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方法文章

利用单条线虫数据量化异质性 秀丽隐杆线虫- 细菌相互作用

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DOI：

10.3791/64027

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2022年7月22日

 ,  , 
1Department of Biology, Emory University, 2Department of Physics, Emory University

本文内容

摘要

本方案描述了一种在低温麻痹和表面漂白 以去除外部细菌后，对单个细菌定植的Caenorhabditis elegans进行96孔板裂解的方法。所得悬液接种于琼脂平板上，可实现对大量个体线虫中细菌载量的准确、中等通量定量分析。

摘要

线虫Caenorhabditis elegans是研究宿主与微生物及宿主与微生物组相互作用的模式系统。迄今为止，许多研究采用批量消化而非单条线虫样本的方法来定量该生物体内的细菌载量。本文认为，C. elegans肠道中细菌定植所表现出的个体间高度变异性具有重要信息价值，而批量消化方法会丢失对不同条件下准确比较至关重要的信息。由于描述这些样本内在变异需要大量个体，本文建立了一种便捷的96孔板操作流程，用于单条线虫的裂解及菌落平板培养。

引言

宿主与微生物关联的异质性普遍存在，个体间的变异正日益被视为影响种群水平过程（从竞争与共存1到疾病传播2,3,4）的重要因素。在 C. elegans中，同基因型种群内反复观察到"隐性异质性"现象，表现为不同亚群个体在热激反应5,6、衰老和寿命7,8,9,10,11以及生理和发育的许多其他方面表现出明显不同的表型12。大多数试图识别亚群结构的分析均提供了实验证据，表明在同基因型、同步发育的线虫实验种群中存在两个亚群5,7,8，尽管其他数据提示种群内性状可能呈连续分布而非离散分组7,12,13。与此相关的是，即使在由共同微生物来源定植的同基因型线虫种群内部，其肠道微生物数量也表现出显著异质性13,14,15,16，而这种异质性可能被广泛用于线虫体内细菌定量的批量消化检测方法所掩盖17,18,19,20。

本研究提供的数据表明，在宿主-微生物互作研究中应更加依赖单条线虫的测量方法，同时本文还提供了提高单条线虫破碎准确性和通量的操作方案。这些方案旨在通过机械破碎大量单个 C. elegans 来定量可存活的细菌载量，相比使用研杵对单条线虫进行破碎的方法，本方案具有更高的重复性和更低的单位样本操作强度。方案中包含推荐的肠道清除步骤：在线虫破碎前使其摄食经热灭活的 E. coli，以尽量减少近期摄入及其他短暂性（非黏附性）细菌的干扰。本方案还包括一种冷诱导麻痹法，结合低浓度表面漂白处理以清洁线虫角质层；表面漂白既可作为单条线虫破碎前的预处理步骤，也可用于制备活体且体表无菌的线虫。该表面漂白方法足以去除多种体表微生物，而冷处理则可替代传统的左旋咪唑（levamisole）诱导麻痹；尽管在对低温敏感的实验中仍优先使用左旋咪唑，但冷麻痹法可减少有害废弃物的产生，并使线虫在处理后迅速恢复正常的活动能力。虽然完整方案描述的是用已知细菌定植线虫的实验室实验，但其中的线虫清洗和单条线虫破碎步骤也可直接应用于从野外样本中分离的线虫或在微宇宙实验中定植的线虫。本文所述方案可从线虫肠道中提取出活菌，适用于对单条线虫进行平板培养并定量菌落形成单位（CFUs）；若需进行基于测序的肠道菌群分析，则应在本方案基础上增加细胞裂解和核酸提取步骤。

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方案

本实验所用线虫来自由美国国立卫生研究院研究基础设施项目（P40 OD010440）资助的秀丽隐杆线虫遗传中心。Bristol N2为野生型。使用DAF-2/IGF突变体daf-16(mu86) I（CGC CF1038）和daf-2(e1370) III（CGC CB1370） 来展示肠道细菌载量的差异。

携带 pos-1 RNAi 载体的 HT115(DE3) E. coli 菌株来自 Ahringer 文库21。秀丽隐杆线虫（C. elegans）天然肠道菌群的 MYb 菌株集合由 Schulenburg 实验室提供22。鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella enterica）LT2（ATCC 700720）attB:GFP-KmR）由本实验室保存23。沼泽假单胞菌（Pseudomonas mosselii）由本实验室分离获得。 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）MSSA Newman pTRKH3-mGFP 由埃默里大学（Emory University）LaRock 实验室提供。

所有线虫缓冲液和培养基均根据先前发表的文献24进行配制，并稍作修改（见补充文件1）。

1. 同步无菌的制备 秀丽隐杆线虫

注意：本节详细描述了如何获得同步化的、生殖能力丧失的成虫群体。此处通过在 pos-1 RNAi 平板上喂养来阻断后代的产生，因为该干扰具有胚胎致死效应；在 pos-1 RNAi 条件下从 L1 幼虫发育至成虫的个体可成为产卵的雌雄同体，但其产下的卵无法存活25。RNAi 喂养实验的操作流程参见 Wormbook26 中的"反向遗传学"章节。

