜，采集Z轴层扫图像或单张图像，该物镜可用于背向收集CARS信号，并通过0.55 NA的聚光镜从前向进行信号收集，以成像如斜方体旁正中核（MNTB）等脑区。
    1. 通过CARS激光器GUI，以约600 mW的泵浦/探测光功率和300 mW的斯托克斯光功率采集CARS图像。这些激光功率值由系统内部测量。在样品位置处，两束激光的功率均低于25 mW，对组织样品安全。
    2. 在空间和时间上重叠泵浦光和斯托克斯光束。将OPO调谐至797.2 nm，从而产生650 nm的CARS波长。由于处于较高能级，返回基态时的信号为反斯托克斯（蓝移）信号。
    3. 使用带通滤光片（640–680 nm）从前向或背向非共焦探测器捕获CARS信号，随后依次检测免疫荧光标记（本例中为荧光标记的尼氏体）。
      注意：尼氏体神经元胞体标记物不会被CARS 640–680 nm带通滤光片捕获，因此可在下述图像中实现荧光与CARS成像的结合。
    4. CARS与荧光信号不共用光电倍增管（PMT）。使用这些设置以获得最佳脂质信号，从而选择性地成像脑区的髓鞘化情况。
      警告：需对操作者进行激光束屏蔽保护
  5. 将图像保存为.oib文件格式，以便导入图像分析软件进行进一步定量分析（图3）。

CARS显微镜装置示意图，显示激光光路和光学成像的信号采集。
图2：CARS仪器示意图，显示CARS激光（红色箭头）以及整合到激光扫描共聚焦显微镜上的非扫描（NDD）正向和反向检测光路。 在正向NDD中，我们采集C-H键的CARS信号（深红色箭头）和515 nm的SHG（二次谐波生成，橙色箭头）。在反向NDD中，我们采集C-H键的CARS信号（深红色箭头）和2PE（双光子发射）自体荧光（浅蓝色箭头）。此外，可依次采集荧光共聚焦图像（可见光激光用绿色箭头表示，共聚焦检测用蓝色箭头表示）。请点击此处查看此图的放大版本。

尼氏染色与CARS显微图像；沙鼠与小鼠组织比较；细胞结构分析。
图3：CARS可在脑组织（脑干）中显示髓鞘（品红色），同时成像尼氏物质（青色）或荧光标记物。 两组图像分别展示了蒙古沙鼠（单幅图像 M. unguiculatus，图3A、C、E）和小鼠（z轴层叠最大投影 M. musculus，图3B、D、F）脑组织的代表性结果，表明该技术可跨物种应用。图3A、B 显示青色的尼氏物质，C、D 显示品红色的CARS信号，E、F 分别将沙鼠和小鼠的尼氏物质与CARS信号合并显示。两组图像均展示脑干中斜方体内侧核（MNTB）的一个切片。MNTB中的神经元接收来自高度髓鞘化轴突的输入，这些轴突终止于 Held 氏篮状终末，这是一种巨型突触27。比例尺为 20 µm。请点击此处查看此图的放大版本。

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结果

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相较于其他技术，CARS显微成像最大的优势之一是其与荧光成像的兼容性23。图1展示了CARS光谱与使用免疫荧光标记的尼氏染色光谱的对比，显示两者光谱重叠极少或无重叠。图2展示了CARS与共聚焦显微成像结合时的激光系统设置。图3展示了两个代表性图像，分别为来自沙鼠和小鼠的单层图像和z轴层扫最大投影图像，这些图像可通过CARS成像获得，显示了细胞体（青色）和髓鞘信号（品红色）。

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讨论

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越来越多的研究文献强调了髓鞘在大脑功能中的重要作用13,16,21,28。此外，我们知道髓鞘的厚度和分布模式在多种神经系统疾病中会发生改变，例如多发性硬化（综述见29）、衰老（综述见30）、自闭症20,31以及其他许多疾病。因此，越来越多的研究人员需要在不同的医学状况、动物模型以及日益增多的实验条件下评估脑组织中的髓鞘化情况，这并不令人意外。传统上用于脑组织髓鞘成像的方法包括抗体标记后进行光学显微镜观察，以及电子显微镜（EM）技术。这两种方法均耗时较长，且需要多步骤的组织制备流程，而这些流程可能引入误差并改变组织成分。我们展示了一种替代方法，该方法能够更快地成像髓鞘，从而在...

