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方法文章

体外 在巨大单层囊泡内重建肌动蛋白细胞骨架

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DOI：

10.3791/64026

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2022年8月25日

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Yale University, 2Systems Biology Institute, Yale University, 3Department of Physics, Yale University

本文内容

摘要

在本文中，我们展示了将F-肌动蛋白细胞骨架包封进巨大单层脂质囊泡（也称为脂质体）的实验技术，以及在脂质体膜内小叶形成模拟细胞皮层的F-肌动蛋白层的方法。

摘要

细胞骨架中的肌动蛋白是细胞内主要的力学结构，介导多种关键的物理细胞活动，包括细胞形变、分裂、迁移和黏附。然而，研究肌动蛋白网络的动力学特性与结构仍面临挑战。 体内 由于活细胞内存在复杂的生化与遗传调控，研究受到限制。为了构建一个不含细胞内生化调控的简约模型，可将肌动蛋白封装于巨型单层囊泡（GUVs，亦称脂质体）内部。这种仿生脂质体具有与细胞相当的尺寸，有助于定量揭示细胞骨架网络的力学与动态特性，为自下而上的合成生物学提供了一条可行路径。为制备用于封装的脂质体，采用倒置乳液法（亦称乳液转移法），该方法是将复杂溶液封装入脂质体以构建多种仿细胞体系中最成功的技术之一。在此方法中，将目标蛋白混合物加入内层缓冲液，随后在含磷脂的矿物油溶液中乳化，形成单层脂质液滴。目标脂质体由单层脂质液滴穿过脂质/油-水界面而生成。该方法可实现将高浓度肌动蛋白聚合物封装入含有特定脂质成分的脂质体中，为后续研究奠定了基础 体外 仿生细胞骨架网络的重建

引言

肌动蛋白细胞骨架通过协调分子水平的收缩性和力的产生，在构建细胞内结构中发挥着基础性作用1,2,3因此，它介导多种重要的细胞活动，包括细胞形变4,5，分裂6迁移7,8以及黏附9。该 体外 近年来，肌动蛋白网络的重建受到了广泛关注10,11,12,13,14,15,16,17重建的目的是构建一种不含活细胞内复杂生化调控的细胞最小模型。这提供了一个可控的环境，用于探究特定的细胞内活动，并有助于肌动蛋白细胞骨架不同组分的鉴定与分析。18,19此外，包封的 体外 在磷脂 giant unilamellar vesicles（GUVs，脂质体）内部构建的肌动蛋白网络提供了一个具有半透性边界、受限但可变形的空间，可模拟细胞内肌动蛋白系统所处的生理与力学微环境9,20,21,22.

在制备脂质体的多种方法中，脂质膜水化法（也称为溶胀法）是最先开发的技术之一23。干燥的脂质膜在加入缓冲液后发生水化，形成膜状气泡，最终转变为囊泡24。为了获得更高产率的大尺寸囊泡，由薄膜水化法发展而来的电形成法25通过施加交流电场，可有效促进水化过程26。然而，这些基于水化的方法在肌动蛋白包封方面的主要局限性在于：对高浓度蛋白质的包封效率较低，且仅适用于特定的脂质组成24。相比之下，倒相乳液技术对脂质组分和蛋白质浓度的限制更少20,27,28,29。该方法中，将待包封的蛋白质混合物加入内层水相缓冲液，随后在含脂质的矿物油溶液中乳化，形成单层脂质包覆的液滴。这些单层脂质液滴通过离心穿过另一层脂质/油-水界面，进而形成双层脂质囊泡（脂质体）。该技术已被证明是实现肌动蛋白包封最成功的方法之一24,30。此外，还有一些微流控装置方法，包括脉冲喷射31,32、瞬时膜喷射33以及cDICE方法34。倒相乳液法与微流控法的相似之处在于均使用了脂质溶剂（油）以及引入脂质/油-水界面以形成脂质体的外层脂质单层。相比之下，微流控法生成脂质体需要搭建微流控装置，且在双层膜的两层之间会残留油相，因此需要额外的步骤去除油相35。