  1. 在同步线虫之前，确保准备好新鲜的 10 cm NGM + pos-1 RNAi 平板可获取。平板可使用浓缩的诱导液态培养物（含氨苄青霉素和异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）新鲜制备，或在含 100 µg/mL 氨苄青霉素和 1 mM 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的 NGM 平板上均匀涂布细菌作为菌苔，于 25 °C 黑暗条件下培养 1 天后使用27.
    注意：RNAi 平板上通常使用羧苄青霉素（25 µg/mL）代替氨苄青霉素。氨苄青霉素成本较低，但稳定性较差；若使用氨苄青霉素，平板干燥后应立即涂布菌液并尽快使用（可短期储存于4℃避光保存，但不建议超过一周）。 <4 °C 下 1 周27此处推荐的高抗生素浓度有助于确保充分的筛选效果。
  2. 从多个（通常为两到四个）含有大量怀卵雌雄同体线虫的NGM平板开始，使用次氯酸钠-氢氧化钠（bleach-NaOH）同步法分离卵24.
    1. 用 2 mL 无菌 ddH₂O 从琼脂平板上冲洗线虫2每块培养板对应一个离心管。将液体均匀分装至1.5 mL微量离心管中（每块培养板或每批雌雄同体样本对应一管）。
    2. 在台式小型离心机中离心约 5 秒（2,000 x g用移液器吸去上清液并弃去。
    3. 用1 mL无菌ddH₂O洗涤2O；同前离心，弃上清。
    4. 重复上一步骤，以减少残留的细菌碎片。
    5. 将每管内容物重悬于1 mL无菌ddH₂O中2O. 向每根试管中加入130 µL市售漂白剂（8.25%次氯酸钠）和130 µL 5 N氢氧化钠（NaOH，终浓度0.5 N）。
    6. 每2分钟将离心管剧烈涡旋振荡至少10-15秒，直至成虫体完全破碎。漂白-NaOH处理时间不得超过5分钟，以免杀死卵。
    7. 在微型离心机中以2,000 x g离心30-60秒 g 离心收集卵子。用移液器吸除上清液并弃去。沉淀物可能可见，也可能不可见，此现象正常。
    8. 加入1 mL M9线虫缓冲液，以2000 x g离心30-60秒 g弃去上清液。
    9. 重复漂洗步骤（1.2.8）5次，以彻底去除次氯酸钠-氢氧化钠混合液，每次尽量移除上清液，但不要扰动卵沉淀。
    10. 将卵转移至含有10 mL M9线虫缓冲液的50 mL锥形管或带盖的30 mL培养管中。若使用锥形管，需将管盖略微松开，并用少量胶带固定以确保安全。在25 °C、200 RPM条件下振荡培养过夜（16 h），以使幼虫孵化。
  3. 将同步化的L1幼虫转移至RNAi平板，使其生长至成虫阶段。
    1. 向每支L1管中加入2 mL无菌M9缓冲液 + 0.01% Triton X-100（以下简称M9TX-01），并将全部体积（12 mL）转移至一支15 mL螺口锥形管中。
    2. 将含有L1幼虫的15 mL离心管置于4 °C环境中10分钟，以减缓幼虫运动。
    3. 在大型台式离心机中离心15 mL圆锥管（1,500 x g 4 °C 下离心 3 分钟；加速度和减速度不应超过最大值的 80%。
    4. 小心吸取上清液，避免扰动L1沉淀。弃去上清液。
    5. 向每支试管中加入 12 mL 冷的 M9TX-01。重复离心。小心吸出并弃去上清液，每支试管中应剩余约 200 µL。
    6. 用200 µL枪头在M9TX-01中润洗，以防止线虫粘附在塑料表面，然后用此枪头重悬线虫沉淀。将重悬的线虫转移至已准备好的 pos-1 通过将液滴加到细菌菌苔上进行点板。
    7. 将培养板置于25 °C培养至成虫第一天。
      注意：如果在培养线虫时 pos-1 RNAi 平板，线虫必须摄食 随意摄取 在RNAi细菌上培养线虫，直至其完全发育为成虫，以确保胚胎致死表型具有高外显率。在24小时和48小时检查培养板。若培养板显示食物耗尽或接近耗尽，需将线虫转移至新的培养板以完成生长，达到完全成熟的成虫大小。为避免线虫未成熟前培养板即被耗尽，每个10 cm RNAi培养板建议接种250–500条L1期幼虫。
  4. 收获成虫并清除肠道 E. coli 以制备无菌线虫。
    1. 用每板5 mL的M9TX-01从平板中冲洗成虫。将缓冲液和成虫转移至15 mL锥形管中，静置使成虫沉降至管底。
    2. 用10 mL新鲜的M9TX-01缓冲液反复冲洗成虫，直至无可见的细菌浑浊（通常1–2次）。可将离心管在700 × g下离心 g 30秒以沉淀线虫，或让成虫依靠重力自然沉降。
    3. 用10 mL M9TX-01再进行一次洗涤，以减少外部细菌。
    4. 将线虫转移至含有5 mL S培养基加2倍浓度灭活的50 mL锥形管或30 mL培养管中 E. coli OP50（约 5 × 109 杀死的细胞/mL）+ 200 µg/mL 卡那霉素 + 50 µg/mL 氯霉素。若使用锥形管，将管盖略微松开，并用少量胶带固定以确保安全。使用玻璃移液管，或用 M9TX-01 冲洗塑料移液管，以防止线虫粘附。
    5. 在25 °C、200 rpm振荡条件下培养成虫24–48 h，以获得无菌成虫。
      注意：如果线虫需要继续留在抗生素中 >24小时后，可能需要添加更多灭活的OP50，以确保线虫有充足的食物来源。在24小时检查试管，若观察到浑浊度明显降低，则补充灭活的OP50。
  5. 根据《线虫手册》（Wormbook）方案用蔗糖洗涤成虫24 以获得洁净、生殖无菌且同步化的仅成虫种群用于细菌定植。
    1. 确保准备好用于实验的60%蔗糖、M9线虫缓冲液和M9TX-01的冷溶液。为方便起见，可于前一晚置于4 °C保存。
    2. 为每个待洗涤的样品准备一个标记好的15 mL锥形管，其中加入8 mL M9TX-01，并置于冰上备用。这些将在步骤1.5.10中使用。
    3. 向每个含有L1幼虫的50 mL离心管中加入5 mL M9TX-01。将全部液体（现为10 mL）转移至一个空的15 mL螺口锥形管中，静置使成虫沉降至管底。
    4. 小心吸取上清液并弃去。
    5. 向每支试管中加入10 mL M9TX-01，将试管置于冰桶中冰浴5–10分钟。
      注意：从此时开始，线虫及所有缓冲液均需置于冰上。
    6. 使用 "快速温度" 将大型台式离心机设置为冷却至 4 °C。
    7. 向每管中加入10 mL冰冷的M9TX-01，以冲洗残留的杂质。将线虫置于冰上静置沉降，移除上清液并弃去。
    8. 蔗糖漂浮：向每支试管中加入5 mL冷M9缓冲液和5 mL冷60%蔗糖溶液，充分混匀。然后，小心地在每支试管的蔗糖-缓冲液混合物上层铺加1 mL冷M9缓冲液。加入漂浮层后勿再混匀。
      注意：接下来的步骤需迅速操作——若线虫暴露于高浓度蔗糖溶液中时间过长，可能发生干燥死亡！
    9. 以 1500 x g 离心 g 在 4 °C 下离心 3 分钟。活的成虫将位于 M9 溶液与蔗糖溶液的界面处，距管顶约 1 mL。
    10. 使用玻璃5 mL刻度吸管将虫层转移至已准备好的含有冷M9TX-01（来自步骤1.5.2）的15 mL锥形管中。操作时需格外小心，确保仅吸取活虫层，避免吸入过多蔗糖溶液。
    11. 如有需要，加入 M9TX-01 以使每管体积均一，达到 10–12 mL/管。在 1500 x g 4 °C 下静置 1 分钟，然后用移液器吸除上清液。此时可将线虫恢复至室温。
    12. 重复步骤1.5.11的洗涤操作两次，将转速降低至700 x g 在 4 °C 下，时间设为 30 秒。

