使用单蠕虫数据量化 秀丽隐杆线虫的异质性 - 细菌相互作用

摘要

该协议描述了在冷麻痹和表面漂白以去除外部细菌后，对单个细菌定植 的秀丽隐杆线虫炎的 96孔破坏。将得到的悬浮液接种在琼脂平板上，以便对大量单个蠕虫中的细菌负荷进行准确的中等通量定量。

摘要

线虫 秀丽隐杆线虫 是宿主-微生物和宿主-微生物组相互作用的模型系统。迄今为止，许多研究使用间歇消化物而不是单个蠕虫样本来量化该生物体中的细菌负荷。这里认为，在 秀丽隐杆线虫 肠道的细菌定植中看到的较大的个体间变异性是信息性的，并且批量消化方法丢弃了对跨条件准确比较很重要的信息。由于描述这些样品固有的变异需要大量的个体，因此建立了一种方便的96孔板方案，用于单个蠕虫的破坏和菌落电镀。

引言

宿主 - 微生物关联的异质性无处不在，个体之间的变异越来越被认为是从竞争和共存¹到疾病传播^2，3，⁴的人群水平过程的一个促成因素。在秀丽隐杆线虫中，反复观察到等基因群体内的"隐藏的异质性"，个体亚群在热休克反应^5，6，衰老和寿命^{7，8，9，10，11}以及生理学和发育的许多其他方面显示出不同的表型¹².大多数试图确定亚种群结构的分析为等基因同步蠕虫实验种群中的两个亚种群提供了证据^5，7，8，尽管其他数据表明性状的种群内分布的可能性，而不是不同的群体^7，12，13.与此相关的是，即使在从共享的微生物来源定植的蠕虫的等基因群体中，也观察到肠道群体中的大量异质性^{13，14，15，16}，并且这种异质性可以通过批量消化测量来掩盖，该测量广泛用于蠕虫中的细菌定量^{17，18，19，20}。

这项工作提供的数据表明，在宿主 - 微生物关联中需要更多地依赖单蠕虫测量，以及提高单蠕虫破坏准确性和通量的方案。这些方案旨在促进对大量单个 秀丽隐杆线虫 的机械破坏，以定量活的细菌负荷，同时提供比基于杵的单个蠕虫更好的可重复性和更低的每个样品的努力。包括推荐的肠道清除步骤，其中允许蠕虫在准备破坏之前以热杀死 的大肠杆菌 为食，以尽量减少最近摄入的细菌和其他瞬时（非粘附）细菌的贡献。这些方案包括用低浓度表面漂白处理清洁角质层的冷麻痹方法;表面漂白可用作单一蠕虫破坏的准备步骤，或作为制备活的、外部无菌蠕虫的方法。这种表面漂白方法足以去除广泛的外部微生物，冷处理提供了常规左旋咪唑类麻痹的替代方案;虽然左旋咪唑将首选用于冷敏感实验，但冷麻痹可最大限度地减少对危险废物流的贡献，并允许迅速恢复正常活动。虽然完整的方案描述了一个实验室实验，其中蠕虫被已知细菌定植，但清洁蠕虫和单蠕虫破坏的程序可以很容易地应用于从野生样本中分离出或在微观实验中定植的蠕虫。这里描述的方案产生从蠕虫肠中提取的活细菌，适用于单个蠕虫中菌落形成单元（CFU）的电镀和定量;对于基于测序的肠道群落分析，应在这些方案中添加随后的细胞裂解和核酸提取步骤。

方案

这些实验中使用的蠕虫是从 Caenorhabditis 遗传中心获得的，该中心由NIH研究基础设施计划办公室（P40 OD010440）资助。布里斯托尔N2是野生型。DAF-2/IGF 突变体 daf-16（mu86） I （CGC CF1038） 和 DAF-2（e1370） III （CGC CB1370） 用于说明肠道细菌负荷的差异。

携带 pos-1 RNAi 载体的大 肠杆菌 HT115 （DE3） 来自阿林格文库²¹。 秀丽隐杆线虫 本地肠道细菌²² 的MYb集合是从舒伦堡实验室获得的。 肠道沙门氏菌 LT2 （ATCC 700720） attB:GFP-公里递归于本实验^{室 23}. 莫塞利假单胞菌 是在这个实验室中分离出来的。金黄色葡萄球菌 纽曼大学从埃默里大学的拉洛克实验室获得。