在本研究中，我们采用倒置乳化法来制备脂质体，其中封装了聚合的F-肌动蛋白网络，该方法此前已有应用22。用于封装的蛋白质混合物首先置于非聚合条件的缓冲液中，以维持肌动蛋白处于球状（G型）形式。整个操作过程在4 °C下进行，以防止肌动蛋白过早聚合，随后通过将样品升至室温来触发聚合反应。一旦达到室温，肌动蛋白即聚合为丝状（F型）结构。可在内层水相缓冲液中加入多种肌动蛋白结合蛋白，以研究这些蛋白的功能与特性，从而进一步揭示其与肌动蛋白网络及膜表面的相互作用。该方法也可用于封装其他多种目标蛋白质36 以及尺寸接近最终脂质体的较大物体（如微粒、自驱动微泳动体等）28,37。

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方案

1. 缓冲液和蛋白质溶液的制备

  1. 通过混合0.1 mM CaCl2、10 mM HEPES（pH 7.5）、1 mM DTT、0.5 mM Dabco、320 mM 蔗糖和0.2 mM ATP，配制总体积为5 mL的水相内非聚合（INP）缓冲液。
  2. 在4 °C条件下，将以下蛋白加入INP缓冲液中，配制蛋白混合物（PM）：11.2 µM非荧光性G-肌动蛋白、2.8 µM荧光标记肌动蛋白和0.24 µM Arp2/3（材料表）。为形成F-肌动蛋白层，向PM中加入100 nM凝溶胶蛋白、4 µM周期蛋白和2.2 µM VCA-His。作为对照实验，用100 µg/mL荧光染料替代PM（材料表）。
  3. 通过混合100 mM KCl、4 mM MgCl2、10 mM HEPES（pH 7.5）、1 mM DTT、0.5 mM Dabco、10 mM ATP和80 mM蔗糖，配制总体积为5 mL的水相内聚合（IP）缓冲液（水相）。
  4. 将含PM的INP缓冲液与IP缓冲液按1:1体积比混合，配制终缓冲液（FB），得到总体积为30 µL的内水相溶液，该溶液将被包裹在脂质体内部。
  5. 通过混合10 mM HEPES（pH 7.5）、50 mM KCl、2 mM MgCl2、0.2 mM CaCl2、2 mM ATP、1 mM DTT、0.5 mM Dabco、212 mM葡萄糖和0.1 mg/mL β-酪蛋白，配制总体积为150 µL的水相外缓冲液（OB）。
    注：可通过葡萄糖调节OB的渗透压，确保其渗透压略高于FB（20–60 mOsm）。FB的密度应略高于OB。

基于倒置乳液技术的脂质体的制备

  1. 制备脂质-油混合物
    1. 将 100 µL 浓度为 25 mg/mL 的 L-α-磷脂酰胆碱（非荧光卵磷脂，也称为 EPC，包含 1% DHPE）加入玻璃小瓶中。用氩气吹干氯仿，使瓶底形成干燥的脂质薄膜（2.5 mg）。
      1. 若需形成 F-肌动蛋白层，在蒸发氯仿前，按 EPC 与 DOGS-NTA-Ni 的 10:1 比例加入 1,2-二油酰基-sn-甘油-3-{[n(5-氨基-1-羧基戊基)亚氨二乙酸]琥珀酰}镍盐（DOGS-NTA-Ni），并充分混合。
    2. 加入 2 mL 矿物油，并在室温下将脂质-油混合物置于水浴中超声处理 1 小时，以重新悬浮脂质。
      注意：超声处理后的脂质-油混合物可在 4 °C 下保存 1 周。使用前建议重新超声处理。
  2. 制备含目标蛋白的单层脂滴所需的油中终缓冲液（FB/oil）乳剂。
    1. 取 100 µL 脂质-油混合物置于塑料管中，加入 10 µL FB。确保 FB 形成单一液滴。
    2. 使用玻璃注射器吸取脂质-油-FB 混合物，轻柔地反复抽吸以乳化；先吸取少量脂质-油混合物，然后将注射器尖端置于 FB 液滴边缘，将其打碎成微小液滴。重复上下抽吸，直至形成乳白色且浑浊的乳剂。
  3. 在另一塑料管中加入 30 µL OB。将 30 µL 脂质-油混合物小心加至 OB 上层，静置约 10 分钟，使界面处形成脂质单层。
    注意：若脂质带电或已掺入蛋白，此步骤时间应适当延长38。
  4. 制备脂质体
    1. 小心地将 50 µL FB/oil 乳剂（步骤 2.2）加至步骤 2.3 所得试管的上层油相中。
    2. 将塑料管在 4 °C 下以 100 × g 离心 15 分钟。可通过调整离心时间和速度优化脂质体形成。
      注意：离心后，上层油相应为澄清，下层 OB（含脂质体）应略显浑浊。
    3. 用移液器小心移除油相。如有需要，可吸除额外体积。注意移液器尖端不要接触管壁，以免在脂质体相上方形成油的弯月面。
    4. 使用新的移液器，缓慢将移液器尖端插入剩余的下层相中，吸取水相体积以收集脂质体。
      注意：宁可损失部分体积，也不可混入油相。油相的混入会导致脂质体破裂，内部组分将释放至外部缓冲液中。可剪切移液器尖端以降低剪切力。

