利用解剖学特异性单细胞基因表达方法研究成瘾行为中反奖赏驱动因素

摘要

激光捕获显微切割与微流控反转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）相结合，可在单个神经元和胶质细胞中实现转录组检测的解剖学与生物技术特异性。将创新方法与系统生物学策略应用于精神疾病研究，可能推动对疾病机制的理解与治疗手段的发展，例如成瘾中的神经炎症性奖赏缺失假说。

摘要

成瘾行为发生率的上升促使心理健康研究人员和临床医生共同致力于理解反奖赏机制与康复过程。这种从奖赏机制向反奖赏机制的转变，需要全新的视角、范式和假设，同时扩展用于研究成瘾的方法。在此，我们提供一个范例：采用系统生物学方法研究反奖赏机制，该方法结合了激光捕获显微切割技术（LCM）和高通量微流控反转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）。通过该方法测量了基因表达网络的动态变化，并鉴定出在酒精和阿片类物质戒断过程中导致神经内脏功能失调及神经炎症的关键驱动因子。这一技术组合可在单细胞分辨率下实现解剖学和表型特异性分析，同时具备高通量灵敏度和特异性基因表达检测能力，从而产生可用于提出新假说的数据集以及揭示潜在机制的可能性，为获得新的科学认知和开发创新治疗方法提供契机。

引言

成瘾问题在发达国家仍日益严峻^1,2。尽管科学和临床领域取得了重大进展，成瘾的发生率仍在持续上升，而已有治疗方法的疗效至多保持稳定^3,4,5。然而，生物技术和科学研究方法的进步催生了新的研究手段和假说，有助于进一步探究物质依赖的病理生理机制^6,7,8。事实上，近期的发展表明，新概念和治疗范式可能带来具有社会、经济和政治影响的重大突破^9,10,11,12。

我们研究了酒精和阿片类药物依赖戒断过程中的反奖赏现象^13,14,15,16。方法学在此范式中居于核心地位^17,18。激光捕获显微切割技术（LCM）能够以高解剖特异性选取单个细胞。该技术功能对于神经炎症反奖赏假说至关重要，因为可在同一只动物的同一神经亚核内分别收集并分析胶质细胞和神经元^{13,14,15,16,19}。随后，可利用高通量微流控反转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）检测所选细胞转录组的特定部分，从而获得高维数据集，用于计算分析以揭示功能网络的内在机制^20,21。

在特定脑核团中的神经元和胶质细胞内检测转录组的一个子集，可生成在样本数量和检测基因两方面均具有稳健性，且兼具高灵敏度与特异性的数据集。这些工具非常适合用于精神疾病研究中的系统神经科学方法，因为在过去十年中，胶质细胞（主要是星形胶质细胞和小胶质细胞）已被证实对神经及精神疾病具有核心作用^22,23。我们的方法能够同时检测胶质细胞和神经元中多个参与局部旁分泌信号传导的受体和配体的表达反应。事实上，可通过模糊逻辑等各类定量方法，从这些数据集中推断出信号通路的活动情况²⁴。此外，识别神经元或胶质细胞中的细胞亚表型及其功能，有助于深入理解特定核团中脑细胞在单细胞水平上的组织方式、应答机制及失调过程。该功能系统的动态变化还可通过时间序列实验进行建模分析¹⁶。最后，可通过解剖学或药理学手段对动物模型进行干预，从而为这一系统性研究方法提供机制性条件。