所有蠕虫缓冲液和培养基都是根据先前发表的文献²⁴ 制备的，稍作修改（见 补充文件1）。

1. 同步无菌秀丽隐杆线虫的制备

注意:在本节中，描述了生成生殖不育成虫同步种群的分步程序。这里使用 pos-1 RNAi板来防止后代的产生，因为这种干扰是胚胎致命的;在 pos-1 RNAi上长大到成年期的L1幼虫发育成产卵的雌雄同体，但这些卵是不可存活的²⁵。RNAi喂养方案与蠕虫手册²⁶的"反向遗传学"一章相同。

1. 在同步蠕虫之前，请确保可以使用新鲜的10厘米NGM + pos-1 RNAi板。板可以从浓缩的诱导液体培养物（+ Amp + IPTG）中新鲜制备，或作为NGM + 100μg/ mL氨苄西林+ 1mM IPTG上的草坪接种，并在25°C的黑暗中生长1天²⁷。
   注意:在RNAi板上，通常使用羧苄西林（25μg/ mL）代替氨苄西林。氨苄西林较便宜，但稳定性较差;如果使用氨苄西林，一旦干燥，应立即接种板并尽快使用（可在4°C下储存<1周）²⁷。这里推荐的高抗生素浓度将有助于确保充分的选择。
2. 从几个（通常两到四个）NGM板开始，这些板具有大量的妊娠雌雄同体。使用漂白剂-NaOH同步^{分离鸡蛋24}。
   1. 使用2 mL无菌ddH₂O每板洗掉琼脂平板上的蠕虫。将液体均匀地分配到1.5 mL微量离心管中（每板或雌雄同体一个管）。
   2. 在台式小型离心机（2，000 x g）中旋转约5秒，将成虫拉到管的底部。移取上清液并丢弃。
   3. 用1毫升无菌ddH₂O洗涤;像以前一样旋转并丢弃上清液。
   4. 重复上一步以减少残留的细菌碎片。
   5. 将每个管的内容物重悬于1mL无菌ddH₂O中，向每个管中加入130μL商业漂白剂（8.25%次氯酸钠）和130μL 5 N氢氧化钠（NaOH，终浓度0.5 N）。
   6. 涡旋管每2分钟剧烈旋转至少10-15秒，直到成年身体破裂。不要让漂白剂NaOH处理超过5分钟，以避免杀死卵子。
   7. 在小型离心机中以2，000 x g 的速度旋转30-60秒以沉淀卵子。移取上清液并丢弃。可能有也可能没有可见的颗粒，这是正常的。
   8. 加入1 mL M9蠕虫缓冲液，以2000 x g旋转30-60 秒。弃去上清液。
   9. 重复冲洗步骤（1.2.8）5x以彻底除去漂白剂- NaOH混合物，尽可能多地去除上清液而不会干扰鸡蛋沉淀。
   10. 将卵转移到 10 mL ML M9 蠕虫缓冲液中，置于 50 mL 锥形管或 30 mL 带盖的培养管中。如果使用锥形管，请稍微拧开盖子，并使用一点胶带将其固定。在25°C和200 RPM下振荡过夜（16小时），以使幼虫孵化。
3. 将同步的L1幼虫转移到RNAi板以生长到成年期。
   1. 向每个 L1 管中加入 2 mL 无菌 M9 缓冲液 + 0.01% Triton X-100（以下简称 M9TX-01），并将整个体积 （12 mL） 转移到 15 mL 螺旋顶锥形管中。
   2. 将15mL管与L1蠕虫在4°C下放置10分钟以减缓幼虫运动。
   3. 在大型台式离心机中旋转15 mL锥形管（4°C下1，500× g ，持续3分钟;加速度和减速不应高于最大值的80%）。
   4. 小心地移走上清液，而不会干扰L1沉淀。弃去上清液。
   5. 向每管中加入 12 mL 冷 M9TX-01。重复离心。小心地移液并丢弃上清液。每个管子应剩余约200μL。
   6. 在M9TX-01中冲洗200μL移液器吸头以防止蠕虫粘附在塑料上，然后使用此吸头重悬蠕虫沉淀。通过将液体滴剂移液到细菌草坪上，将重悬的蠕虫转移到制备的 pos-1 板中。
   7. 将板在25°C孵育至成年期的第一天。
