方法文章

突触膜微移植以重激活人突触受体用于功能研究

DOI：

10.3791/64024

⸱

2022年7月20日

 ,  ,  , 
1The Mitchell Center for Neurodegenerative Diseases, Department of Neurology, University of Texas Medical Branch

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

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该方案表明，通过将突触膜微量移植到Xenopus laevis卵母细胞中，可以记录到α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异噁唑丙酸受体和γ-氨基丁酸受体稳定且可靠的反应。

摘要

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兴奋性和抑制性离子型受体是决定生理神经元通讯过程中突触活动的主要离子通道。因此，在神经退行性疾病和精神障碍中，这些受体的数量、功能及其与其他突触成分关系的改变，已被广泛观察到与脑功能异常和认知障碍密切相关。了解疾病如何影响兴奋性和抑制性突触受体的功能，对于开发有效的治疗策略至关重要。为了获取与疾病相关的信息，重要的是记录在病变人脑中仍保持功能的神经递质受体的电活动。迄今为止，这是评估受体功能病理改变的最接近方法。本文介绍了一种突触膜微移植技术，该方法通过将快速冷冻的人脑组织中含有人源受体的突触膜注射并随后融合到非洲爪蟾（Xenopus laevis）卵母细胞膜中，从而重新激活这些突触膜。本方案还提供了获得α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异噁唑丙酸（AMPA）受体和γ-氨基丁酸（GABA）受体稳定且可靠反应的方法学策略，以及用于数据标准化和严格数据分析的全新详细方法。

引言

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神经退行性疾病影响着很大比例的人群。尽管这些疾病的严重后果已广为人知，但作为脑功能关键因素的神经递质受体功能改变与其临床症状之间的关联仍不清楚。个体间差异、疾病的慢性过程以及症状隐匿性发作，仅仅是导致许多已有明确化学失衡证据的脑部疾病难以被深入理解的部分原因1,2。动物模型提供了宝贵的信息，拓展了我们对进化保守系统中生理与病理生理机制的认识；然而，啮齿类动物与人类之间存在多种物种差异，限制了从动物模型直接推断受体功能至人脑的可行性3。因此，Ricardo Miledi 实验室率先利用手术切除的脑组织和冷冻样本开展了对人源天然受体的初步研究。这些早期实验使用的是包含神经元突触及突触外受体以及非神经元神经递质受体的完整膜结构；尽管它们为疾病状态提供了重要信息，但受体混合的问题可能使数据解释变得复杂4,5,6,7。重要的是，突触是许多神经退行性疾病的主要靶点8,9；因此，检测受影响突触功能特性的实验方法对....

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方案

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所有研究均遵循机构指南，并经加州大学欧文分校机构动物护理和使用委员会（IACUC-1998-1388）及德克萨斯大学医学分部（IACUC-1803024）批准。非阿尔茨海默病（AD）脑组织（女性，74岁，死后间隔2.8小时）和阿尔茨海默病脑组织（女性，74岁，死后间隔4.5小时）由加州大学欧文分校阿尔茨海默病研究中心（UCI-ADRC）提供。脑组织捐献的知情同意书由UCI-ADRC获取。

注意：未固定的脑组织应被视为血液传播病原体（BBP）的来源。因此，在开始实验前需要接受BBP相关培训。本方案在生物安全二级（BSL2）实验室中按照BSL2要求进行。实验室内的指导原则和预防措施包括：禁止在实验室内饮食，必须遵守良好的实验室操作规范，必须佩戴个人防护装备（手套、实验服、不得穿露趾鞋），且实验室门必须始终保持关闭状态。

1. 爪蟾卵母细胞显微注射准备

  1. 制备注射针时，使用微量移液器拉针仪将3.5英寸的硼硅酸盐玻璃管拉制成针。针头拉制完成后，在显微镜下用剃刀片切去针尖适当长度，以便进行显微注射（通常为2–3 mm）。
    注意：需切除的针尖长度可能有所不同。
  2. 通过将200 mL的Barth's储备液（5x）加入800 mL蒸馏水中，配制1x Barth's溶液。用18 °C的1x Barth's溶液填充24孔平底组织培养板。
      ....