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披露

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作者声明无利益冲突。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

由美国国立卫生研究院（NIH）R01 DC 17924、R01 DC 18401（Klug）以及 NIH 1R15HD105231-01、T32DC012280 和 FRAXA（McCullagh）项目资助。CARS 成像在科罗拉多大学安舒茨医学校区神经技术中心的先进光学显微镜核心设施完成，该设施部分由 NIH P30 NS048154 和 NIH P30 DK116073 项目支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
麻醉剂：
1 mL 一次性带针注射器，27 GA × 0.5"Exel int260040
致命剂量 +Vortech
手术：
弹簧剪刀 - 8 mm 切割刃Fine Science Tools15024-10
标准镊子Fine Science Tools11027-12
灌注：
4% 多聚甲醛Fisher ChemicalSF994 (CS)
精细剪刀 - 锐利型Fine Science Tools14063-11
凯利止血钳Fine Science Tools13019-14
Millipore H2O
针头尖端，23 GA × 1"BD precision glide305193
磷酸盐缓冲液（PBS）：
氯化钾SigmaP9333
磷酸二氢钾SigmaP5655
带可变流速的泵或等效设备
氯化钠Fisher Chemicals271-1
磷酸氢二钠SigmaS7907
解剖：
含 4% PFA 的 50 mL 瓶
Bochem 化学勺，180 mmBochem230331000
精细剪刀 - 锐利型Fine Science Tools14063-11
Noyes 弹簧剪刀Fine Science Tools15011-12
一对精细（Graefe）镊子Fine Science Tools11050-10
浅玻璃或塑料托盘，约 10" × 10"
标准镊子Fine Science Tools11027-12
外科剪刀 - 钝头型Fine Science Tools14000-20
切片：
琼脂，植物来源RPI9002-18-0
振动切片机LeicaVT1000s
多孔板Alkali Sci.TPN1048-NT
染色：
AB 培养基：1n 1,000 mL Millipore H2O
磷酸缓冲液（PB）：
磷酸二氢钾SigmaP5655
磷酸氢二钠SigmaS7907
牛血清白蛋白（BSA）Sigma life scienceA2153-100g
氯化钠Fisher Chemicals271-1
吐温 X-100Sigma - Aldrichx100-500ml
Nissl 435/455InvitrogenN21479
CARS：
APE 皮秒翡翠激光器Angewandte Physik & Elektronik GmbH
带通滤光片（420–520 nm）Chroma TechnologyHQ470/100m-2P
带通滤光片（500–530 nm）Chroma TechnologyHQ515/30m-2P
带通滤光片（640–680 nm）Chroma TechnologyHQ660/40m-2P
共聚焦显微镜OlympusFV1000
切片转移移液管Fisher13-711-7M
二向色长通滤光片 565 nmChroma Technology565dcxr
二向色长通滤光片 585 nmChroma Technology585dcxr
二向色短通滤光片 750 nmChroma TechnologyT750spxrxt
玻璃底培养皿MatTekP35G-0-10-C
玻璃压片（10 mm × 10 mm 硼硅玻璃棒）Allen Scientific Glass Inc
多光子短通发射滤光片 680 nmChroma TechnologyET680sp-2p8
PBS