      注意:如果在 pos-1 RNAi平板上生长蠕虫，蠕虫必须 随意 喂养RNAi细菌，直到它们完全过渡到成年期，以确保胚胎致死表型的高外显率。在24和48小时检查板。如果盘子看起来饥饿或几乎挨饿，蠕虫将需要移动到新鲜的盘子里，以完成成长为全尺寸的成虫。为避免在蠕虫生长之前耗尽板，目标是在每个10 cm RNAi板中添加250-500 L1幼虫。
4. 收获成虫和清除肠道 大肠杆菌 ，以产生无菌蠕虫。
   1. 每板使用 5 mL M9TX-01 从平板上冲洗成虫。将缓冲液+蠕虫转移到15mL锥形管中，并允许成虫沉降到管的底部。
   2. 用10 mL新鲜M9TX-01缓冲液的变化冲洗成人，直到没有可见的细菌浊度残留（通常为1-2x）。管子可以在700 x g 下离心30秒以沉淀蠕虫，或者可以通过重力允许成虫沉降。
   3. 用10 mL M9TX-01进行一次额外的洗涤，以减少外部细菌。
   4. 将蠕虫转移到50 mL锥形管或30 mL培养管中，其中包含5 mL S培养基+ 2x热杀灭 的大肠杆菌 OP50（〜5 x 10⁹ 个杀死的细胞/ mL）+ 200μg/ mL庆大霉素+ 50μg/ mL氯霉素。如果使用锥形管，请稍微拧开盖子，并使用一点胶带将其固定。在M9TX-01中使用玻璃移液器或冲洗塑料移液器，以防止蠕虫粘附。
   5. 将成虫在25°C下孵育，以200RPM振荡24-48小时，以产生无菌成虫。
      注意:如果蠕虫要在抗生素中停留>24小时，则可能需要添加更多热杀灭的OP50，以确保蠕虫有足够的食物来源。在24小时检查试管，如果浊度明显降低，则补充热杀灭的OP50。
5. 蔗糖根据Wormbook协议²⁴ 洗涤成虫，以获得清洁，生殖无菌，同步的成人专用库存以进行细菌定植。
   1. 确保冷体积的 60% 蔗糖、M9 蠕虫缓冲液和 M9TX-01 可供使用。为简单起见，这些可以在前一天晚上保持在4°C。
   2. 对于每个要洗涤的样品，创建一个标记的15 mL锥形管，其中包含8 mL M9TX-01并放在冰上。这些将在步骤1.5.10中需要。
   3. 向每50 mL含有L1幼虫的管中加入5 mL M9TX-01。将整个体积（现在为10 mL）转移到空的15 mL螺旋顶锥形管中，并让成人沉降到管的底部。
   4. 小心地移取上清液并丢弃。
   5. 向每个试管中加入10 mL M9TX-01，并将试管移至冰桶中5-10分钟。
      注意:从此时开始，蠕虫和所有缓冲液应保持在冰上。
   6. 使用"快速温度"设置将大型台式离心机冷却至4°C。
   7. 向每个试管中加入 10 mL 冷 M9TX-01 以冲洗掉任何残留的碎屑。让蠕虫在冰上定居;取出上清液并丢弃。
   8. 蔗糖浮子:向每根管中加入5 mL冷M9缓冲液和5 mL冷60%蔗糖溶液，充分混合。然后，小心地将1mL冷M9缓冲液漂浮在每个管中的蔗糖缓冲液混合物的顶部。加入浮子后不要混合。
      注意:在接下来的几个步骤中快速移动 - 如果暴露于高浓度蔗糖中太长时间，蠕虫会干燥！
   9. 在4°C下以1500× g 离心3分钟。 活的成虫将位于M9和蔗糖的界面处，距离管顶部约1 mL。
   10. 使用玻璃5 mL血清学移液管将蠕虫层转移到具有冷M9TX-01的制备的15mL锥形管中（从步骤1.5.2开始）。要非常小心地获取活虫层，不要移取过多的蔗糖。
   11. 如有必要，加入M9TX-01以获得10-12 mL /管的等体积。在4°C下以1500× g 离心1分钟，然后移取上清液。此时，蠕虫可以恢复到室温。
   12. 重复洗涤步骤1.5.11两次，在4°C下将速度降低到700× g ，时间减少到30秒。