代表性实验：
以下，我们提供这些方法应用的一个示例。本研究探讨了酒精依赖及其后续戒断对大鼠孤束核（NTS）中神经元和小胶质细胞基因表达的影响¹⁶。大鼠队列包括：1）对照组，2）乙醇依赖组（EtOH），3）戒断8小时组（Wd），4）戒断32小时组（Wd），以及5）戒断176小时组（Wd）（图1A）。在快速断头后，将脑干与前脑分离并进行冷冻切片，切片经酪氨酸羟化酶阳性（TH +）神经元和小胶质细胞染色（图1B）。利用激光显微切割技术（LCM）分别收集TH+和TH-神经元及小胶质细胞。所有细胞均来自NTS，并以每10个细胞为一组作为样本进行分析。在RT-qPCR平台上运行了四个96 × 96微流控RT-qPCR动态阵列，检测65个基因（图1B-C）。数据采用-ΔΔC_t法进行标准化，并使用R软件进行分析，同时通过分子标志物验证单细胞的选择（图1D-E）。技术重复性进一步通过同一批次内及不同批次间的重复实验得到验证（图2 和 图3）。TH+与TH-神经元呈现出不同的亚表型，具有相似的炎症相关基因簇，但在γ-氨基丁酸（GABA）受体（R）基因簇上存在差异（图4 和 图5）。在戒断32小时时，炎症基因簇表达升高的亚表型比例显著增加，而在长期酒精戒断期（176 h Wd）GABA受体（GABAR）的表达仍维持在较低水平。该研究支持酒精和阿片类药物依赖的“反奖赏”假说，即戒断期间来自内脏的内感受反馈可导致内脏-情绪相关神经核团（如NTS和杏仁核）的功能失调，从而引发更严重的自主神经和情绪后遗症，进一步促进物质依赖的形成（图6）。

方案

本研究严格遵循托马斯杰斐逊大学动物护理与使用委员会（IACUC）的建议进行。实验方案已获得托马斯杰斐逊大学IACUC的批准。

1. 动物模型

1. 将雄性Sprague Dawley大鼠（>120 g，Harlan，Indianapolis，IN，USA）按三只一组分别单独饲养，其中两只自由摄取含乙醇饲料，一只自由摄取对照饲料混合物。
   注：本代表性实验采用Lieber-DeCarli方案研究酒精戒断的神经生物学机制^25,26。每组三只大鼠构成一个队列，摄入相同热量，但在处死时分属研究的不同分组。本研究共设三个分组：1）对照组（Control），2）乙醇依赖组（EtOH），3）戒断组（Wd）（图1A）。由于设有三个酒精戒断时间点，本研究共包含五种实验条件（图1A）。
   1. 每隔一天测量戒断组（Wd）大鼠消耗的乙醇饲料混合物量，并将相同量的乙醇混合物补充至乙醇依赖组（EtOH）大鼠的饲喂器中；同时，向对照组大鼠饲喂器中添加等热量的对照混合物。
      注：持续3周后，每日乙醇平均消耗量约为12–16 g/kg²⁶。
   2. 在长期稳定摄入乙醇并形成依赖（>5周）后，通过清空戒断组（Wd）大鼠的食物容器并替换为对照混合物，诱导其发生急性酒精戒断。操作时应确保三只大鼠在相同的昼夜节律时间点被处死²¹。
   3. 在预先选定的时间点，同时处死同组的三只大鼠（对照组、乙醇依赖组和戒断组）。

2. 样品采集

1. 在每个大鼠三联体的适当 Wd 时间点（8 h、32 h、176 h），于相同的昼夜节律时间点采集脑组织。
   1. 准备甲醇与干冰浴，用于快速冷却新鲜组织，以保持 RNA 完整性。将其放置一旁备用。
   2. 将大鼠放入异氟烷罐（5% 异氟烷，氧气为载体）中约 30 秒，或直至其意识丧失，表现为呼吸频率降低且无运动活动。将大鼠头部放入已适当磨利的断头器中，迅速进行断头。
   3. 使用镊子打开动物颅骨，取出脑组织。用手持剃刀通过粗略切割从新鲜脑组织中移除小脑并弃去。通过横向切口，将脑干与前脑分离。
      注：根据实验设计，可进一步使用手持剃刀将前脑或脑干沿中线矢状切开为左右半球。例如，可用于通过不同方法验证一侧半球的结果、研究左右差异，或增加样本数量。
   4. 在组织包埋模具中加入适量的最佳切割温度（O.C.T.）包埋剂，深度约为 3–4 cm，确保组织样本可完全浸没。将组织（前脑和/或脑干）放入包埋模具中，并添加更多 O.C.T. 包埋剂，完全覆盖组织样本。
   5. 将含有组织样本（大鼠前脑）的塑料包埋模具放入干冰与甲醇的冷却浴中，立即冷冻组织样本。让包埋模具中的组织样本在冷却浴中停留，直至所有组织采集完成，但不超过 15 分钟。
      注：需小心避免甲醇溅入组织容器中。
   6. 迅速将组织样本储存于 -80 °C 条件下。
      ​注：微流控 RT-qPCR 通过扩增和检测 mRNA 转录本测量基因表达。这些转录本相对不稳定，因此该流程中采取多种措施使样本尽可能保持低温，以防止 mRNA 降解。