2. 在液体培养基中用活菌喂养线虫

注意：本方案用于在液体培养条件下（充分混合环境）使线虫定植实验室培养的细菌（补充图1）。线虫可定植来自纯培养的单一菌株（例如，如Enterococcus faecium28,29等病原菌），也可定植多种菌株的混合物（例如，简化微生物组群落14）。

  1. 从第1.5步的蔗糖洗涤同步化成虫开始，置于15 mL锥形管中。用12 mL S缓冲液洗涤线虫一次，并弃去上清液。
  2. 将洗涤后的线虫重悬于实验所需体积的S培养基中。需考虑实验条件的体积、线虫分配的条件数量，以及线虫和细菌的最终浓度。
    注意：线虫的摄食行为随细菌的可获得性而变化30，且密度过高会导致线虫应激31。在液体培养中进行定植时，建议线虫密度<1000 条/mL，细菌密度>107 CFU/mL；1011 CFU/mL 被认为是在E. coli上实现"ad libitum"摄食的密度32。
  3. 离心收集细菌培养物。倒去上清液；对于形成疏松沉淀的细菌，可使用抽吸或移液方式去除上清液。
    注意：对于体积>5 mL的培养物，转移至15 mL离心管中，在大型台式离心机中以约2800 × g离心8–10分钟；体积<5 mL的培养物可转移至1.5 mL离心管中，在小型台式离心机中以9000 × g离心1–2分钟。运动性较强的细菌（例如多种假单胞菌属Pseudomonas）可能需要在4 °C预冷10–15分钟以促进形成稳定的沉淀，建议在4 °C条件下离心。
  4. 将细菌培养物用一体积的S缓冲液重悬，再次离心收集沉淀。按前述方法去除并弃去上清液。
  5. 将细菌培养物重悬于S培养基中，调整至实验所需的细菌密度，并加入用于筛选的抗生素（如适用）。所用抗生素种类取决于用于定植的细菌的抗性谱型。
  6. 使用经M9TX-01包被的移液枪头，轻柔吹打线虫，直至其在S培养基中充分重悬，随后转移至离心管或培养板孔中进行细菌定植。
  7. 向每份线虫培养物中加入细菌悬液，使其达到所需的细菌浓度和最终体积。
  8. 若使用多孔板进行定植，需用无菌的96孔透气封板膜覆盖培养板。
  9. 在200 RPM条件下振荡培养，以防止细菌在孵育过程中沉降。