2.在液体培养物中以活细菌为食

注意:该方案用于在液体培养物中以混合良好的条件下用实验室培养的细菌定植蠕虫（补充图1）。蠕虫可以用纯培养物中的单个分离株（例如，病原体，例如 屎肠球菌^28，29）或分离株的混合物（例如，最小微生物组群落¹⁴）定植。

1. 从15 mL锥形管中方案步骤1.5中的蔗糖洗涤同步成虫开始。在12mL S缓冲液中洗涤蠕虫一次，并丢弃上清液。
2. 将洗涤过的蠕虫重悬于实验所需的S培养基体积中。考虑实验条件的体积，蠕虫分裂的条件数量以及蠕虫和细菌的最终浓度。
   注意:蠕虫的摄食因细菌可用性^{而异 30}，蠕虫可能因拥挤^{31 而}产生压力。对于液体培养物中的定植，建议<1000蠕虫/ mL和>^{10 7} CFU / mL;10¹¹ CFU/mL 被认为是大肠杆菌³² 的"随意"进食密度。
3. 离心降序培养物。倒掉上清液;抽吸或移液可用于去除形成松散颗粒的细菌的上清液。
   注意:对于>5 mL的培养物，转移到15 mL管中，并在大型台式离心机中以~2800 x g 旋转8-10分钟。<5 mL的培养物可以转移到1.5 mL管中，并在小型台式离心机中以9000× g 离心1-2分钟。高度运动细菌（例如，许多种类的 假单胞菌）可能需要在4°C下冷却10-15分钟以促进形成稳定的沉淀，并且在4°C下离心可能更好。
4. 将细菌培养物重悬于一体积的S缓冲液中，然后再次离心以沉淀。像以前一样取出并丢弃上清液。
5. 在S培养基中以实验所需的密度重悬细菌培养物，并添加任何抗生素进行选择。要使用的抗生素（如果有的话）将取决于用于定植的细菌的耐药性特征。
6. 使用涂有M9TX-01的移液器吸头，轻轻地上下移液蠕虫，直到蠕虫完全重悬于S培养基中，然后转移到管或板孔中进行细菌定植。
7. 向每个蠕虫培养物中加入细菌悬浮液以达到所需的细菌浓度和最终体积。
8. 如果使用多孔板进行定植，请用无菌的96孔透气密封膜覆盖板。
9. 以200 RPM的振荡孵育，以防止细菌在孵育过程中沉降。

3. 以96孔形式对单个蠕虫进行机械破坏

注意:本节描述了用于机械破坏单个细菌定植 秀丽隐杆线虫的96孔板格式方案。方案（3.1-3.8）中的第一步描述了一种从蠕虫肠道中清除未粘附的细菌并使用冷麻痹和表面漂白清洁蠕虫外部的方法。这些步骤将产生干净的活的成虫，可以机械地破坏细菌内容物（3.8端）或用于进一步的实验（补充图1）。该方案可以适应量化在液体培养物中定植的蠕虫中的细菌（第2部分），琼脂平板上或来自天然或微观土壤的细菌。

