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方法文章

突触膜微移植以重激活人突触受体用于功能研究

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DOI：

10.3791/64024

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2022年7月20日

 ,  ,  , 
1The Mitchell Center for Neurodegenerative Diseases, Department of Neurology, University of Texas Medical Branch

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

该方案表明，通过将突触膜微量移植到Xenopus laevis卵母细胞中，可以记录到α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异噁唑丙酸受体和γ-氨基丁酸受体稳定且可靠的反应。

摘要

兴奋性和抑制性离子型受体是决定生理神经元通讯过程中突触活动的主要离子通道。因此，在神经退行性疾病和精神障碍中，这些受体的数量、功能及其与其他突触成分关系的改变，已被广泛观察到与脑功能异常和认知障碍密切相关。了解疾病如何影响兴奋性和抑制性突触受体的功能，对于开发有效的治疗策略至关重要。为了获取与疾病相关的信息，重要的是记录在病变人脑中仍保持功能的神经递质受体的电活动。迄今为止，这是评估受体功能病理改变的最接近方法。本文介绍了一种突触膜微移植技术，该方法通过将快速冷冻的人脑组织中含有人源受体的突触膜注射并随后融合到非洲爪蟾（Xenopus laevis）卵母细胞膜中，从而重新激活这些突触膜。本方案还提供了获得α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异噁唑丙酸（AMPA）受体和γ-氨基丁酸（GABA）受体稳定且可靠反应的方法学策略，以及用于数据标准化和严格数据分析的全新详细方法。

引言

神经退行性疾病影响着很大比例的人群。尽管这些疾病的严重后果已广为人知，但作为脑功能关键因素的神经递质受体功能改变与其临床症状之间的关联仍不清楚。个体间差异、疾病的慢性过程以及症状隐匿性发作，仅仅是导致许多已有明确化学失衡证据的脑部疾病难以被深入理解的部分原因1,2。动物模型提供了宝贵的信息，拓展了我们对进化保守系统中生理与病理生理机制的认识；然而，啮齿类动物与人类之间存在多种物种差异，限制了从动物模型直接推断受体功能至人脑的可行性3。因此，Ricardo Miledi 实验室率先利用手术切除的脑组织和冷冻样本开展了对人源天然受体的初步研究。这些早期实验使用的是包含神经元突触及突触外受体以及非神经元神经递质受体的完整膜结构；尽管它们为疾病状态提供了重要信息，但受体混合的问题可能使数据解释变得复杂4,5,6,7。重要的是，突触是许多神经退行性疾病的主要靶点8,9；因此，检测受影响突触功能特性的实验方法对于获取与疾病相关的突触通讯改变信息至关重要。本文介绍了一种对原始方法的改进技术：突触膜微移植（MSM），该方法专注于富集突触蛋白制剂的生理学表征，并已成功应用于大鼠和人源突触体的研究10,11,12,13,14,15。通过该技术，可将原本在人脑中发挥作用、嵌于其天然脂质环境并携带其相关蛋白复合物的突触受体进行移植。此外，由于 MSM 所得数据具有定量性质，因此可用于整合大规模蛋白质组学或测序数据集10。

需要注意的是，许多对突触受体的药理学和生物物理分析都是在重组蛋白上进行的16,17。尽管这种方法有助于更深入地理解受体的结构与功能关系，但它无法提供关于神经元中复杂多亚基受体复合物及其在疾病中变化的信息。因此，结合使用天然受体和重组蛋白将有助于对突触受体进行更全面的分析。

制备突触体的方法有多种10,11,12,13,14,15，可根据实验室的具体需求进行调整。本方案假设已分离获得富含突触体的样品，并可直接用于微移植实验。在本实验室中，采用Syn-Per试剂盒并严格按照生产商说明书进行操作，因其在电生理实验中具有高度可重复性10,11。此外，关于非洲爪蟾（Xenopus）卵母细胞的分离方法已有大量文献报道18,19，也可直接购买已准备就绪、可用于注射的卵母细胞20。

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方案

所有研究均遵循机构指南，并经加州大学欧文分校机构动物护理和使用委员会（IACUC-1998-1388）及德克萨斯大学医学分部（IACUC-1803024）批准。非阿尔茨海默病（AD）脑组织（女性，74岁，死后间隔2.8小时）和阿尔茨海默病脑组织（女性，74岁，死后间隔4.5小时）由加州大学欧文分校阿尔茨海默病研究中心（UCI-ADRC）提供。脑组织捐献的知情同意书由UCI-ADRC获取。