3. 冷冻切片

注意：大鼠神经元细胞核直径约为 10 µm。因此，对于该动物模型，最佳切片厚度为 10 µm。切片厚度应根据研究中所用的动物模型进行调整。

1. 从 -80 °C 冰箱中取出含有冷冻脑干的组织包埋模具，在冰冻切片机中于 -20 °C 下解冻样品 5-10 分钟。为保护 mRNA，仅可进行一次此 -20 °C 冻融操作。
2. 使用手持剃刀，垂直切割塑料包埋模具的四个角。将包埋在 O.C.T. 中的脑干从塑料组织包埋模具中取出。在设定为 -20 °C 的冰冻切片机样品台（chuck）上，使用室温液态 O.C.T. 作为粘合剂，将脑干按头端至尾端方向固定，用于冠状面冰冻切片。
3. 从大鼠脑干头端至尾端方向切取 10 µm 厚的冠状面冰冻切片，直至获得包含目标区域（NTS）的切片。这些冰冻切片的高度和宽度约为 200 mm，取决于塑料包埋模具的尺寸。
4. 通过解冻贴附法，将包含 NTS 或根据研究需要选定的其他目标区域的 10 µm 脑干组织冰冻切片贴附至室温的普通载玻片上。迅速将贴有切片的载玻片放入置于干冰上的冷却金属盘中。尽快将含有冰冻切片的载玻片放入 -80 °C 冰箱中保存。
   ​注意：由于载玻片的宽度和高度约为 200 mm，单张载玻片可容纳多个 10 µm 冰冻切片。因此，同一张载玻片可承载用于染色不同细胞类型的多个冰冻切片。
   1. 当一张载玻片上放置多个切片时，应确保切片之间留有 100 mm 的空白间隔。使用疏水笔在冰冻切片之间绘制边界，以便在同一张载玻片上用不同的抗体溶液对不同细胞类型进行染色。冰冻切片与载玻片边缘之间应保留 20 mm 的间距。

4. 单细胞免疫荧光染色

1. 采用快速染色免疫荧光方案对脑冷冻切片进行处理，以标记目标脑细胞类型（如神经元、小胶质细胞、星形胶质细胞等），用于后续激光显微切割（LCM）收集。
   注意：本实验所用免疫组织化学染色方案设计为快速操作，以防止此过程中mRNA过度降解。
   1. 从-80 °C冰箱中取出载有大鼠延髓孤束核（NTS）区域10 µm脑冷冻切片的玻璃载片。将载片浸入75%乙醇溶液中30秒，以固定冷冻切片组织。去除多余液体。
   2. 向已固定的脑干冷冻切片组织上加入含2%牛血清白蛋白（BSA）的磷酸盐缓冲液（PBS），封闭30秒，以阻断抗体的非特异性结合。随后用PBS洗涤一次。
   3. 加入足量的一抗溶液，完全覆盖已固定和封闭的冷冻切片组织。将组织切片在一抗溶液中孵育2分钟。随后用2% BSA溶液洗涤一次。一抗溶液由96% BSA-PBS封闭液、3%一抗和1% RNase抑制剂组成。一抗稀释比例为1:25。
      注意：在本代表性实验中，所用一抗包括抗NeuN抗体和抗Cd11β抗体。神经元进一步分为TH+和TH-亚群，因此用于神经元染色的一抗溶液包含93% BSA-PBS溶液、3%抗NeuN抗体、3%抗酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase）抗体以及1% RNase Out。
   4. 加入足量的二抗溶液（1:200），完全覆盖脑干组织，使组织浸没于二抗溶液中。3分钟后，用2% BSA溶液洗涤一次。
      ​注意：二抗溶液的组成为196.5 µL 2% BSA溶液、1 µL 羊抗小鼠555 nm荧光标记物（用于细胞类型标记）、1 µL 驴抗兔Alexa 488 nm荧光染料（用于TH染色）、2.5 µL RNase抑制剂以及1.3 µL DAPI（1:10000）。