1. 将等分试样的M9TX-01放在冰上冷却（以mL为单位的样品数量的4-5倍）。
2. 准备一等分试样的M9TX-01 + 漂白剂（6%次氯酸钠，1:1000或1:2000 v / v，每个样品1 mL + 1 mL额外），并放在冰上冷却。该等分试样将在步骤3.8中使用。
3. 制备96孔板，用于连续稀释破坏的蠕虫样品。
   1. 获得无菌300μL容量带盖的96孔板;该方案每消化12个蠕虫使用一个稀释板。
   2. 使用96孔多通道移液器用180μL 1x PBS缓冲液填充每个96孔板（300μL容量）的B-D行。将顶行留空。行 B-D 将成为蠕虫消化物的 10 倍连续稀释液 [0.1x， 0.01x， 0.01x]。
   3. 将盘子放在一边。稀释板将在步骤3.13中使用。
4. 将每个蠕虫样品重悬于1.5 mL微量离心管中的1 mL M9TX-01中。
5. 在25°C的低速小型离心机（2，000 x g）中短暂旋转管（2-3秒）以沉淀成虫。移取上清液并丢弃，确保不会干扰蠕虫沉淀。
6. 使用步骤3.5中的离心设置，用1 mL M9TX-01冲洗蠕虫两次，然后用1 mL M9蠕虫缓冲液冲洗一次，以减少外部细菌。
7. 清除蠕虫肠道中未粘附的细菌。
   1. 将每个蠕虫样品重悬于培养管中的1 mL S培养基+ 2x热杀灭OP50中。
   2. 在25°C下孵育20-30分钟，以允许任何未粘附的细菌从肠道中通过。
      注意:这还将清除腔内的任何细胞外荧光蛋白，并允许更清晰地显示粘附在肠上皮上的标记细菌，特别是当使用抗酸荧光团（例如，mCherry，dsRed）时。
8. 表面漂白蠕虫以清除外部细菌。
   1. 用1 mL冷M9TX-01冲洗清除的蠕虫两次，并弃去上清液。
   2. 让试管在冰上（首选）或在4°C下冷却10分钟。 这将使蠕虫瘫痪并防止摄入漂白剂。
      注:其他方案使用化学麻痹剂，如左旋咪唑;这是一个既定的方法³³ ，需要增加一个危险废物流。
   3. 向每管中加入 1 mL 冰冷的 M9 蠕虫缓冲液 + 无味漂白剂（8.25% 氢氧化钠，1:1000 或 1:2000 v/v）。让试管坐在冰上（优选）或在4°C下放置至少10分钟以杀死外部细菌。
      注意:漂白剂的浓度不要超过1:1000。即使在瘫痪的蠕虫中，也可能导致死亡。
   4. 移液漂白缓冲液并丢弃;将管子放回冰中，以确保蠕虫在漂白剂清除之前不会恢复泵送。
   5. 向每个管中加入 1 mL 冷 M9TX-01。在小型离心机中旋转约5秒（25°C时为2，000× g ）;将管子放回冰上。取出上清液并丢弃。
   6. 用另一个1毫升冷的M9TX-01重复此冲洗步骤，尽可能多地丢弃上清液。
      注意:如果使用蠕虫进行进一步的实验，请跳过渗透化步骤（协议3.9），而是将新鲜表面漂白的成虫转移到6厘米培养皿中的冰冷缓冲液中，并将蠕虫分离到实验条件下，如协议3.10所示。保持蠕虫的低温以防止蠕动恢复，但要快速工作 - 将蠕虫在冰上保持>30分钟可能会导致<100%恢复正常活动³⁴。
9. 用十二烷基硫酸钠和二硫基里醇（0.25% SDS + 300 mM DTT）对蠕虫角质层的化学渗透（基于³⁵）
   注意:DTT是一种还原剂和刺激性。在处理干燥的原料或溶液时，请穿戴PPE并在通风橱中工作。需要危险废物流。
   1. 在通风橱中，准备足够的SDS / DTT溶液，以便每个样品100μL。对于 1 mL，在 1.5 mL 微量离心管中加入 965 μL M9 蠕虫缓冲液或 M9TX-01，加入 5 μL 5% （w/v） SDS 和 30 μL 1M DTT。
      注意:1 M DTT溶液（水溶液）应新鲜制备或在-20°C下以等分试样储存，以确保效力。等分试样的大小应为在两到三个实验中使用，以避免过度冻融循环。
   2. 将含有表面漂白蠕虫的微量离心管移动到室温管架上。每个管子应含有~20μL缓冲液中的蠕虫。
   3. 向每个蠕虫样品中加入100μLS / DTT溶液。将任何剩余的SDS/DTT溶液处置在适当的危险废物流中。
   4. 让治疗在工作台上进行长达8分钟，以部分分解成虫的抗性角质层。在此期间，蠕虫会死亡并沉降到管子的底部。
   5. 通透时间结束后，小心地移取SDS/DTT上清液，并将其丢弃在适当的SDS/DTT危险废物流中。