注意：未固定的脑组织应被视为血液传播病原体（BBP）的来源。因此，在开始实验前需要接受BBP相关培训。本方案在生物安全二级（BSL2）实验室中按照BSL2要求进行。实验室内的指导原则和预防措施包括：禁止在实验室内饮食，必须遵守良好的实验室操作规范，必须佩戴个人防护装备（手套、实验服、不得穿露趾鞋），且实验室门必须始终保持关闭状态。

1. 爪蟾卵母细胞显微注射准备

  1. 制备注射针时，使用微量移液器拉针仪将3.5英寸的硼硅酸盐玻璃管拉制成针。针头拉制完成后，在显微镜下用剃刀片切去针尖适当长度，以便进行显微注射（通常为2–3 mm）。
    注意：需切除的针尖长度可能有所不同。
  2. 通过将200 mL的Barth's储备液（5x）加入800 mL蒸馏水中，配制1x Barth's溶液。用18 °C的1x Barth's溶液填充24孔平底组织培养板。
    1. 按以下方法配制5x Barth's储备液：在1 L蒸馏水中加入25.71 g NaCl（氯化钠）、0.372 g KCl（氯化钾）、0.301 g CaCl2 （二氯化钙）、0.389 g Ca(NO3)2(4H2O)（四水合硝酸钙）、1.01 g MgSO4(7H2O)（七水合硫酸镁）、1.008 g NaHCO3 （碳酸氢钠）和11.91 g HEPES（4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸）。
  3. 按照文献18,19所述方法分离Xenopus卵母细胞，并在2倍放大的体视显微镜下挑选外观健康的V–VI期卵母细胞。每孔放置约10个卵母细胞，并使用其中一个孔存放未注射的卵母细胞，作为记录实验中的对照细胞。
  4. 取一个高1 cm、直径6 cm的小型培养皿，在其中放入尼龙网，使其覆盖皿底。然后加入15 mL 1x Barth's溶液，用于卵母细胞的显微注射操作。
  5. 将纳米注射仪置于显微镜平台的中线上。将磁铁开关转至关闭位置，小心支撑注射仪，缓慢将其移动至所需位置。当纳米注射仪定位准确后，将磁铁开关重新转至完全开启位置，并确保其固定牢固。
  6. 若注射体积为50.6 nL，请将纳米注射仪侧面的设置调整如下：1为D（向下），2为D，3为U（向上），4为D，5为U。在显微镜支架上放置一块自密封热塑性材料或微量离心管盖，使其与纳米注射仪的运动轨迹对齐。
    注意：50 nL接近细胞质所能耐受的注射物最大体积21。
  7. 用胰岛素注射器吸取约其体积一半的矿物油（约0.5 mL/cc）。使用该注射器将矿物油注入显微注射针中，确保针尖处可见油滴。
  8. 将纳米注射仪的推杆外露至少1–2 cm。通过按住排空按钮，直至推杆外露至所需长度。推杆外露后，缓慢而小心地将充满矿物油的玻璃显微注射针套在推杆上，确保其顺利穿过黑色阻力气密圈并止于白色限位环处。操作过程中注意避免弯曲推杆。
  9. 当玻璃显微注射针牢固安装到位后，按下排空按钮以排除可能存在的气泡。随后用纸巾轻轻擦去多余的矿物油。

2. 上样

  1. 按照文献10,11,12,13,14,15所述方法，从人脑感兴趣区域制备突触体富集样品，并将样品分装成约 5 μL 的等份，于 -80 °C 保存，直至注射前使用。
  2. 注射前，将分装样品转移至湿冰上，并始终置于冰上保存，仅在超声处理和取样时短暂移出。样品的数量和类型由实验设计决定。
  3. 将选定的样品置于浮有湿冰的水浴中超声处理 3 次，以避免样品升温。每次超声 5 秒，两次之间在湿冰上间隔 1 分钟。
  4. 取 1 μL 样品置于热塑性材料表面。如需要，可在放置样品前对表面进行压痕处理，以防止样品移动。
  5. 使用操纵器上的旋钮调整纳米注射针的位置，将其移向样品以进行吸样。当针尖进入样品后，按住 填充（FILL） 按钮直至吸入足够量的样品。每 10 个卵母细胞约需 0.5 μL 样品。使用旋钮将纳米注射针移回最高位置。

