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方法文章

药物处理后对肿瘤聚集体内区域细胞密度的无损评估

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DOI：

10.3791/64030

⸱

2022年6月21日

 ,  ,  , 
1Rensselaer Polytechnic Institute, 2Albany Medical College

本文内容

摘要

本方案建立了一种基于图像的快速、非破坏性、无需标记的三维肿瘤聚集体区域细胞密度和活力检测技术。研究结果揭示了细胞密度梯度现象，在发育中的聚集体中，核心区域的细胞密度高于外层区域；而在经曲妥珠单抗处理的HER2+聚集体中，细胞死亡主要发生在周边区域。

摘要

多细胞肿瘤球体（MCTSs）模型在肿瘤研究中的应用价值日益凸显 体外 癌症进展研究和药物发现。这些相对简单的无血管结构模拟了关键的方面 体内 肿瘤，例如三维结构和病理生理梯度。多细胞肿瘤球（MCTS）模型可揭示癌细胞在类球体发育过程中及对药物反应时的行为特征；然而，其所需的尺寸极大地限制了无损检测工具的应用。本研究探索利用光学相干断层扫描（Optical Coherence Tomography）结构成像结合Imaris三维分析软件，实现对MCTS内部区域细胞密度的快速、无损且无需标记的测量。该方法被用于评估MCTS在为期4天的成熟过程以及长达5天的曲妥珠单抗（Trastuzumab）治疗过程中的变化，曲妥珠单抗是一种临床上重要的抗HER2药物。简言之，采用AU565 HER2+乳腺癌细胞构建MCTS 通过 液滴覆盖培养，可选择性添加或不添加Matrigel（基底膜基质），以生成不同形态的细胞聚集体（分别为较厚的盘状2.5D聚集体或扁平的2D聚集体）。在成熟的多细胞肿瘤球体（MCTS）中，对外周区域、过渡区域和内核区域的细胞密度进行表征，结果显示存在细胞密度梯度，核心区域的细胞密度高于外层。基质的添加重新分布了细胞密度并增强了该梯度，降低了外周区域的密度，同时增加了核心区域的细胞紧密度。在药物处理后（0 h、24 h、5天），对逐层深入的100 µm区域内的细胞密度进行量化，以评估药物反应是否存在区域差异。至实验终点时，几乎所有细胞死亡均局限于每个聚集体最外层200 µm范围内，而更深层的细胞则基本未受影响，表明药物反应存在区域差异，可能与药物渗透受限有关。本方案提供了一种独特的非破坏性技术，可用于在高密度细胞组织内对区域性的细胞密度进行量化，并实现纵向动态测量。 关键词：液滴覆盖培养，Matrigel，多细胞肿瘤球体，MCTS，细胞密度梯度，药物渗透，区域异质性，2.5D培养，2D培养

引言

研究人员已广泛转向台式三维培养 体外 用于研究肿瘤进展关键特征的系统。其中大部分研究由多细胞肿瘤球体（MCTSs）以及更为复杂的类器官的重新兴起所推动1,2尽管这些模型是无血管的，但它们为重现生理和病理过程提供了强有力的工具 体内3,4,5特别是中等尺寸的模型（直径300-500 µm）能够模拟肿瘤的关键特征，例如三维结构、病理生理梯度以及由于核心缺氧引发的转移信号。已有充分文献记载，这些模型呈现出在血管化肿瘤中常见的同心层状结构 体内 肿瘤，即外层为增殖细胞，中间为衰老/静息细胞层，核心区域为处于缺氧状态的细胞3,6,7,8,9. 通过表征这些层内细胞在发育过程中以及对药物反应时的行为，可从这些模型中获得独特的见解。然而，要形成使这些模型具有强大功能的梯度，所需的MCTS尺寸是必不可少的 体外 模型，极大地限制了无损评估所采用的工具。事实上，对多细胞肿瘤球体（MTCSs）进行无损分析时，最大的挑战之一就是量化细胞尺度的细节。明场和相差显微镜常规用于无损评估三维MTCSs的生长与发育情况。然而，这些成像模式仅能提供二维投影，无法呈现这些模型关键的三维结构信息。10,11,12,13细胞毒性和细胞增殖信息通常通过荧光成像（如光片显微镜、共聚焦显微镜）或 离体 免疫组织化学染色14,15,16尽管这些方法可提供有关组织结构、细胞密度和细胞功能的宝贵且高分辨率的信息，但通常需要进行光学透明化、固定/染色或包埋等样本处理步骤，从而限制了纵向分析的实施。

光学相干断层扫描（Optical Coherence Tomography, OCT）是一种非破坏性的结构成像技术，有望克服上述部分挑战。该技术具有细胞级分辨率和足够宽的视场（可达10 mm × 10 mm），能够实现对整个多细胞聚集体的可视化观察17,18,19重要的是，由于所用光为可见光，该技术完全无需破坏样品，也无需标记17此外，还可以对样品进行成像 原位 无需样品制备，样品可直接从培养箱中取出，快速进行OCT扫描（扫描时间约5–10分钟），随后立即放回培养箱，从而实现对样品的纵向表征。近年来，越来越多的研究尝试利用OCT分析肿瘤类球体的行为。在最具突破性的研究之一中，Huang等利用OCT无损检测了大型肿瘤类球体模型中的坏死核心，发现活细胞与死细胞区域在光学衰减特性上存在可区分的差异，该差异可用于无标记的细胞活力监测。20类似地，Hari 等人利用光学相干断层扫描（OCT）成像人结肠癌（HCT116）类球体，并对其折射率（RI）进行测量，以研究样本内缺氧的存在情况21他们的测量结果尚不足以支持直接推论，但他们确实观察到折射率较低的区域与坏死核心的位置（而非大小）相关，该发现在此后得到确认 通过 共聚焦显微镜。Abd El-Sadek 等人采用光学相干断层扫描（OCT）对乳腺癌肿瘤模型的区域性组织活力进行可视化与定量分析22他们报告了两种基于OCT的方法用于可视化组织动态，并显示这些指标的差异与显微镜识别的活/死细胞区域之间存在中等程度的相关性。