   6. 向每个管中加入1 mL M9TX-01。在台式离心机中短暂旋转以沉淀蠕虫或让蠕虫通过重力沉降到管的底部，然后抽出上清液并处理在SDS / DTT危险废物流中。
   7. 将蠕虫重悬于 1 mL M9 蠕虫缓冲液 + 0.1% Triton X-100 中，直至可供使用。
10. 将蠕虫分离到带有碳化硅砂砾的深96孔板中以进行机械破坏。准备96孔破坏板如下。
    1. 获得无菌的2 mL深孔96孔板和匹配的硅96孔板盖。
       注意:对于组织干扰剂，使用与96孔适配器兼容的板非常重要。外部尺寸的微小差异使得可以从适配器上取下的板和不能从适配器上取下的板之间存在差异。
    2. 使用无菌勺刮刀，将少量无菌的36粒度碳化硅加入到将接收蠕虫的板的每个孔中。使用足够的砂砾勉强覆盖孔的底部（每孔约0.2g）。在取回内容物时，过多的材料会使移液器尖端难以到达孔的底部。
    3. 向每个孔中加入180μLM9蠕虫缓冲液。
    4. 标记列或行以指示每个样品将去哪里，然后用硅96孔板盖松散地覆盖板。
11. 将单个蠕虫转移到96孔板以进行破坏。
    1. 小心地将透化蠕虫移动到含有足够M9TX-01的小型（35或60毫米）培养皿中，以填充培养皿至约1厘米的深度。
       注意:如果存在大量蠕虫，则可能无法转移整个样品，因为液体会变得拥挤，并且难以移取单个蠕虫。
    2. 使用解剖显微镜或其他低放大倍率装置，移取20μL体积的单个蠕虫，并将这些蠕虫转移到96孔板的各个孔中。
       注意:最好只收获刚杀死的蠕虫。避免使用刚性线性形状的蠕虫，因为这些蠕虫可能已经死了一段时间。尝试服用弯曲或S形的蠕虫，具有正常的粗略生理和完整的肠道。
    3. 转移每个体积后，确保所选蠕虫实际上已弹出到孔中。为此，从培养皿的透明区域移取20μLM9TX-01，并将全部体积释放回培养皿中;如果蠕虫粘在移液器上，这通常会弹出蠕虫。如果蠕虫卡住，请从孔中取出20μL并再次尝试转移。
    4. 转移所有蠕虫后，用一张市售的柔性背纸密封膜（2 x 2平方）覆盖96孔板，确保密封膜的纸背侧朝下朝向样品孔。注意不要将密封膜拉伸得太薄，否则以后很难去除。
    5. 将硅密封垫轻轻放在柔性密封膜的顶部;此时不要将盖子压入孔中。
    6. 将板移至4°C冷却30-60分钟。这将防止在破坏期间过热，从而损坏样品。
       注意:这是协议中的断点。在大多数情况下，板可以在4°C下放置长达4小时，然后再研磨。不要让蠕虫过夜，因为这会改变细菌数量。
12. 将96孔板加载到组织破坏剂上以分解蠕虫组织并释放肠道细菌。
    注意:（可选）如果使用奇数个96孔板进行消化，则必须在继续之前准备配重。使用一个空的深96孔板，用水填充孔，直到它的重量与第一个板相同。
    1. 将硅密封垫牢固地压入孔中以形成密封，确保盖子平放在板的整个表面上。
       注意:如果柔性密封膜在拉伸后太厚，将很难固定硅胶盖，使其在所有孔中都是平躺的。这将导致密封不足和振荡过程中的井间污染。
    2. 使用96孔板适配器将板固定在组织干扰物中。在30 Hz下摇动板1分钟，然后将板旋转180°并再次摇动1分钟。这将有助于确保板块所有孔的均匀破坏。
    3. 将板牢固地敲击在工作台上两到三次，以从柔性密封膜上除去任何砂砾。
    4. 使用带有两个96孔板适配器的大型离心机，将板以2400× g 旋转2分钟，将所有材料收集到孔的底部。
    5. 取下硅胶盖，小心地拉出柔性密封膜。
       注意:如果柔性密封膜粘在任何孔中，请使用200μL移液器吸头将其取出。当柔性密封膜拉伸得太薄时，这种情况很常见。
13. 在96孔板中连续稀释300μL蠕虫消化物样品。
    1. 使用设置为200μL的多孔移液器，缓慢而小心地上下移液几次，以重新混合孔的内容物，然后抽出尽可能多的液体。将此液体转移到步骤3.3中制备的96孔板的顶部行。
    2. 使用设置为20μL的96孔移液器，从顶排取出该体积的液体并分配到B排中。丢弃吸头。
    3. 重复步骤3.13.2，从B行中的0.1x样品开始，在C行中创建0.01x稀释样品。
    4. 再次重复步骤 3.13.2，从 C 行转到行 D。
    5. 将板铺在固体琼脂上以进行细菌定量。对于单定植蠕虫，通常将每次稀释液[1x-0.001x]的10-20μL滴剂铺在琼脂平板上就足够了。对于多物种定植，通过将100μL移液到10厘米琼脂平板上分别接种每个稀释液;立即使用玻璃镀珠涂抹。