5. 标准乙醇和二甲苯组织脱水流程

1. 将带有染色冷冻切片组织的载玻片放入75%乙醇溶液中浸泡30秒，随后转移至95%乙醇溶液中浸泡30秒，再放入100%乙醇溶液中浸泡30秒，最后放入另一容器中的100%乙醇溶液中浸泡30秒。
2. 完成乙醇脱水步骤后，倒入两份新鲜的100%二甲苯溶液。将载玻片放入第一份二甲苯溶液中1分钟，迅速取出后转移至另一份新鲜二甲苯溶液中浸泡4分钟。
3. 将含有染色并脱水处理的组织冷冻切片的载玻片从二甲苯中取出，置于避光但通风的容器中静置5分钟以进行空气干燥。空气干燥后，将载玻片放入干燥器中继续干燥5分钟，完成最终干燥步骤。

6. 使用激光捕获显微切割（LCM）选择单个细胞

1. 将含有染色、固定和脱水组织冰冻切片的玻片插入激光捕获显微切割（LCM）显微镜的样品架中。利用解剖学标志定位待采集细胞的目标区域（本代表性示例中为孤束核，NTS）。
2. 开启显微镜荧光模式，找到感兴趣的染色细胞类型。确保目标细胞的细胞核位于目标区域内，并且与其他细胞的细胞核相距大于>3 mm。使用LCM软件识别并标记一个细胞（若实验为严格单细胞）或多个细胞（若实验需要汇集单细胞样本[即单细胞尺度]，如本代表性实验所示）以进行采集。
   注意：本代表性实验采用由10个细胞组成的细胞池样本。此举旨在降低样本间的基因表达变异性，并增加所分析的单细胞数量，但该实验仍属于单细胞尺度实验。使用本方法也可完成严格意义上的单细胞实验^20,27。此外，也可选择更大的组织切片²¹。
3. 在选定目标细胞后，使用LCM机械臂将LCM采集帽放置于标记组织冰冻切片上的目标区域。
4. 通过试射校准红外（IR）激光的强度和定位。
   注意：每个样本均需进行此校准步骤。校准应在采集帽上未直接覆盖组织的区域进行，以避免误采集非实验组织。
   1. 为校准强度，调整红外激光脉冲的持续时间、功率和尺寸，使激光仅熔化采集帽的黏合剂至足以捕获单个细胞核的程度，同时确保其强度足以将采集帽熔接到玻片上的冰冻切片。不同采集帽所需的参数值可能不同。
   2. 通过精确定位激光十字线与采集帽熔化位置的一致性来校准激光定位。
5. 通过发射LCM红外激光，使采集帽在目标细胞上方的冰冻切片组织处熔化，从而收集已识别的细胞。使用机械臂将采集帽移至LCM显微镜的质量控制（QC）区域，检查是否仅有目标细胞被从组织切片上提取。若采集帽上存在多余细胞，可使用紫外（UV）激光破坏多余细胞的遗传物质。
6. 使用LCM软件的摄像头记录采集位置的解剖学特异性。拍摄一张细胞被采集后的冰冻切片图像。
7. 参考解剖图谱（本例中为大鼠前脑图谱）确定该组织切片相对于前囟（bregma）的距离，并将此信息记录为Z轴距离²⁸。结合照片信息确定细胞在X轴和/或Y轴平面上的位置，以实现对所选细胞的精确定位。
8. 戴手套操作，从QC区域取下LCM采集帽。随后，将样本提取装置固定到LCM采集帽上。使用移液器向所选细胞中加入5.5 µL裂解缓冲液。此时该混合物称为样本。
   注意：裂解缓冲液由5 µL重悬缓冲液和0.5 µL裂解增强剂组成。
9. 将0.5 mL微量离心管安装到连接于LCM采集帽的样本提取装置上。将整个装置置于75 °C加热板上，使样本和裂解缓冲液一侧更靠近加热表面。加热15分钟。
10. 使用低速离心机以0.01–0.02 x g离心，使样本和裂解缓冲液沉降至0.5 mL微量离心管底部。将样本保存于-80 °C，直至进行微流控qPCR分析。