3. 以96孔板格式对单条蠕虫进行机械破碎

注意：本节描述了一种采用96孔板格式对单个细菌定植的 C. elegans 进行机械裂解的实验方案。该方案的前几步（3.1–3.8）介绍了一种通过低温麻痹和表面漂白法去除线虫肠道内非黏附细菌并清洁线虫体表的方法。这些步骤可获得洁净且存活的成虫线虫，可用于后续机械裂解以定量分析其内含细菌（3.8节至结尾），或用于其他进一步实验（补充图1）。本方案可适用于定量分析在液体培养（第2节）、琼脂平板上、或来自自然环境及微宇宙土壤中定植的线虫体内的细菌含量。

  1. 将一份M9TX-01样品置于冰上冷却（体积为样品数的4-5倍，单位为mL）。
  2. 准备一份含次氯酸钠（6% 次氯酸钠，1:1000 或 1:2000 v/v）的M9TX-01溶液（每份样品1 mL，另加1 mL余量），并置于冰上冷却。该溶液将在步骤3.8中使用。
  3. 准备用于裂解线虫样品梯度稀释的96孔板。
    1. 取无菌的、容量为300 µL的96孔板（带盖）；本方案中每消化12条线虫使用一个稀释板。
    2. 使用96通道多通道移液器，向每个96孔板（300 µL容量）的B至D行各加入180 µL的1×PBS缓冲液。顶部行保持空置。B至D行将用于制备线虫消化液的10倍梯度稀释液 [0.1x, 0.01x, 0.001x]。
    3. 将板放置一旁。稀释板将在步骤3.13中使用。
  4. 在1.5 mL微量离心管中，用1 mL M9TX-01重悬每份线虫样品。
  5. 在低速微型离心机（2,000 × g）中于25 °C短暂离心（2-3 s），使成虫沉淀。用移液器吸弃上清液并丢弃，注意不要扰动线虫沉淀。
  6. 使用步骤3.5中的离心条件，用1 mL M9TX-01清洗线虫两次，再用1 mL M9线虫缓冲液清洗一次，以减少外部细菌。
  7. 清除线虫肠道中未黏附的细菌。
    1. 在培养管中，用1 mL S培养基加2倍量热灭活OP50重悬每份线虫样品。
    2. 于25 °C孵育20-30分钟，使未黏附的细菌从肠道排出。
      注：此步骤还可清除肠腔中的细胞外荧光蛋白，尤其在使用抗酸性荧光染料（如mCherry、dsRed）时，有助于更清晰地观察黏附于肠上皮的标记细菌。
  8. 对线虫进行表面漂白以清除外部细菌。
    1. 用1 mL冷M9TX-01将已清洗的线虫清洗两次，并弃去上清液。
    2. 将离心管置于冰上（优先选择）或4 °C冷却10分钟。此步骤可使线虫麻痹，防止其摄入漂白液。
      注：其他方案可能使用左旋咪唑等化学麻痹剂；这是一种已建立的方法33，但需增加危险废物处理流程。
    3. 向每管中加入1 mL冰冻M9线虫缓冲液加无香料漂白剂（8.25% 氢氧化钠，1:1000 或 1:2000 v/v）。将管子置于冰上（优先选择）或4 °C静置至少10分钟，以杀死外部细菌。
      注：漂白剂浓度不得超过1:1000。即使在线虫麻痹状态下，过高浓度仍可能导致死亡。
    4. 用移液器吸除漂白缓冲液并丢弃；将管子放回冰上，确保线虫在漂白剂完全清除前不会恢复泵动。
    5. 向每管中加入1 mL冷M9TX-01。在微型离心机中以2,000 × g、25 °C离心约5秒；然后将管子放回冰上。吸除上清液并丢弃。
    6. 用另一份1 mL冷M9TX-01重复清洗步骤，尽可能多地弃去上清液。
      注：若需将线虫用于后续实验，可跳过通透化步骤（方案3.9），直接将刚完成表面漂白的成虫转移至6 cm培养皿中的冰冻缓冲液中，并按方案3.10分离至不同实验条件。保持线虫低温以防止运动恢复，但操作应迅速——线虫在冰上放置超过>30分钟可能导致恢复正常活动的比例低于<100%34。
  9. 使用十二烷基硫酸钠和二硫苏糖醇（0.25% SDS + 300 mM DTT）对线虫角质层进行化学通透化处理（基于35）
    警告：DTT为还原剂且具刺激性。操作干粉或溶液时应穿戴个人防护装备（PPE），并在通风橱中进行。需配备危险废物处理流程。
    1. 在通风橱中，配制足够量的SDS/DTT溶液，确保每份样品可获得100 µL。配制1 mL溶液时，在1.5 mL微量离心管中加入965 µL M9线虫缓冲液或M9TX-01，再加入5 µL 5%（w/v）SDS和30 µL 1 M DTT。
      注：1 M DTT溶液（水溶液）应新鲜配制，或分装后于-20 °C保存以保持活性。分装量应满足2-3次实验使用，避免频繁冻融。
    2. 将含有表面漂白后线虫的微量离心管转移至室温试管架。每管应含有约20 µL缓冲液中的线虫。
    3. 向每份线虫样品中加入100 µL SDS/DTT溶液。将剩余的SDS/DTT溶液倒入适当的危险废物容器中处理。
