方法文章

一种半自动且可重现的基于生物学的体外定量钙沉积的方法

DOI：

10.3791/64029

⸱

2022年6月2日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Cardiovascular Research Institute Maastricht (CARIM), Maastricht University, 2Helmholtz Institute for Biomedical Engineering, Biointerface Group, RWTH Aachen University, 3Institute of Experimental Medicine and Systems Biology, RWTH Aachen University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

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心血管疾病是全世界死亡的主要原因。血管钙化大大加重了心血管发病率和死亡率的负担。该协议描述了一种通过荧光成像在 体外 量化血管平滑肌细胞介导的钙沉淀的简单方法。

摘要

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血管钙化涉及一系列退行性病变，包括炎症、细胞表型改变、细胞死亡和钙化抑制剂的缺乏，伴随导致血管弹性和功能丧失。血管钙化是许多疾病（包括慢性肾脏病、糖尿病和动脉粥样硬化）发病率和死亡率的重要因素。目前研究血管钙化的研究模型是有限的，仅在体内钙化发展的后期才可行。用于研究血管钙化的体外工具使用终点测量，增加了对生物材料的需求，并有可能将变异性引入研究。我们展示了一种新型荧光标记探针的应用，该探针与人体血管平滑肌细胞的体外钙化发展结合，并确定体外钙化的实时发展。在该协议中，我们描述了我们新开发的钙化测定的应用，这是一种具有潜在转化应用的疾病建模新工具。我们设想该测定法与更广泛的矿物沉积研究相关，包括骨骼、软骨或牙科研究的应用。

引言

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血管钙化 （VC） 是心血管疾病发病率和死亡率的独立危险因素1，2，3。长期以来被认为是异位矿物沉积的被动化学过程，现在它似乎是一种可改变的组织愈合反应，涉及各种细胞的积极贡献，包括活化的血管平滑肌细胞（hVSMC）作为疾病的驱动因素4，5。体内VC可以通过多层CT扫描来测量，作为动脉粥样硬化负荷的评估6，7，8。目前，范式转变正在进行中，其中VC严重程度被认为是心血管疾病，II型糖尿病，慢性肾病和衰老的危险因素9，10，11，12，13，14，

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方案

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1. 细胞接种、维持和钙化诱导

  1. 要培养原代细胞，请使用层流气流柜、手套和无菌设备。在进行任何工作之前和之后对手和工作区进行消毒。将所有原代细胞和培养基视为潜在的生物危害，除非另有证明。优选在处置前高压灭菌剩余细胞和培养基。不要化学灭活和高压灭菌，因为这会释放有毒烟雾。
  2. 在未包被的细胞培养板上培养hVSMC。
  3. 在补充有10%-20%FBS和1%Pen / Strep的M199培养基组成的生长培养基中常规维持hVSMC，并在37°C和5%CO2下孵育。
  4. 在70%-90%汇合时分裂细胞。
    1. 要拆分，请用PBS清洗hVSMC2倍。加入胰蛋白酶并在37°C孵育2-5分钟。 在显微镜下检查细胞的分离。
    2. 通过添加含血清培养基来抑制胰蛋白酶反应。将细胞以350× g 离心4分钟，并将沉淀重悬于维持培养基中。hVSMC遵循1:2的拆分方案。
  5. 要开始钙化实验，请按照分裂说明准备细胞（步骤1.4.1）。重悬后，将细胞和种子计数到48孔板中，密度为10-15 x 103 细胞/ cm2。接种细胞，避免使用外孔，如 补充图1所示。
  6. 让细胞粘附并恢复24小时（过夜），同时在37°C和5%CO2下孵育。
    7. ....

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结果

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结果包括HOECHST染色细胞核的原始图像，RFP标记的钙化和明场图像。可以检测和分析从低（图2）到高（图3）的不同钙化阶段。钙化通常可以使用光学显微镜发现为黑色斑点（图 2D 和图 3B，箭头表示钙化），这对于初步评估和确定何时开始影像学检查很有用。为了提高信噪比，应分析处理后的RFP图像以量化钙化（图2F和图3D，箭头表示钙化）。最后，数据可以表示为一个时间点比较两个或多个条件的条形图，并附有代表性图像（图4A，B，C）。数据应按细胞计数标准化显示（例如，作为每个细胞的钙化面积）。数据也可以显示为时间序列数据，显示不同时间点的相同条件（图4D

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讨论

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在本手稿中，我们描述了一种用于 体外 钙化测定的半自动方法。对于这种方法，应优化hVSMC钙化的三个关键步骤。首先，细胞密度对于hVSMC钙化的发展至关重要。由于缺乏细胞间接触以及在钙化条件下诱导的应激，hVSMC的低密度将导致缓慢或无钙化和细胞死亡21。高细胞密度导致过度融合，之后细胞衰老22 ，钙化发育停止。在孔板中播种大约70%的汇合度至关重要，这些汇合度将用于随后的钙化发展，确保hVSMC的增殖能力和细胞连接。

其次，用于钙化诱导的细胞培养基需要优化。在血管钙化研究中，已经报道了多种条件和培养基组成来钙化hVSMCs23，24。我们认为该方法适用于检测各种体外介导的钙化，并且已被用于检测钙，磷酸盐或钙磷酸盐刺激的沉积物。无论钙化诱导的模式如何，钙化介质的优化都是关键。在提出的方案中，我们使用总钙浓度为4.5 mM Ca.......

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披露

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Leon Schurgers获得了拜耳，勃林格殷格翰，纳豆制药和IDS的机构资助。Leon Schurgers拥有Coagulation Profile的股份。Willi Jahnen-Dechent是CALCISCON AG的联合创始人和股东。

致谢

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这项研究由欧盟的地平线2020研究和创新计划资助，根据玛丽·斯克洛多夫斯卡-居里赠款协议第722609和764474，NWO ZonMw（MKMD 40-42600-98-13007）。这项研究得到了BioSPX的支持。WJ-D获得德国研究基金会TRR219项目ID 322900939和项目ID 403041552的资助

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
氯化钙，93%，无水Thermo Fisher Scientific349615000
Costar 6 孔透明 TC 处理孔板康宁3516
Cytation 3 系统BioTek，Abcoude，荷兰
胎牛血清MerckF7524-100ML
胎球蛋白-A-Alexa Fluor-546内部
Gen5 软件 v3.10BioTek
Gibco 培养基 199Thermo Fisher Scientific11150059
Hoechst 33342，三盐酸盐Thermo Fisher ScientificH3570
PBS （10X），pH 7.4Thermo Fisher Scientific70011044
青霉素-链霉素Thermo Fisher Scientific15140122
胰蛋白酶-EDTA （0.05%），酚红Thermo Fisher Scientific25300062
制备

参考文献

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  1. Taylor, A. J., Bindeman, J., Feuerstein, I., Cao, F., Brazaitis, M., O'Malley, P. G. Coronary calcium independently predicts incident premature coronary heart disease over measured cardiovascular risk factors: mean three-year outcomes in the Prospective Army Coronary Calcium (PACC) project. Journal of the American Colleg....

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