7. 在微流控 RT-qPCR 平台上运行 qPCR 芯片

1. 为测量单细胞样本的基因表达，按以下步骤进行 mRNA 预扩增。
   注意：本方案不涉及 mRNA 提取，因为样本为单细胞，所含 RNA 量极低（10 pg），在 mRNA 分离步骤中容易丢失。单细胞经裂解后直接进行逆转录，以最大限度减少样本损失。
   1. 通过将每个待检测基因的 mRNA qPCR 引物（正向和反向）加入一个 1.5 mL 微量离心管中，制备引物混合液。确保每种引物的终浓度为 500 nM。本示例实验中使用的引物列于补充表 1¹⁶中。
   2. 将 1 µL 的 5x cDNA 反应混合液加入 96 孔 PCR 板的每一孔中。
   3. 将单细胞样本从 -80 °C 冰箱中取出，在室温下短暂解冻（2–3 分钟）。使用低速离心机以 0.01–0.02 x g 离心 20–30 秒，使样本沉降至管底。将每个单细胞样本各取 5.5 µL 加入 96 孔 PCR 板的不同孔中。
      注意：每孔中加入的样本编号和类型需在开始此步骤前确定。
   4. 此时 96 孔 PCR 板的每一孔均已加入 cDNA 反应混合液和单细胞样本。将该板放入热循环仪中，在 65 °C 激活 1.5 分钟。随后在 4 °C 下以 1,300 x g 高速离心 1 分钟，将 PCR 板置于湿冰上。
   5. 向 PCR 板的每一孔中加入 0.12 µL T4 Gene 32 蛋白、0.73 µL DNA 悬浮缓冲液和 0.15 µL 10x cDNA 合成主混合液。将 PCR 板放入热循环仪中运行以下程序：25 °C 5 分钟，50 °C 30 分钟，55 °C 25 分钟，60 °C 5 分钟，70 °C 10 分钟，最后在 4 °C 保温。
      注意：T4 Gene 32 蛋白（单链 DNA（ssDNA）结合蛋白）是噬菌体 T4 复制和修复所必需的。在本方案的逆转录步骤中使用 T4 Gene 32 蛋白，可提高逆转录的产量和效率，并增加 PCR 产物的得率。
   6. 向 PCR 板的每一孔中加入 7.5 µL Taq 聚合酶主混合液。随后，向每孔中加入 1.5 µL 第 7.1.1 步制备的引物混合液。将 PCR 板放入热循环仪中运行以下线性预扩增程序：95 °C 10 分钟；22 个循环：96 °C 5 秒，60 °C 4 分钟。
   7. 向 PCR 板的每一孔中加入 1.2 µL 外切酶 I、4.2 µL DNA 悬浮缓冲液和 0.6 µL 10x 外切酶 I 反应缓冲液。将 PCR 板放入热循环仪中运行以下程序：37 °C 30 分钟，80 °C 15 分钟。
      注意：外切酶可催化从线性单链 DNA 的 3' 至 5' 方向去除核苷酸。我们使用外切酶进行样本纯化，以去除预扩增后残留的未掺入引物及可能存在的单链 cDNA。
   8. 向 PCR 板的每一孔中加入 54 µL TE 缓冲液。在 4 °C 下以 1,300 x g 高速离心 5 分钟，使内容物沉降至管底。
   9. 若计划继续进行后续步骤，将 PCR 板置于 4 °C 冰箱中冷藏。若预扩增步骤完成与微流控 qPCR 启动之间间隔超过 12 小时，则需用封板膜覆盖 qPCR 板并放入 -20 °C 冰箱中冷冻保存。