    4. 在实验台上静置处理最多8分钟，以部分降解成虫坚韧的角质层。在此期间，线虫将死亡并沉降至管底。
    5. 通透化时间结束后，小心吸除SDS/DTT上清液，并将其倒入适当的SDS/DTT危险废物容器中处理。
    6. 向每管中加入1 mL M9TX-01。在台式离心机中短暂离心使线虫沉淀，或让线虫依靠重力自然沉降至管底，然后吸除上清液并倒入SDS/DTT危险废物容器中处理。
    7. 将线虫重悬于1 mL M9线虫缓冲液加0.1% Triton X-100中，待用。
  10. 将线虫分装至含碳化硅颗粒的深孔96孔板中，用于机械裂解。按以下步骤准备96孔裂解板。
    1. 取一个无菌的2 mL深孔96孔板及配套的硅胶96孔板盖。
      注：必须使用与组织破碎仪96孔适配器兼容的板。外部尺寸的微小差异可能导致板无法从适配器中取出。
    2. 使用无菌药匙，向将要接收线虫的每个孔中加入少量无菌36目碳化硅颗粒。加入量以刚好覆盖孔底为宜（约每孔0.2 g）。过多材料会妨碍移液枪头触及孔底以回收内容物。
    3. 向每孔中加入180 µL M9线虫缓冲液。
    4. 标记列或行以指示各样品位置，然后用硅胶96孔板盖松散覆盖板。
  11. 将单个线虫转移至96孔板进行裂解。
    1. 小心将通透化后的线虫转移至一个小（35或60 mm）培养皿中，皿内加入足量M9TX-01，使液体深度约为1 cm。
      注：若线虫数量较多，可能无法一次性转移全部样品，因液体过于拥挤，难以逐个移取线虫。
    2. 使用解剖显微镜或其他低倍放大设备，以20 µL体积逐个移取线虫，并将其转移至96孔板的各个孔中。
      注：最好仅采集刚死亡的线虫。避免选择呈僵直线状的线虫，因其可能已死亡较长时间。应选择呈弯曲或S形、整体生理状态正常且肠道完整的线虫。
    3. 每次转移后，确认所选线虫确实已排入孔中。为此，从培养皿的空白区域吸取20 µL M9TX-01，再将全部液体释放回培养皿；若线虫粘附在枪头上，通常会因此被排出。若线虫仍粘附，从孔中吸出20 µL液体并重新尝试转移。
    4. 所有线虫转移完毕后，用市售的柔性背衬密封膜（2×2方格）覆盖96孔板，确保背衬纸面朝下覆盖样品孔。注意不要将密封膜拉得过薄，否则后续难以移除。
    5. 将硅胶密封垫轻轻置于柔性密封膜上方；此时不要将盖子压入孔中。
    6. 将板转移至4 °C预冷30-60分钟。此步骤可防止裂解过程中过热，从而保护样品。
      注：本步骤为实验流程中的暂停点。大多数情况下，板可在4°C存放最多4小时后再进行研磨。切勿将线虫过夜存放，否则会改变细菌计数。
  12. 将96孔板装载至组织破碎仪上，破碎线虫组织并释放肠道细菌。
    注：（可选）若用于消化的96孔板数量为奇数，则需在开始前准备一个配重。使用一个空的深孔96孔板，并向孔中加水，直至其重量与第一个板相同。
    1. 将硅胶密封垫牢固压入孔中以形成密封，确保盖子在整个板表面平整贴合。
      注：若柔性密封膜因拉伸而过厚，将难以使硅胶盖完全平整地压入所有孔中，导致密封不充分，震荡时发生孔间污染。
    2. 使用96孔板适配器将板固定在组织破碎仪中。以30 Hz震荡1分钟，然后将板旋转180°，再次震荡1分钟。此操作有助于确保板中所有孔的裂解均匀。
    3. 在实验台上用力敲击板2-3次，以震落柔性密封膜上的颗粒。
    4. 使用配备两个96孔板适配器的大容量离心机，以2400 × g离心2分钟，使所有物质沉降至孔底。
    5. 移除硅胶盖，并小心揭下柔性密封膜。
      注：若柔性密封膜卡在任一孔中，可用200 µL移液枪头将其取出。此情况常见于密封膜被拉得过薄时。
  13. 在96孔板中对线虫消化样品进行梯度稀释，每孔总体积为300 µL。
    1. 使用多通道移液器设定为200 µL，缓慢而仔细地反复吹打数次以重新混匀孔内内容物，然后尽可能吸出全部液体。将此液体转移至步骤3.3中准备好的96孔板的顶部行。
    2. 使用设定为20 µL的96通道移液器，从此行吸出该体积液体并加入B行。吹打混合8-10次。弃去枪头。
    3. 重复步骤3.13.2，从B行的0.1x样品开始，在C行制备0.01x稀释样品。
    4. 再次重复步骤3.13.2，从C行转移至D行。
    5. 将稀释液点种于固体琼脂平板上进行细菌定量。对于单菌定植的线虫，通常只需在琼脂平板上点种各稀释度（1x-0.001x）的10-20 µL液滴即可。对于多物种定植，应分别点种各稀释度，每种取100 µL加至10 cm琼脂平板上，并立即使用玻璃涂布珠涂布均匀。