3. 显微镜观察

  1. 将 100 µL OB 加入孵育室（含 12 mm 圆形盖玻片的 4 孔板）的孔中。轻柔地将收集的脂质体（步骤 2.4.4）加入 OB 中，然后在孵育室上方再放置一片盖玻片。
    注意：OB 含有 β-酪蛋白，用于钝化玻璃表面，以最大限度减少脂质体之间的黏附20。
  2. 使用 63 倍油浸物镜在共聚焦显微镜下观察脂质体。分别使用 488 nm、647 nm 和 561 nm 激光线观察荧光标记的脂质、包封的荧光染料以及包封的荧光标记肌动蛋白。捕获感兴趣的图像帧，并以 TIFF 格式保存图像。
  3. 在 ImageJ/Fiji39 中处理和分析图像。对于 ImageJ/Fiji 的新用户，可使用在线教程（见 材料表）。
    1. 使用 ImageJ/Fiji 软件打开 TIFF 文件。
    2. 进入 图像 > 调整 > 亮度/对比度。通过调整 最小值 和 最大值 设置以及 亮度 和 对比度 滑块，将图像的亮度和对比度调整至所需范围。
    3. 点击工具栏中的 矩形 选择工具，选择感兴趣区域（ROI）。进入 图像 > 裁剪 以裁剪该 ROI 区域。
    4. 进入 分析 > 设置尺度。在弹出窗口中，于 像素纵横比 字段输入 1.0 ，并将 μm 设为 长度单位。在 像素距离 字段中输入图像的像素宽度，在 已知距离 字段中输入图像实际宽度（单位为微米）。
    5. 为测量脂质体大小，使用工具栏中的 椭圆 选择工具，沿脂质体边缘绘制一个圆形。进入 分析 > 测量 以测量该圆形的面积，进而计算脂质体的直径。

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结果

基于倒相乳液技术制备脂质体的过程在图1中以图示和示意图形式展示。

首先，制备由磷脂（EPC）和荧光脂质（DHPE）组成的空（裸）脂质体（直径约5-50 µm）。作为对照实验，将一种明亮的远红荧光染料封装于裸脂质体内部。通过观察乳液中掺入荧光染料的单层脂质滴，可判断液滴周围是否成功形成脂质单层，如图2A所示。通过共聚焦显微镜在488 nm激光下观察到细环状的绿色荧光脂质双层（脂质与DHPE的结合物），即可验证脂质体的成功生成（图2A，最右侧面板）。为确认荧光染料的封装情况，应在647 nm激光下观察到脂质体内部环境呈现均匀荧光（图2A；叠加图像），这是由于含有远红荧光染料所致（材料表）。