2. 按以下步骤制备用于 qPCR 芯片的样本板（新的 96 孔 PCR 板）。
   1. 若第 7.1 步的预扩增 PCR 板曾置于 -20 °C 冰箱中，取出后在室温下解冻 10 分钟。
   2. 在新的 96 孔 PCR 板中，向每孔加入 4.55 µL PCR supermix low rox 和 0.45 µL 20x DNA 结合染料。然后从第 7.1 步制备的 PCR 板中取 3 µL 预扩增样本加入各孔。在 4 °C 下以 1,300 x g 高速离心 5 分钟，使内容物沉降，并将 PCR 样本板置于冰上。
3. 按以下步骤制备用于 qPCR 芯片的检测板（新的 96 孔 PCR 板）。
   1. 在新的 96 孔 PCR 板中，向每孔加入 1.25 µL DNA 悬浮缓冲液和 3.75 µL 2x 检测加载试剂。然后加入对应 qPCR 引物 2.5 µL（10 µM 引物）。在 4 °C 下以 1,300 x g 高速离心 5 分钟，使内容物沉降，并将 PCR 检测板置于冰上。
4. 按以下步骤准备 qPCR 芯片，以便加载至微流控 RT-qPCR 平台。
   注意：qPCR 芯片是一种基于微流控原理的实时 qPCR 平台。该芯片本质上是一个由 96 条样本通道和 96 条 RNA qPCR 引物通道（即检测）组成的矩阵，交叉形成 9,216（96 × 96）个反应腔室。每个腔室中，样本与特定检测组合，进行实时 qPCR 反应。结果以扩增曲线和所用引物的循环阈值（Ct）形式输出。
   1. 向 qPCR 芯片中注入控制线流体以进行引液。将 qPCR 芯片插入微流控混合装置中。选择“引液（136x）”程序并运行。
   2. 程序运行约 45 分钟完成后，取出已引液的 qPCR 芯片。从 PCR 样本板中取 6 µL 反应液，加入 qPCR 芯片对应的样本孔中。
   3. 从 PCR 检测板中取 6 µL 反应液，加入已引液的 qPCR 芯片对应的检测孔中。
      注意：qPCR 芯片的样本孔和检测孔底部可能形成气泡，阻碍溶液进入微流控通道。在将 qPCR 芯片插入微流控混合装置前，可用尖锐针头刺破或去除这些气泡。
   4. 将 qPCR 芯片插入微流控混合装置中。选择“加载混合（136x）”程序并运行。
5. 将 qPCR 芯片加载至微流控 RT-qPCR 平台。
   1. 开启微流控 RT-qPCR 平台，预热光源（约 20 分钟）。从微流控混合装置中取出 qPCR 芯片，撕去芯片底部的保护贴纸。
   2. 打开微流控 RT-qPCR 平台，将 qPCR 芯片装入其中。在微流控 RT-qPCR 平台上运行快速 96 × 96 PCR 程序（30 个循环）。
   3. 启动数据采集软件，点击开始新运行。
   4. 确认芯片条形码和芯片类型，点击下一步。点击芯片运行文件，浏览并选择数据存储位置。
   5. 点击应用类型，选择基因表达；选择ROX作为被动参比，选择单探针，探针类型选择EvaGreen。
   6. 点击选择热循环程序，选择Biomark HD: GE Fast 96x96 PCR+Melt v2.pcl 文件。