3. 注射卵母细胞

注意：在所有实验中，均将标准化的大鼠皮层突触体膜注入一组卵母细胞，以检测不同批次卵母细胞间融合能力的变化。

  1. 将选定的卵母细胞放置在装有尼龙网和Barth溶液的小培养皿中（约10个卵母细胞）。调整卵母细胞的位置，使其互不重叠，这有助于后续注射操作。
  2. 使用操纵器上的旋钮移动纳米注射器针头，使其靠近卵母细胞。当针头浸入Barth溶液后，踩下纳米注射器的脚踏开关，确认微注射针头正在释放样品。若样品正在释放，则可在显微镜视野中观察到。
  3. 一旦确认样品能够正常释放，即可开始对卵母细胞进行微注射。若样品无法释放，请重复针头填充步骤。
  4. 用针头刺入卵母细胞表面下方，切勿过深，然后踩下脚踏开关注入样品。当样品释放时，脚踏开关会发出蜂鸣声。等待约2–3秒。若注射成功，细胞将出现膨胀。一旦发生膨胀，使用操纵器旋钮将针头退出细胞。
    注意：卵母细胞中的膜融合过程具有极性；因此，应将注射部位选择在细胞的动物极一侧，最好位于赤道上方，并使针头角度朝向动物极，以最大化膜融合效率。
  5. 移动培养皿，使下一个卵母细胞对准针头，重复上述操作，直至培养皿中所有卵母细胞均完成注射。重复此过程，直到达到所需注射数量。确保保留一孔未注射的卵母细胞作为对照。
  6. 完成所有卵母细胞注射后，将纳米注射器退回至初始位置，并取下针头。