单层脂质滴内不同形式的包封肌动蛋白如

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讨论

在制备过程中，多个关键步骤决定了脂质体高产率的成功。为了使脂质膜完全溶解于油相中，必须对样品进行超声处理，直至玻璃小瓶底部的脂质膜完全消失。超声处理后，脂质-油混合物需在室温避光条件下静置过夜，以使脂质分子进一步分散29。该混合物可在4 °C下保存长达一周。在制备含有目标蛋白的单层脂质滴的FB/油乳液时，必须通过玻璃注射器缓慢反复抽吸脂质-油-FB混合物，以避免引入气泡。在此过程中，经过多次重复操作，注射器尖端的一个大液滴被剪切为许多更小的液滴（直径约5–100 µm）。该过程完成后，混合物应呈现乳白色30。为检测磷脂的质量以及含FB的液滴外围是否成功形成单层脂质膜，可在乳液中观察掺入荧光染料的单层脂质滴，如图2A所示。为确保单层脂质滴在离心过程中能顺利穿过OB/油界面，并使收集到的脂质体在玻璃表面沉降，FB的密度应略高于OB。因此，选择蔗糖和葡萄糖分别作为内水相（FB）和外水相（OB）的主要成分。在先前的研究中，曾使用葡聚糖调节内水相的密度20<...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

我们感谢以下资助：ARO MURI W911NF-14-1-0403 项目对 M.P.M. 的支持，美国国立卫生研究院（NIH）R01 1R01GM126256 项目对 M.P.M. 的支持，美国国立卫生研究院（NIH）U54 CA209992、NIH RO1 GM126256、NIH U54 CA209992 项目，密歇根大学/基因泰克（University of Michigan / Genentech）SUBK00016255 项目，以及人类前沿科学计划（Human Frontiers Science Program, HFSP）RGY0073/2018 号资助项目对 M.P.M. 的支持。本文所表达的任何观点、发现、结论或建议均为作者（们）的观点，不一定反映 ARO、NIH 或 HFSP 的立场。S.C. 感谢与 V. Yadav、C. Muresan 和 S. Amiri 的有益讨论。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1,2-二油酰基-sn-甘油-3-{[n(5-氨基-1-羧基戊基)亚氨基二乙酸]琥珀酰} 镍盐 (DOGS-NTA-Ni) Avanti Polar Lipids Inc.231615773镍脂质
1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷SigmaD27802-25GDABCO
肌动蛋白（>99% 纯度）：兔骨骼肌来源Cytoskeleton, IncAKL99-D非荧光性G-肌动蛋白
肌动蛋白（罗丹明标记）：兔骨骼肌来源Cytoskeleton, IncAR05荧光标记肌动蛋白
腺苷-5′-三磷酸二钠盐水合物SigmaA2383-10GATP
Alexa Fluor 647 染料ThermoFisher荧光染料
Andor iQ3Andor Technologies共聚焦显微镜控制与图像采集软件
Arp2/3 蛋白复合物：猪脑来源Cytoskeleton, IncRP01P-AArp 2/3
氯化钙二水合物Sigma10035048CaCl2
Chamlide 培养皿（4孔，适配12 mm圆形盖玻片）Quorum Technologies孵育腔室
丝切蛋白：人重组来源Cytoskeleton, IncCF01-C丝切蛋白
共聚焦显微镜（63×油浸物镜）Andor TechnologiesLEICA DMi8
D-(+)-葡萄糖 BIOXTRASigmaG7528葡萄糖
二硫苏糖醇DOT Scientific DSD11000-10DTT
凝溶胶蛋白：人重组来源Cytoskeleton, IncHPG6凝溶胶蛋白
Hamilton 1750 气密式注射器，500 µL，固定针头，22 G，2" 锥形尖端Cole-ParmerUX-07940-53玻璃注射器
HEPESAmericanBio7365-45-9
ImageJ/Fijihttps://imagej.net/tutorials/
L-α-磷脂酰胆碱Avanti Polar Lipids Inc.97281442EPC
氯化镁Sigma7786303MgCl2
矿物油，BioReagent，分子生物学用，轻质油Sigma8042475矿物油
N-WASP 片段 WWA（aa400–501，VCA-His）VCA-His 采用实验室方案纯化。可根据合理请求提供该方案
俄勒冈绿 488 1,2-二十六烷酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺（Oregon Green 488 DHPE）Thermo FisherO12650DHPE
氯化钾Sigma7447407KCl
蔗糖Sigma57-50-1蔗糖
β-酪蛋白（牛乳来源）SigmaC6905-250MG

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