4. 碳化硅砂粒的清洁与重复使用

注意：本实验步骤用于在实验后清洁和灭菌碳化硅砂粒，以便重复使用。由于碳化硅砂粒为工业产品，未经预灭菌处理，因此首次使用前必须完整执行本方案。碳化硅砂粒（3.2 g/cc）是一种密度高、边缘粗糙的材料，可高效破碎坚韧的样品。然而，颗粒在多次使用后会逐渐磨损，当磨损明显时应予以更换。幸运的是，该材料价格低廉，通常出售的规格（约1磅）足以支持多次实验。

  1. 取样涂板后，向96孔板的所有孔中加入10%次氯酸钠溶液，静置至少10分钟。
  2. 将96孔板快速倒置在小型高边托盘或足够容纳全部内容物的空P1000吸头容器上，以去除大部分研磨颗粒。研磨颗粒会立即沉入托盘底部。将次氯酸钠溶液倒入水槽中弃去。
  3. 用自来水重新注满96孔板，再次倒置放入同一托盘中以冲洗残留的研磨颗粒。将水倒入水槽中弃去。
  4. 重复用自来水冲洗一至三次，直至96孔板完全无残留颗粒。
  5. 用自来水冲洗研磨颗粒2次，每次均注满托盘。
    注意：96孔深孔板可用实验室洗碗机清洗，用铝箔牢固覆盖后，与其他可重复使用的塑料制品一同高压灭菌。研磨颗粒无需立即清洗，此时可暂存备用。通常在多次实验积累足够量后再统一进行清洗和高压灭菌。
  6. 将研磨颗粒置于实验室洗涤剂溶液中清洗30分钟，期间偶尔通过旋涡振荡或金属刮刀搅拌进行搅动。
  7. 用自来水更换8–10次，彻底去除所有洗涤剂残留，然后用蒸馏水冲洗2次。
  8. 将研磨颗粒铺展于开放托盘（如浅层聚丙烯高压灭菌托盘）中，在40–70 °C下干燥数小时。
    注意：若干燥后颗粒结块，说明清洗或冲洗不充分。请从步骤4.6开始重复清洗流程，并在步骤4.7中增加冲洗次数。
  9. 将洁净干燥的研磨颗粒分装至带螺旋盖的可高压灭菌玻璃瓶中，每瓶装填深度不超过5–6 cm。采用预真空循环高压灭菌30分钟以实现灭菌。

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结果

活体线虫的漂白灭菌
表面漂白后的线虫在运动能力恢复和排泄重新开始前，其体外细菌基本被彻底清除。在本实验所用条件下，可观察到缓冲液中细菌的快速灭活。图1A-C，补充图2，视频1）而不干扰低温麻痹线虫中与肠道相关的细菌图1D-F，视频 2）。这些数据表明，表面漂白可有效对外部蠕虫进行消毒，同时不破坏其肠道内容物（表面漂白组与未漂白组的蠕虫相关菌落形成单位计数比较无显著差异，Wilcoxon 秩和检验 p > 0.05).

多样本机械破碎方法的优化
用于线虫机械破碎的96孔板技术对所用具体材料具有较强的耐受性，实际操作中的考虑因素决定了研磨材料的选择。与先前报道类似33，手动破碎（

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讨论

本文展示了在线虫 C. elegans 中进行单条线虫细菌载量定量的优势，并提供了一种96孔破碎方案，可快速、一致地获取大量此类数据。与现有方法33相比，该方案能够实现对线虫肠道微生物群落更高通量的检测。

该方法以平板接种为限速步骤，实际上并非"高通量"。大颗粒流式细胞术（图3C、D）是一种可用于定量单个线虫体内荧光标记细菌的有用高通量方法16，但在多物种群落中，同时检测的荧光染料数量受到限制。将多孔板裂解与群落测序相结合是提高通量的另一种方法；然而，本文所述的96孔板裂解程序经过专门优化，旨在保持细菌细胞完整。基于测序的分析需要充分裂解细胞，因此需额外增加核酸提取步骤，或对拍打程序（方案3.10–3.11）进行修改，以提取细胞内容物而非活菌。针对单条线虫裂解及核酸提取的实验方案已在其他文献中发表38,<...