4. 清洗碳化硅砂砾以便重复使用

注意:此过程用于清洁和灭菌研磨材料碳化硅砂砾，以便在实验后重复使用。在首次使用之前，应完全遵循该协议，因为碳化硅砂砾是一种工业产品，不会预先灭菌。碳化硅砂砾（3.2 g/cc）是一种致密的粗边材料，可有效地破坏坚硬的样品。但是，反复使用时颗粒可能会磨损，当磨损变得明显时应进行更换。幸运的是，这种材料价格便宜，通常出售的尺寸（~1磅）足以用于许多实验。

1. 取出样品进行电镀后，向96孔板的所有孔中加入10%漂白剂溶液，静置至少10分钟。
2. 通过将96孔板快速倒置在一个小的高边托盘或空的P1000移液器吸头容器上来去除大部分砂砾，该容器大到足以捕获所有内容物。砂砾将立即沉入托盘底部。将漂白剂溶液倒入水槽中。
3. 用自来水重新填充96孔板，并倒置到同一托盘中以冲洗掉剩余的砂砾。将水倒入水槽中。
4. 用自来水重复一到三次，直到盘子完全没有砂砾。
5. 用自来水冲洗2x砂砾，每次填充托盘。
   注意:96孔深孔板可以在实验室洗碗机中清洗，用箔纸牢固地覆盖，并用其他可重复使用的塑料高压灭菌。砂砾不需要立即清洗，此时可以放在一边。用过的砂砾通常在洗涤和高压灭菌之前从多个实验中积累。
6. 在实验室洗涤剂溶液中洗涤砂砾30分钟，偶尔通过旋转或与金属刮刀混合来搅拌。
7. 用几（8-10）次自来水冲洗掉所有洗涤剂的痕迹，然后用蒸馏水冲洗2次。
8. 将砂砾铺在打开的托盘中，例如浅聚丙烯高压灭菌器托盘中，并在40-70°C下干燥数小时。
   注意:如果砂砾干燥时结块，则说明未充分清洁或冲洗。从步骤4.6开始重复清洁方案，在步骤4.7中添加额外的冲洗液。
9. 将干净、干燥的砂砾分配到螺旋顶可高温高压灭菌的玻璃瓶中，最大深度为5-6厘米。在预真空循环中高压灭菌30分钟以灭菌。

结果

活虫的漂白灭菌
表面漂白的蠕虫实际上没有外部细菌，直到运动恢复并恢复排泄。在这里使用的条件下，观察到缓冲液中细菌的快速灭绝（图1A-C，补充图2，视频1），而不会干扰冷麻痹蠕虫中的肠道相关细菌（图1D-F，视频2）。这些数据表明，表面漂白可以有效地用于外部消毒蠕虫，而不会影响肠道内容物（表面漂白与无漂白蠕虫相关CFU计数的比较并不重要，Wilcoxon秩和测试p>0.05）。

多样品机械破碎的变化
用于蜗杆机械破碎的96孔技术对所使用的特定材料具有鲁棒性，并且实际考虑因素决定了研磨材料的选择。与之前的报告³³类似，在所有缓冲条件下，手动破坏（图2A

讨论

这里提供了关于 秀丽隐杆线虫中细菌负荷的单蠕虫定量的优势的数据，以及96孔破坏方案，以允许快速和一致地获取这种类型的大型数据集。与现有方法³³相比，这些方案允许对蠕虫中的肠道微生物群落进行更高通量的测量。

这种方法将电镀作为速率限制步骤，并不是真正的"高吞吐量"。大物体流式细胞术（图3C，D）是一种有用的高通量方法，用于量化单个蠕虫¹⁶中的荧光标记细菌，尽管同时荧光团的数量在多物种群落中是一个限制。将多孔板破坏与社区测序联系起来是提高通量的另一种方法;然而，这里描述的96孔破坏程序经过专门优化，以保持细菌细胞完整。基于测序的分析，其中需要彻底裂解细胞，将需要添加核酸提取步骤或修改跳动方案（方案3.10-3.11）以提取细胞内容物而不是活细菌。关于单蠕虫破坏和提取核酸的方案已在其他地方发表^，38，