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cole, K., Curtis, H. Electric impedance of the squid giant axon during activity. The Journal of General Physiology. 22 (5), 649-670 (1939).
  2. Cole, K. S., Curtis, H. J. Membrane potential of the squid giant axon during current flow. Journal of General Physiology. 24 (4), 551-563 (1941).
  3. Alcami, P., El Hady, A. Axonal computations. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 413(2019).
  4. Neumann, E., Nachmansohn, D. Nerve excitability-Toward an integrating concept. Aharon Katzir Memorial Volume. , 99-166 (1975).
  5. Waxman, S. G. Integrative properties and design principles of axons. International Review of Neurobiology. 18, 1-40 (1975).
  6. Fitzhugh, R. Computation of impulse initiation and saltatory conduction in a myelinated nerve fiber. Biophysical Journal. 2 (1), 11-21 (1962).
  7. Zalc, B. The acquisition of myelin: a success story. Novartis Foundation Symposium. 276, 275-281 (2006).
  8. Salzer, J. L., Zalc, B. Myelination. Current Biology. 26 (20), 971-975 (2016).
  9. Boullerne, A. I. The history of myelin. Experimental Neurology. 283, 431-445 (2016).
  10. Kuhn, S., Gritti, L., Crooks, D., Dombrowski, Y. Oligodendrocytes in development, myelin generation and beyond. Cells. 8 (11), 1424(2019).
  11. Saab, A. S., Nave, K. -A. Myelin dynamics: protecting and shaping neuronal functions. Current Opinion in Neurobiology. 47, 104-112 (2017).
  12. Chomiak, T., Hu, B. What is the optimal value of the g-Ratio for myelinated fibers in the rat CNS? A theoretical approach. PLOS ONE. 4 (11), 7754(2009).
  13. Ford, M. C., et al. Tuning of Ranvier node and internode properties in myelinated axons to adjust action potential timing. Nature Communications. 6, 8073(2015).
  14. Stange-Marten, A., et al. Input timing for spatial processing is precisely tuned via constant synaptic delays and myelination patterns in the auditory brainstem. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (24), 4851-4858 (2017).
  15. Bu, J., Banki, A., Wu, Q., Nishiyama, A. Increased NG2+ glial cell proliferation and oligodendrocyte generation in the hypomyelinating mutant shiverer. Glia. 48 (1), 51-63 (2004).
  16. Pacey, L. K. K., et al. Delayed myelination in a mouse model of fragile X syndrome. Human Molecular Genetics. 22 (19), 3920-3930 (2013).
  17. Green, A. J., et al. Clemastine fumarate as a remyelinating therapy for multiple sclerosis (ReBUILD): a randomised, controlled, double-blind, crossover trial. Lancet. 390 (10111), London, England. 2481-2489 (2017).
  18. Jeon, S. J., Ryu, J. H., Bahn, G. H. Altered translational control of fragile X mental retardation protein on myelin proteins in neuropsychiatric disorders. Biomolecules & Therapeutics. 25 (3), 231-238 (2017).
  19. Barak, B., et al. Neuronal deletion of Gtf2i, associated with Williams syndrome, causes behavioral and myelin alterations rescuable by a remyelinating drug. Nature Neuroscience. 22 (5), 700-708 (2019).
  20. Phan, B. N., et al. A myelin-related transcriptomic profile is shared by Pitt-Hopkins syndrome models and human autism spectrum disorder. Nature Neuroscience. 23 (3), 375-385 (2020).
  21. Lucas, A., Poleg, S., Klug, A., McCullagh, E. A. Myelination deficits in the auditory brainstem of a mouse model of fragile X syndrome. Frontiers in Neuroscience. 15, 1536(2021).
  22. Wang, H., Fu, Y., Zickmund, P., Shi, R., Cheng, J. -X. Coherent anti-stokes raman scattering imaging of axonal myelin in live spinal ttissues. Biophysical Journal. 89 (1), 581-591 (2005).
  23. Kim, S. -H., et al. Multiplex coherent anti-stokes raman spectroscopy images intact atheromatous lesions and concomitantly identifies distinct chemical profiles of atherosclerotic lipids. Circulation Research. 106 (8), 1332-1341 (2010).
  24. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).
  25. Tu, L., et al. Free-floating Immunostaining of Mouse Brains. Journal of Visualized Experiments. (176), e62876(2021).
  26. Fluorescence SpectraViewer. , Available from: https://www.thermofisher.com/order/fluorescence-spectraviewer (2022).
  27. Held, H. Die centrale gehörleitung. Arch Anat Physiol Anat Abt. 17, 201-248 (1893).
  28. Sherman, D. L., Brophy, P. J. Mechanisms of axon ensheathment and myelin growth. Nature Reviews Neuroscience. 6 (9), 683-690 (2005).
  29. Gruchot, J., et al. The molecular basis for remyelination failure in multiple sclerosis. Cells. 8 (8), 825(2019).
  30. Rivera, A. D., et al. Epidermal growth factor pathway in the age-related decline of oligodendrocyte regeneration. Frontiers in Cellular Neuroscience. 16, 838007(2022).
  31. Kútna, V., O'Leary, V. B., Hoschl, C., Ovsepian, S. V. Cerebellar demyelination and neurodegeneration associated with mTORC1 hyperactivity may contribute to the developmental onset of autism-like neurobehavioral phenotype in a rat model. Autism Research: Official Journal of the International Society for Autism Research. 15 (5), 791-805 (2022).
  32. Ozsvár, A., et al. Quantitative analysis of lipid debris accumulation caused by cuprizone induced myelin degradation in different CNS areas. Brain Research Bulletin. 137, 277-284 (2018).
  33. Prineas, J. W., Graham, J. S. Multiple sclerosis: capping of surface immunoglobulin G on macrophages engaged in myelin breakdown. Annals of Neurology. 10 (2), 149-158 (1981).
  34. Bégin, S., et al. Automated method for the segmentation and morphometry of nerve fibers in large-scale CARS images of spinal cord tissue. Biomedical Optics Express. 5 (12), 4145-4161 (2014).

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