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致谢

作者感谢 H. Schulenberg 和 C. LaRock 慷慨提供了本实验所用的细菌菌株。本研究工作获得了埃默里大学以及美国国家科学基金会（NSF，项目编号 PHY2014173）的经费支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
96孔平底聚丙烯板，300 µLEvergreen Labware290-8350-03F
96孔板硅胶密封垫，方形孔（AxyMat）AxygenAM-2ML-SQ
96孔板，2 mL，方形孔AxygenP-2ML-SQ-C-S
96孔聚丙烯板盖Evergreen Labware290-8020-03L
琼脂Fisher Scientific443570050
用于96孔板的珠磨适配器套装QIAGEN119900与TissueLyser II配合使用的适配板，可同时处理两个96孔板
珠磨组织匀浆仪（TissueLyser II）QIAGEN85300适用于中高通量样本破碎的机械匀浆设备
BioSorterUnion BiometricaBy quotation大型物体分选仪，配备250微米聚焦装置，用于C. elegans
市售漂白剂，8.25%次氯酸钠Clorox
96孔透气密封膜（Breathe-Easy）Diversified BiotechBEM-1多孔板用透气型聚氨酯膜。薄膜可透过O₂、CO₂和水蒸气，且在波长低至300 nm时仍具有紫外透光性。无菌，每盒100片。
二水合氯化钙Fisher ScientificAC423525000
胆固醇VWRAAA11470-30
一水合柠檬酸Fisher ScientificAC124910010
五水合硫酸铜（II）Fisher ScientificAC197722500
Corning 6765 LSE迷你微量离心机Corning COR-6765
乙二胺四乙酸二钠Fisher Scientific409971000
DL-1,4-二硫苏糖醇，纯度≥99%，分子生物学级，无DNA酶、RNA酶和蛋白酶，ACROS OrganicsFisher Scientific327190010
Eppendorf 1.5 mL微量离心管，自然色Eppendorf
Eppendorf 5424R微量离心机Eppendorf540600064024位制冷台式微量离心机
Eppendorf 5810R离心机，配S-4-104转子Eppendorf226270403L台式离心机，配有适用于15–50 mL管和板的适配器
Eppendorf板用吊篮（x2），适用于S-4-104转子Eppendorf22638930
乙醇，100%Fisher ScientificBP2818500
玻璃珠，2.7 mmLife Science ProductsLS-79127
酸洗玻璃珠，425–600 µmSigmaG877-500G
玻璃铺板珠VWR76005-124
盐酸VWRBDH7204-1
七水合硫酸亚铁（II）Fisher Scientific423731000
Kimble Kontes颗粒研钵电动杵DWK Life Sciences749540-0000
Kimble Kontes聚丙烯颗粒研钵和0.5 mL微量管DWK Life Sciences749520-0590
Leica DMi8电动倒置显微镜，带电动载物台Leica11889113
Leica LAS X Premium软件Leica11640687
七水合硫酸镁Fisher ScientificAC124900010
四水合氯化锰（II）VWR470301-706
PARAFILM M柔性实验室密封膜AmcorPM996
蛋白胨Fisher ScientificBP1420-500
培养皿，圆形，10 cmVWR25384-094
培养皿，圆形，6 cmVWR25384-092
培养皿，方形，10 × 10 cmVWR10799-140
磷酸盐缓冲液（1× PBS）Gold BioP-271-200
聚丙烯灭菌托盘，浅型Fisher Scientific13-361-10
氢氧化钾Fisher ScientificAC134062500
磷酸氢二钾Fisher ScientificBP363-1
磷酸二氢钾Fisher ScientificBP362-1
R 4.1.3 / RStudio 2022.02.0 build 443R Foundationn/a
金属勺形实验室刮铲VWR470149-438
碳化硅，36目MJR Tumblersn/a黑色超粗粒度碳化硅。该供应商提供0.5–5磅不同规格。
十二烷基硫酸钠Fisher ScientificBP166-100
氢氧化钠VWRBDH7247-1
无水磷酸氢二钠Fisher ScientificBP332-500
氯化钠Fisher ScientificBP358-1
蔗糖Fisher ScientificAC419760010
一水合三柠檬酸钾Fisher ScientificAC611755000
Triton X-100Fisher ScientificBP151-100
七水合硫酸锌Fisher ScientificAC205982500