使用双电极电压钳记录离子电流

  1. 制备双电极电压钳（TEVC）电极针时，使用显微拉针仪将15 cm长的硼硅酸盐玻璃管拉制成针状，并进行火焰抛光。拉制完成后，使用长毛细管针头填充3 M KCl溶液；或者，将电极针浸入3 M KCl溶液中，在持续真空条件下煮沸15分钟。高温有助于电极填充并去除气泡。
    1. 使用结晶态KCl和去离子水配制3 M KCl电极填充液，并严格按照以下步骤操作，以确保电极参考电位不发生变化。将KCl在烘箱中小心干燥2–3小时。使用分析天平精确称取223.68 g KCl，转移至1 L玻璃瓶中。该溶液用于氯化银电极丝的制备。
      注意：拉制玻璃电极时，可从此处下载移液管食谱： https://www.sutter.com/PDFs/cookbook.pdf。
  2. 开启所有用于记录离子电流的设备：主系统、溶液阀、显微镜光源、阀系统、卵母细胞钳制装置和真空系统。启动台式计算机，登录WinEDR V3.9.1软件，确保程序正常运行，并确认设置参数正确：选择“记录至磁盘”、设定记录时长，并关闭模拟器选项。
    1. 为放大器提供以下初始设置参数：在电压电极（Vm）部分，关闭负电容补偿（-C）；在浴槽电极（Im）部分，将增益选择开关（范围0.1至10）设为10，三档切换开关（x0.1、x1.0和x10）设为x1.0，LED灯将指示增益倍数选择；在钳制部分，关闭钳制模式选择器，将直流增益控制设为IN，全带宽开环增益控制（范围0至2000）设为约1200；在命令设置中，设为40 mV，并将保持控制的负值和量程倍增器设为x2；在电流电极上，插入卵母细胞前使用Ve偏移建立零参考。
    2. 开始记录时，打开WinEDR V3.9.1软件，进入顶部菜单，选择文件 > 打开新文件。创建自己的文件夹并保存文件。
    3. 接着，在主菜单中选择记录 > 记录至磁盘。当两个电极插入卵母细胞后，在VC-8阀控制器中打开Ringer液流，在OC-725C放大器中将钳制模式设为慢速。然后返回WinEDR软件，点击屏幕左上角的记录按钮。
    4. 在屏幕左下角的标记图表中记录初始膜电位，并按Enter键。实验过程中可记录所用药物名称。实验结束后，点击屏幕左上角的停止按钮。
      注意：我们使用WinEDR或WinWCP软件进行TEVC实验，因为这些软件免费且适用于实验需求，但也可使用其他可用软件。
  3. 配制实验所需的所有药物溶液（例如GABA、红藻氨酸），并通过开关测试确认溶液阀工作正常，观察捏阀的位移情况。
  4. 通过将相应溶液倒入连接至管路的注射器接收口来填充管路，并在阀控制器上标记以对应溶液管路。确保溶液流动稳定、无气泡，且真空系统工作正常。
  5. 设置显微镜和记录室区域。将琼脂桥（见下文）放置在记录室后方（远离操作区）的圆形孔中，连接作为接地参考的电极井与记录室。向记录室和接地参考电极井中加入1x Ringer工作液。
    1. 琼脂桥为U形硼硅酸盐管，长约2–3 cm，内含3%琼脂的Ringer溶液。制作方法：截取15 cm长的玻璃管，在明火上弯成U形，使用胰岛素注射器注入热的3%琼脂溶液。填充后的琼脂桥应储存在冰箱中的Ringer溶液中，直至使用。
    2. 配制20x Ringer储备液：在1 L蒸馏水中加入134.4 g NaCl、2.982 g KCl、5.29 g CaCl2、 和23.83 g HEPES（4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸）。配制1x Ringer工作液时，在容量瓶中将200 mL 20x Ringer储备液加入3,800 mL蒸馏水中。
  6. 每次实验前通过电解法制备氯化银电极：将银丝置于3 M KCl溶液中，并将银电极连接至9 V电池的正极。约3分钟后，电极表面沉积一层致密的棕褐色AgCl。将氯化后的银电极丝插入电极套管中。
    注意：接地参考电极和记录用氯化电极为银/氯化银（Ag/AgCl）电极。
  7. 将硼硅酸盐电极针从KCl溶液中取出。使用注射器从电极针开口端吸出少量KCl溶液，并用矿物油替换，以防止水分蒸发和针内KCl浓度变化。将玻璃针滑过氯化银电极丝，并固定到位。
  8. 使用左右操纵器夹持电极，将电极针引导至充满Ringer溶液的记录室中。
  9. 通过归零Vm和Ve偏移旋钮，然后按下电极测试按钮，检查每个电极的电阻。电阻应在0.5–3 MΩ之间（屏幕上直接读数为5–30 mV）。若电阻超出范围，应更换新的微电极。
  10. 用新鲜Ringer溶液填充记录室。使用玻璃移液管将未注射或微移植的卵母细胞置于记录室中央。确保在显微镜下清晰可见卵母细胞，动物极朝上（见步骤3.4中的注释）。
  11. 将电极引导至Ringer溶液中，直至接触卵母细胞膜。在动物极侧（见步骤3.4中的注释）轻轻刺入卵母细胞膜，并记录静息膜电位。开启Ringer溶液流动。
  12. 使用卵母细胞钳制放大器，将模式切换至电压钳，并将保持电压设为-80 mV。监视器上的电流应为负值，通常在0至0.4微安之间。
  13. 创建新文件以保存记录，操作为软件中的文件 > 新建 > 保存记录。开始记录，点击记录 > 记录至磁盘。使用标记框对话框添加相关信息（测试名称、所用药物等）。
  14. 通过打开阀门并将激动剂（如GABA、谷氨酸或红藻氨酸）灌注到记录室中15秒，进行化学刺激。通常使用10x增益以绘制最多数据点并重建反应。若电流非常小，应提高放大倍数或增益，以便评估和观察。务必记录这些调整。
    注意：灌注持续时间取决于实验范式。若主要目标是测量最大振幅，15秒足以使GABA达到峰值或红藻氨酸达到平台期。
  15. 始终监控溶液液位。Ringer溶液在各溶液使用间频繁消耗，需经常补充。记录完成后，将电压钳切换至关闭位置，并关闭Ringer溶液阀门。取出卵母细胞，停止记录并保存文件。对所有注射的卵母细胞重复上述步骤。

5. 分析双电极电压钳记录

  1. 将 recordings 的副本保存至 U 盘。随后，打开需要分析的文件。在打开的文件中，可查看、标记和测量记录数据。最常见的分析包括测量最大振幅、激活时间、脱敏以及重复给药引起的反应衰减。
  2. 测量 AMPA 的最大反应和 GABA 的峰值反应。为获得这些测量值，首先需通过光标找到红线，并将其拖动至任氏液（Ringer）应用所产生的电流或基线位置，以设定零电平或基线。
  3. 设定零电平后，使用鼠标将绿色的垂直读数光标拖动至图谱轨迹中所需的位置，以确定反应的测量值。如有需要，可将轨迹导出至其他偏好的软件进行分析
    注意：若无法定义零电平，或轨迹显示噪声过大，可将 WinEDR 文件导出至离线分析软件，以便进行调整以获得平稳基线，并添加滤波器以降低噪声。