8. 数据分析

1. 将qPCR芯片运行的数据上传至分析软件，按如下所述进行质控。
   1. 下载数据分析软件。该软件可在以下网站找到：https://www.fluidigm.com/products-services/software#。 启动软件以分析微流控 RT-qPCR 实验。
   2. 在软件中打开 芯片运行然后，打开实验生成的 ChipRun.bml 文件。将出现一个包含实验详细信息的窗口，包括被动参比、探针以及PCR扩增的温度程序。
      注意：质量控制（QC）和数据分析可以在连接微流控 RT-qPCR 平台的计算机上进行，或通过将 .bml 文件传输至另一台计算机完成 通过 一个U盘或其他方式
2. 按照下述说明定义样品设置。
   注意：此步骤将为质量控制（QC）和数据分析流程创建样本和检测（qPCR 引物）的标记模板。
   1. 选择 芯片探索器 > 样品板设置 并创建一个新的样本板。选择合适的容器类型和容器格式（本代表性实验中使用的96孔板为SBS96格式）。
   2. 根据实验设计将样本标签粘贴到软件电子表格中，并进行选择 地图 从任务菜单中选择 SBS96-Left.dsp样本设置现已映射完成。选择 详细视图 > 分析 以更新文件中的这些更改。
      注意：在此软件中所做的任何更改，除非保存，否则不会被保留 分析 按钮被点击。
3. 在软件中定义对照样本。通过单击并按住鼠标左键，同时拖动以选择对照样本的细胞。按住 Ctrl 键并单击各个细胞，可逐个选择细胞。对于 RNA 标准品样本（梯度稀释系列），输入样本名称及所用的 RNA 浓度。点击 分析 保存。
4. 参照上述第8.2步设置检测器，但使用RT-qPCR检测名称，即被检测基因的名称。选择 检测板设置 并创建一个新的检测板。选择合适的容器类型和规格（96孔板选择SBS96）。根据实验设计粘贴检测名称，然后点击 分析 保存。
5. 按照以下所述开始用户质量控制（QC）流程。
   注意：本代表性实验采用循环阈值（Ct）阈值法。即未达到软件自动设定（Auto Global）或手动设定（User Global）阈值信号的样本将被视为反应失败，不纳入数据集。
   1. 选择 分析视图 > 任务框架在分析设置面板中，将设置更改为自动全局（自动计算应用于整个芯片的阈值）或用户全局。将基线校正设置为线性导数。如果使用用户全局，则必须像在代表性实验中一样手动确定失效阈值。
   2. 本代表性实验采用如下质控规则：若单个检测或样本的失败率≥70%，则该数据集中的整行或整列均判定为不合格。
   3. 手动检查96 × 96芯片中的每个反应。观察扩增曲线和熔解曲线，判断每个反应是否符合预期的qPCR模式。若扩增曲线或熔解曲线与预期不符，则判定该反应失败。
6. 质控完成后，通过选择导出数据 文件 > 导出 并将数据集保存为 .csv 文件。
7. 修剪数据集，因为导出的 .csv 文件同时包含通过-失败矩阵和原始 Ct 值矩阵。使用通过-失败矩阵将数据集中任何失败的单元格替换为 NA。
8. 下载最新版本的开源 R 软件，然后下载 R-Studio 应用程序。将标准化数据集上传至 R。根据研究需求对数据进行分析。
9. 使用 -ΔΔC 法对数据集进行标准化处理_t 方法如下所述。
   注意：可在样本行中使用中位数中心化或看家基因归一化方法，以生成 -ΔC_t 值。在代表性实验中，采用中位数居中法，并通过管家基因标准化进行验证。此操作可通过.csv格式完成，或上传至数据分析软件进行。
   1. 对于中位数中心化，需计算单个样本（10个细胞的混合样本）所有Ct值的中位数Ct值，然后从该中位数中减去每个单独的Ct值。由此得到 -ΔC_t 值
   2. 对于看家基因归一化，计算看家基因的平均表达水平（Actb, Gapdh，以及 Ldha 在代表性实验中，针对每个样本取该值作为基准，用于减去各个Ct值。
   3. 为了计算 -ΔΔC_t 取每个检测列的中位数，该值即为现包含的 -ΔC_t 值。从每个 -ΔC 中减去检测的中位数_t 用于生成 -ΔΔC 的值_t 值
10. 为每个 -ΔΔC 计算 z 值_t 使用 R 中的 scale 函数进行标准化处理，并利用 R 的热图函数或独立软件生成热图。
11. 使用 Pearson 相关函数计算每对基因之间的 Pearson 相关系数。在 R 中使用 melt 函数对数据集进行重塑，以便用于其他功能。 导出这些数据并上传至基因相关性网络分析软件。