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结果

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注射后数小时内，携带神经递质受体和离子通道的突触膜开始与卵母细胞的质膜融合。图1展示了将AMPA受体和GABAA受体微移植到Xenopus卵母细胞中的记录结果。在大多数分析中，每份样本测量来自两只或三只不同青蛙的两到三批卵母细胞，共计每份样本六至九个卵母细胞。该方法用于较大规模的人群队列，以观察组间差异。分析过程简单，主要测量反应的振幅。需要注意的是，移植膜的融合是一个具有极性的过程，因此注射位点的选择至关重要。将样本注射至植物极或赤道区域可获得一致的结果，所有注射的卵母细胞均能成功插入受体，并产生符合单峰分布的离子电流22。有趣的是，当膜最初被注射至动物极时，卵母细胞的反应呈现双峰分布：一部分卵母细胞无反应或反应极弱，而另一部分则表现出强烈反应，甚至强于注射至植物极或赤道区域的卵母细胞。为了确定动物极注射后部分卵母细胞反应较低是否由于人源膜被误注入并滞留在卵母细胞核内，研究人员将从电鳐电器官分离的膜与编码GABAρ1亚基的cDNA混合后，注射至动物极。来自电鳐膜的烟碱型受体在乙酰胆碱灌流时.......

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讨论

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分析人脑中的天然蛋白质复合物，对于理解脑部疾病的稳态与病理过程，并开发预防或治疗疾病的策略至关重要。因此，储存有速冻样本的脑库是大量且尚未充分开发的生理信息的宝贵来源29,30。使用死后组织的一个初步顾虑是，mRNA 或蛋白质可能发生明显降解，从而干扰数据的解释。例如，脑组织的 pH 值与通过定量实时 PCR 检测到的 mRNA 定量结果呈持续正相关，且这种相关性不受病理状态的影响31。个体间 pH 的差异可能导致 mRNA 定量结果出现较大变异，从而影响结果的解释32。有趣的是，尽管随着 pH 降低，mRNA 转录本的定量水平下降，但不同转录本之间的协方差关系仍得以保持33，这为获得可靠的病理状态下转录组谱提供了框架。重要的是，尽管 mRNA 极易降解，但死后组织中的跨膜蛋白却对降解具有很强的抗性34。实验室先前的实验已证明，人脑.......

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披露

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作者声明无利益冲突。

致谢

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本工作由美国国立卫生研究院国家衰老研究所（NIA/NIH）资助，资助项目编号为R01AG070255和R01AG073133，授予AL。我们还要感谢加州大学尔湾分校阿尔茨海默病研究中心（UCI-ADRC）提供本文所示的人体组织。UCI-ADRC由美国国立卫生研究院国家衰老研究所（NIH/NIA）资助，项目编号为P30 AG066519。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
显微注射用
3.5" 玻璃毛细管Drummond3-000-203-G/X
24孔平底组织培养板ThermofisherFB012929
Flaming/Brown型微电极拉制仪SutterP-1000
注射皿Thermofisher08-772B
微量离心管Thermofisher02-682-002
矿物油ThermofisherO121-1
Nanoject IIDrummond3-000-204
尼龙筛网Industrial NettingWN0800
Parafilm封口膜ThermofisherS37440
体视显微镜Fisher Scientific03-000-037
注射器Thermofisher14-841-31
超声波清洗仪ThermofisherFS20D
Xenopus laevis 青蛙Xenopus 14217
双电极电压钳用
15 cm长火焰抛光硼硅酸盐玻璃毛细管SutterB200-116-15
任意PC计算机或笔记本电脑
低通贝塞尔滤波器Warner InstrumentsLPF-8
体视显微镜Fisher Scientific03-000-037
双电极电压钳工作站Warner InstrumentsTEV-700
ValveLink 8.2灌流控制器Automate ScientificSKU:01-18
WInEDR免费软件英国斯特拉斯克莱德大学格拉斯哥分校https://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm
X系列多功能数据采集卡National InstrumentsNI USB-6341
试剂
氯化钙ThermofisherC79
四水合硝酸钙ThermofisherC109
胶原酶Sigma-AldrichC0130
GABASigma-AldrichA2129
HEPES（4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸）ThermofisherBP310
红藻氨酸Tocris0222
七水合硫酸镁ThermofisherM63
氯化钾ThermofisherP217
碳酸氢钠ThermofisherS233
氯化钠ThermofisherS271-1
Ultrafree-0.1 µm MC滤器Amicon

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Furcila, D., Defelipe, J., Alonso-Nanclares, L. A study of amyloid-β and phosphotau in plaques and neurons in the hippocampus of Alzheimer's disease patients. Journal of Alzheimer's Disease. 64 (2), 417-435 (2018).
  2. Varol, E., Sotiras, A., Davatzikos, C.

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重印与许可

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标签

AMPA GABA

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