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
96 孔平底聚丙烯板，300 μL	Evergreen Labware	290-8350-03F
96 孔板密封垫，硅胶，方孔 （AxyMat）	Axygen	AM-2ML-SQ
96 孔板，2 mL，方孔	Axygen	P-2ML-SQ-C-S
96 孔聚丙烯板盖	Evergreen Labware	290-8020-03L
琼脂	Fisher Scientific	443570050
珠磨机适配器套件，用于 96 孔板	QIAGEN	119900	适配器板，用于 TissueLyser II 上的两个 96 孔板
珠磨机组织匀浆器 （TissueLyser II）	QIAGEN	85300	用于中高通量样品破碎的机械匀浆器
BioSorter	Union Biometrica	报价	大型物体分拣机配备 250 微米聚焦C. 秀丽隐杆线虫
>漂白剂、商用、8.25% 次氯酸钠	Clorox
Breathe-Easy 96 孔透气密封膜	多元化生物技术	BEM-1	多孔板透气聚氨酯膜。薄密封膜可渗透 O2、CO2 和水蒸气，并且在 300 nm 以下具有紫外线透明性。无菌，100 个/盒。
水合氯化钙	Fisher Scientific	AC423525000
胆固醇	VWR	AAA11470-30
柠檬酸一水合	Fisher Scientific	AC124910010
硫酸铜 （II） 五水合	Fisher Scientific	AC197722500
康宁 6765 LSE 微型微量离心机	康宁	COR-6765
EDTA 二钠	Fisher Scientific	409971000
DL 1,4 二硫苏糖醇，99+%，用于分子生物学，不含 DNAse、RNAse 和蛋白酶，ACROS Organics	Fisher Scientific	327190010
Eppendorf 1.5 mL 微量离心管，天然	Eppendorf
Eppendorf 5424R 微量离心机	Eppendorf	5406000640	24 孔冷冻台式微量离心机
Eppendorf 5810R 离心机，带 S-4-104 转子	Eppendorf	22627040	3L 台式离心机，带适配器，用于 15-50 mL 离心管和板
Eppendorf 板（x2）， 适用 Eppendorf S-4-104 转子		22638930
乙醇 100%	Fisher Scientific	BP2818500
玻璃珠， 2.7 mm	生命科学产品	LS-79127
玻璃珠，酸洗，425-600 和微量;m	Sigma	G877-500G
玻璃电镀珠	VWR	76005-124
盐酸	VWR	BDH7204-1
七水硫酸铁 （II）	Scientific	423731000
Kimble Kontes 颗粒杵电机	DWK Life Sciences	749540-0000
Kimble Kontes 聚丙烯颗粒杵和微量离心管，0.5 mL	DWK 生命科学	749520-0590
徕卡 DMi8 电动倒置显微镜，带电动载物台	徕卡	11889113
徕卡 LAS X 高级软件	徕卡	11640687
硫酸镁七水合	Fisher Scientific	AC124900010
氯化锰 （II） 四水合物	VWR	470301-706
PARAFILM M 柔性实验室密封膜	Amcor	PM996
蛋白胨	Scientific	BP1420-500
培养皿，圆形，10 cm	VWR	25384-094
培养皿，圆形，6 cm	VWR	25384-092
培养皿，方形，10 x 10 cm	VWR	10799-140
磷酸缓冲生理盐水 （1X PBS）	Gold Bio	P-271-200
聚丙烯高压灭菌器托盘，浅	Fisher Scientific	13-361-10
氢氧化钾	Fisher Scientific	AC134062500
磷酸氢二钾	Fisher Scientific	BP363-1
磷酸氢二钾	Fisher Scientific	BP362-1
R 4.1.3/RStudio 2022.02.0 build 443	R Foundation	n/a
勺式实验室刮刀，金属	VWR	470149-438
碳化硅 36 粒度	MJR 不倒翁	n/a	黑色超粗碳化硅砂砾。该供应商提供 0.5-5 磅尺寸。
十二烷基硫酸钠	Fisher Scientific	BP166-100
氢氧化钠	VWR	BDH7247-1
磷酸氢二钠 无水	Fisher Scientific	BP332-500
氯化钠	Fisher Scientific	BP358-1
蔗糖	Fisher Scientific	AC419760010
三钾柠檬酸盐一水合物	Fisher Scientific	AC611755000
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-100
七水硫酸锌	Fisher Scientific	AC205982500