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结果

注射后数小时内，携带神经递质受体和离子通道的突触膜开始与卵母细胞的质膜融合。图1展示了微移植到Xenopus卵母细胞中的AMPA受体和GABAA受体的记录结果。在大多数分析中，每个样本测量来自两只或三只不同青蛙的两到三批卵母细胞，共计每样本六至九个卵母细胞。这一方法用于较大规模的人类受试者队列，以观察组间差异。分析过程直接，主要测量反应的振幅。需要注意的是，移植膜的融合是一个具有极性的过程，因此注射位点的选择至关重要。将样本注射至植物极或赤道区域可获得一致的结果，所有注射的卵母细胞均能成功插入受体，并产生呈单峰分布的离子电流22。有趣的是，当膜最初被注射至动物极时，卵母细胞的反应呈双峰分布：一部分卵母细胞无反应或反应极低，而另一部分则表现出强烈反应，甚至强于注射至植物极或赤道区域的卵母细胞。为了确定动物极注射后部分卵母细胞反应较低是否由于人源膜被误注入并滞留在卵母细胞核内，研究人员将从电鳐电器官中分离的膜与编码GABAρ1亚基的cDNA混合后注射至动物极。来自电鳐膜的烟碱型受体在乙酰胆碱灌注...

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讨论

分析人脑中的天然蛋白质复合物，对于理解脑部疾病的稳态与病理过程，并开发预防或治疗疾病的策略至关重要。因此，储存有速冻样本的脑库是大量且尚未充分开发的生理信息的宝贵来源29,30。使用死后组织的一个初步顾虑是，mRNA 或蛋白质可能发生明显降解，从而干扰数据的解释。例如，脑组织的 pH 值与通过定量实时 PCR 检测到的 mRNA 定量结果呈持续正相关，且这种相关性不受病理状态的影响31。个体间 pH 的差异可能导致 mRNA 定量结果出现较大变异，从而影响结果的解释32。有趣的是，尽管随着 pH 降低，mRNA 转录本的定量水平下降，但不同转录本之间的协方差关系仍得以保持33，这为获得可靠的病理状态下转录组谱提供了框架。重要的是，尽管 mRNA 极易降解，但死后组织中的跨膜蛋白却对降解具有很强的抗性34。实验室先前的实验已证明，人脑...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作由美国国立卫生研究院国家衰老研究所（NIA/NIH）资助，资助项目编号为R01AG070255和R01AG073133，授予AL。我们还要感谢加州大学尔湾分校阿尔茨海默病研究中心（UCI-ADRC）提供本文所示的人体组织。UCI-ADRC由美国国立卫生研究院国家衰老研究所（NIH/NIA）资助，项目编号为P30 AG066519。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
显微注射用
3.5" 玻璃毛细管Drummond3-000-203-G/X
24孔平底组织培养板ThermofisherFB012929
Flaming/Brown型微电极拉制仪SutterP-1000
注射皿Thermofisher08-772B
微量离心管Thermofisher02-682-002
矿物油ThermofisherO121-1
Nanoject IIDrummond3-000-204
尼龙筛网Industrial NettingWN0800
Parafilm封口膜ThermofisherS37440
体视显微镜Fisher Scientific03-000-037
注射器Thermofisher14-841-31
超声波清洗仪ThermofisherFS20D
Xenopus laevis 青蛙Xenopus 14217
双电极电压钳用
15 cm长火焰抛光硼硅酸盐玻璃毛细管SutterB200-116-15
任意PC计算机或笔记本电脑
低通贝塞尔滤波器Warner InstrumentsLPF-8
体视显微镜Fisher Scientific03-000-037
双电极电压钳工作站Warner InstrumentsTEV-700
ValveLink 8.2灌流控制器Automate ScientificSKU:01-18
WInEDR免费软件英国斯特拉斯克莱德大学格拉斯哥分校https://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm
X系列多功能数据采集卡National InstrumentsNI USB-6341
试剂
氯化钙ThermofisherC79
四水合硝酸钙ThermofisherC109
胶原酶Sigma-AldrichC0130
GABASigma-AldrichA2129
HEPES（4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸）ThermofisherBP310
红藻氨酸Tocris0222
七水合硫酸镁ThermofisherM63
氯化钾ThermofisherP217
碳酸氢钠ThermofisherS233
氯化钠ThermofisherS271-1
Ultrafree-0.1 µm MC滤器Amicon

参考文献

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