结果

在激光显微切割（LCM）操作过程中，通过肉眼观察验证单细胞的采集效果。细胞核在质控（QC）工作站进行评估。可通过特定细胞类型标记的荧光基团发射信号及其整体形态来确定细胞类型。若在帽膜上采集到了非目标细胞，可在质控工作站使用紫外（UV）激光破坏其遗传物质。此外，还需通过分子分析进行进一步验证。在此代表性示例¹⁶中，除小胶质细胞外，还分别选取了两种类型的神经元：酪氨酸羟化酶（Th）阳性（+）和Th阴性（-）神经元。图1D显示，目标为神经元的样本中神经元标志物NeuN的表达水平显著升高，具有统计学意义。同时，小胶质细胞样本中微胶质细胞标志物CD34和Cx3cr1的表达也显著升高，表明样本筛选具有高度准确性。此外，与Th-神经元样本和小胶质细胞样本相比，Th+神经元样本中Th的表达显著升高；而Th-神经元则表现出GCG（编码前胰高血糖素的基因）的显著高表达，提示这些Th-神经元样本富集了以GLP-1作为神经递质的神经元（

讨论

酒精使用障碍仍是一种难以治疗的疾病。本研究团队从系统神经科学的视角出发，通过研究反奖赏过程来应对这一障碍。我们检测了酒精戒断时间序列中单个孤束核（NTS）神经元和小胶质细胞的基因表达变化¹⁶。选择孤束核是因为其在酒精戒断综合征所引起的自主神经功能紊乱中具有重要作用。我们结合激光显微切割（LCM）与单细胞微流控反转录定量PCR技术，能够在低成本条件下以较高的解剖和分子灵敏度及特异性，检测大量样本和基因（图1B-C）。单个细胞通过免疫组化染色进行识别和筛选，并利用分子表达对这些细胞亚表型分组进行了验证（图1D-E）。然而，部分富含GLP-1的神经元样本（TH-神经元）中度表达了Th基因（图4）。细胞表型的确定基于荧光成像的细胞筛选阶段，由于仅依据单个基因Th...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
20X DNA结合染料	Fluidigm	100-7609	NA
2x GE 检测上样试剂	Fluidigm	85000802-R	NA
96.96 动态阵列 IFC 基因表达芯片（文中简称 qPCR 芯片）	Fluidigm	BMK-M-96.96	NA
抗Cd11β 抗体	Genway Biotech	CCEC48	小胶质细胞染色
抗 NeuN 抗体，克隆 A60	EMD Millipore	MAB377	神经元染色
抗酪氨酸羟化酶抗体	abcam	ab112	TH+ 神经元染色
ArcturusXT 激光显微切割系统	Arcturus	NA	NA
Biomark HD	Fluidigm	NA	实时定量 PCR 平台
牛血清抗原	Sigma-Aldrich	B4287
CapSure Macro LCM 帽盖	ThermoFisher Scientific	LCM0211	NA
CellDirect 一步法 qRT-PCR 试剂盒	赛默飞世尔科技	11753500	裂解缓冲液溶液成分
细胞直接重悬 &和裂解缓冲液试剂盒	赛默飞世尔科技	11739010	Invitrogen
DAPI	赛默飞世尔科技	62248	细胞核染色
DNA悬浮缓冲液	TEKnova	T0221
驴抗兔IgG（H+L）ReadyProbe二抗，驴抗兔IgG（H+L）ReadyProbe二抗，Alexa Fluor 488	赛默飞世尔科技	R37118	二抗
外切核酸酶 I	New England BioLabs, Inc.	M0293S	NA
ExtracSure 样本提取装置	赛默飞世尔科技	LCM0208	NA
Fisherbrand™ Superfrost Plus 显微镜载玻片	赛默飞世尔科技	22-037-246	普通载玻片
GeneAmp 超薄壁反应管	赛默飞世尔科技	N8010611
山羊抗小鼠 IgG（H+L），Superclona 重组二抗，Alexa Fluor 555	ThermoFisher Scientific	A28180	二抗
IFC 控制器	Fluidigm	NA	NA
RNaseOut	赛默飞世尔科技	10777019
SsoFast EvaGreen Supermix with Low Rox	Bio-Rad	PN 172-5211	NA
SuperScript VILO cDNA合成试剂盒	赛默飞世尔科技	11754250	包含 VILO 和 SuperScript
T4基因32蛋白	New Englnad BioLabs, Inc.	M0300S	NA
TaqMan PreAmp Master Mix	赛默飞世尔科技	4391128	NA
TE缓冲液	TEKnova	T0225	NA
TempPlate 半裙边 96 孔 PCR 板，0.2 mL	USA Scientific	1402-9700	NA