参考文献

  1. Armitage, D. W., Jones, S. E. How sample heterogeneity can obscure the signal of microbial interactions. The ISME Journal. 13 (11), 2639-2646 (2019).
  2. Stephenson, J., et al. Host heterogeneity affects both parasite transmission to and fitness on subsequent hosts. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 372 (1719), 20160093(2017).
  3. VanderWaal, K. L., Ezenwa, V. O. Heterogeneity in pathogen transmission: mechanisms and methodology. Functional Ecology. 30 (10), 1606-1622 (2016).
  4. Dwyer, G., Elkinton, J. S., Buonaccorsi, J. P. Host heterogeneity in susceptibility and disease dynamics: tests of a mathematical model. The American Naturalist. 150 (6), 685-707 (1997).
  5. Wu, D., Rea, S. L., Yashin, A. I., Johnson, T. E. Visualizing hidden heterogeneity in isogenic populations of C. elegans. Experimental Gerontology. 41 (3), 261-270 (2006).
  6. Yashin, A. I., et al. Heat shock changes the heterogeneity distribution in populations of Caenorhabditis elegans does it tell us anything about the biological mechanism of stress response. The Journals of Gerontology Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 57 (3), 83-92 (2002).
  7. Zhao, Y., et al. Two forms of death in ageing Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 8 (1), 1-8 (2017).
  8. Eckley, D. M., et al. Molecular characterization of the transition to mid-life in Caenorhabditis elegans. AGE. 35 (3), 689-703 (2012).
  9. Rea, S. L., Wu, D., Cypser, J. R., Vaupel, J. W., Johnson, T. E. A stress-sensitive reporter predicts longevity in isogenic populations of Caenorhabditis elegans. Nature Genetics. 37 (8), 894-898 (2005).
  10. Kinser, H. E., Mosley, M. C., Plutzer, I. B., Pincus, Z. Global, cell non-autonomous gene regulation drives individual lifespan among isogenic C. elegans. eLife. , (2021).
  11. Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652(2017).
  12. Perez, M. F., Francesconi, M., Hidalgo-Carcedo, C., Lehner, B. Maternal age generates phenotypic variation in Caenorhabditis elegans. Nature. 552 (7683), 106-109 (2017).
  13. Baeriswyl, S., et al. Modulation of aging profiles in isogenic populations of Caenorhabditis elegans by bacteria causing different extrinsic mortality rates. Biogerontology. 11 (1), 53(2009).
  14. Taylor, M., Vega, N. M. Host immunity alters community ecology and stability of the microbiome in a Caenorhabditis elegans model. mSystems. 6 (2), 00608-00620 (2021).
  15. Diaz, S. A., Restif, O. Spread and transmission of bacterial pathogens in experimental populations of the nematode Caenorhabditis elegans. Applied and Environmental Microbiology. 80 (17), 5411-5418 (2014).
  16. Twumasi-Boateng, K., Berg, M., Shapira, M. Automated separation of C. elegans variably colonized by a bacterial pathogen. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (85), e51090(2014).
  17. Ortiz, A., Vega, N. M., Ratzke, C., Gore, J. Interspecies bacterial competition regulates community assembly in the C. elegans intestine. The ISME Journal. 15 (7), 2131-2145 (2021).
  18. Berg, M., et al. TGFβ/BMP immune signaling affects abundance and function of C. elegans gut commensals. Nature Communications. 10 (1), 604(2019).
  19. Portal-Celhay, C., Blaser, M. J. Competition and resilience between founder and introduced bacteria in the Caenorhabditis elegans gut. Infection and Immunity. 80 (3), 1288-1299 (2012).
  20. Scott, E., Holden-Dye, L., O'Connor, V., Wand, M. E. Intra strain variation of the effects of gram-negative ESKAPE pathogens on intestinal colonization, host viability, and host response in the model organism Caenorhabditis elegans. Frontiers in Microbiology. 10, 3113(2020).
  21. Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biology. 2 (1), (2001).
  22. Dirksen, P., et al. The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: gateway to a new host-microbiome model. BMC Biology. 14, 38(2016).
  23. Vega, N. M., Allison, K. R., Samuels, A. N., Klempner, M. S., Collins, J. J. Salmonella typhimurium intercepts Escherichia coli signaling to enhance antibiotic tolerance. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (35), 14420-14425 (2013).
  24. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
  25. Tabara, H., et al. The rde-1 gene, RNA interference, and transposon silencing in C. elegans. Cell. 99 (2), 123-132 (1999).
  26. Ahringer, J. Reverse genetics. WormBook. , (2006).
  27. Rual, J. -F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Research. 14 (10), 2162-2168 (2004).
  28. Revtovich, A. V., et al. Development and characterization of high-throughput Caenorhabditis elegans - Enterococcus faecium infection model. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 667327(2021).
  29. Anderson, Q. L., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. A high-throughput, high-content, liquid-based C. elegans pathosystem. JoVE (Journal of Visualized Experiments. (137), e58068(2018).
  30. Scholz, M., Dinner, A. R., Levine, E., Biron, D. Stochastic feeding dynamics arise from the need for information and energy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (35), 9261-9266 (2017).
  31. Wu, T., et al. Pheromones modulate learning by regulating the balanced signals of two insulin-like peptides. Neuron. 104 (6), 1095-1109 (2019).
  32. Ching, T. -T., Hsu, A. -L. Solid plate-based dietary restriction in Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (51), e2701(2011).
  33. Walker, A. C., Bhargava, R., Vaziriyan-Sani, A. S., Brust, A. S., Czyz, D. M. Quantification of bacterial loads in Caenorhabditis elegans. Bio-protocol. 12 (2), 4291-4291 (2022).
  34. Manjarrez, J. R., Mailler, R. Stress and timing associated with Caenorhabditis elegans immobilization methods. Heliyon. 6 (7), 04263(2020).
  35. Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. Isolation and culture of larval cells from C. elegans. PLoS ONE. 6 (4), 0019505(2011).
  36. Garsin, D. A., et al. Long-lived C. elegans daf-2 mutants are resistant to bacterial pathogens. Science. 300 (5627), New York, N.Y. 1921(2003).
  37. Thutupalli, S., et al. Farming and public goods production in Caenorhabditis elegans populations. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (9), 2289-2294 (2017).
  38. Ly, K., Reid, S. J., Snell, R. G. Rapid RNA analysis of individual Caenorhabditis elegans. MethodsX. 2, 59-63 (2015).
  39. Johnke, J., Dirksen, P., Schulenburg, H. Community assembly of the native C. elegans microbiome is influenced by time, substrate, and individual bacterial taxa. Environmental Microbiology. 22 (4), 1265-1279 (2020).
  40. Vega, N. M., Gore, J. Stochastic assembly produces heterogeneous communities in the Caenorhabditis elegans intestine. PLOS Biology. 15 (3), 2000633(2017).
  41. Gulyas, L., Powell, J. R. Cold shock induces a terminal investment reproductive response in C. elegans. Scientific Reports. 12 (1), 1338(2022).
  42. Jiang, W., et al. A genetic program mediates cold-warming response and promotes stress-induced phenoptosis in C. elegans. eLife. 7, 35037(2018).
  43. Robinson, J. D., Powell, J. R. Long-term recovery from acute cold shock in Caenorhabditis elegans. BMC Cell Biology. 17 (1), 2(2016).

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细菌定植宿主-微生物相互作用单条线虫定量96孔板机械破碎菌落平板接种表面漂白梯度稀释肠道细菌载量
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