我们已发表的研究基于上述前期文献，利用光学相干断层扫描（OCT）建立了一种定量、非破坏性的方法，用于在乳腺癌多细胞肿瘤球体（MCTS）模型发育过程中测量其三维形态和细胞数量10,23使用 Imaris 3D 渲染图像分析软件对 OCT 体积扫描图像中细胞尺寸的物体（即斑点）进行计数，以无损方式测量 MCTSs 中的细胞数量，结果在统计学上与通过其他方法确定的细胞数相似 通过 在聚集体解离后使用血细胞计数板进行计数。然而，由于OCT的结构特性，细胞发生坏死性死亡后仍可能残留细胞膜，从而被误判为活细胞。此外，该表征方法已进一步应用于非破坏性地追踪单个聚集体在药物处理过程中的细胞活力，并取得了良好的效果。10重要的是，我们注意到，采用OCT-Imaris方法所获得的细胞活力结果，与这些样本经解离后测得的基准值相似。这种非破坏性、无标记的细胞分析方法能够在不破坏三维结构或致密细胞聚集体的前提下，对其中的细胞进行纵向计数。

本研究报道了一种改进的方法，通过利用OCT-Imaris在测量三维聚集体形态和细胞数量方面的能力，直接量化致密聚集体内的区域细胞密度。该方法学进展可更详细地揭示细胞在多细胞肿瘤球（MCTSs）模型典型同心层结构中的空间分布与增殖情况。与仅计算聚集体整体平均细胞密度不同，此类局部密度测量能够揭示与压缩等过程相关的细胞密度梯度。该区域性评估方法还被应用于经化疗药物处理的聚集体，以通过局部细胞密度的变化来评估区域性的药物反应。结合光学相干断层扫描（OCT）与先进的成像分析方法，可对区域细胞活力进行量化，进而可用于探究药物渗透性——依据是哪些区域出现了细胞密度的下降。这是首次在致密细胞组织中无创地量化药物作用下区域细胞密度与活力，并进行纵向测量。对整个MCTSs中三维细胞密度及其空间分布的此类表征，可能有助于优化癌症治疗中的药物递送，并加深对癌症模型进展过程的理解。

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方案

本研究使用了AU565（HER2+）和MDA-MB-231乳腺癌细胞系（见材料表）。

1. 制备肿瘤聚集体

  1. 制备AU565（HER2+）乳腺癌细胞培养用生长培养基，使用含L-谷氨酰胺的罗氏公园纪念研究所（RPMI）1640基础培养基（+），并添加10%（v/v）胎牛血清和1%青霉素/链霉素（参见 材料表).
  2. 使用杜氏改良伊格尔培养基（DMEM），添加10%（v/v）胎牛血清（FBS）、100 U/mL青霉素/链霉素和2 mM L-谷氨酰胺，制备MDA-MB-231三阴性乳腺癌细胞生长培养基（参见 材料清单).
  3. 在标准条件下培养两种细胞系，使其细胞汇合度达到70%–90%（准备时间约3–4天）37 °C，5% CO2，95% 相对湿度）。按照标准的胰蛋白酶消化法，将细胞单层从培养瓶中分离。
    注意：避免细胞过度暴露于胰蛋白酶中，以免影响其活力。
    1. 对于AU565细胞，使用移液管（或如有条件，使用连接的真空泵）吸除培养瓶中的培养基 通过 将管路连接至已灭菌的玻璃移液管尖端，并加入2 mL胰蛋白酶-EDTA。室温下静置3分钟，随后放入培养箱中继续孵育4分钟。之后向培养瓶中加入6 mL培养基以中和胰蛋白酶。
    2. 对于 MDA-MB-231 细胞，以与步骤 1.3.1 相同的方式吸除培养瓶中的细胞培养基，并加入 1.5 mL 胰蛋白酶-EDTA。孵育 7 分钟后，向培养瓶中加入 8.5 mL 完全培养基以中和胰蛋白酶。
  4. 添加 10 µL 将细胞悬液加入血细胞计数板，以确定悬液中的细胞数量24. 用培养基重悬细胞，调整至所需的浓度 2.5 × 105 cells/mL
  5. 分配 50 µL 将细胞悬液加入至圆底非黏附性96孔板的每孔中。对于未使用Matrigel（基底膜基质，参见 材料清单），加入 50 µL 向每个孔中加入普通培养基。
    1. 对于使用基底膜基质制备的悬浮液，从 -20 °C 储存并置于冰箱中过夜解冻。准备一个含有培养基的容器，并冷藏10分钟以降温。
    2. 使用预冷的移液器吸头，将基质加入预冷的培养基中，使该溶液的终浓度为5%。加入 50 µL 向每孔加入该培养基，使这些孔中基质的终浓度为2.5%3.
      注意：在先前的研究中，已对这些细胞系的聚集体形态进行了评估10,25，发现加入膜基质后，MDA-MB-231 细胞聚集体形成球形结构，而未添加基质的 MDA-MB-231 培养物以及 AU565 细胞（无论是否添加基质）均形成盘状聚集体。对球形度进行定量分析的 >0到1.0（0表示平面，1.0表示完美球体）的球形度阈值设为0.8，用于识别足够接近球形的聚集体，从而确保其具备所需的表面积与体积比 体内类行为26,27.
  6. 将培养板在 123 x g 条件下离心 g 在接种后立即于室温下离心10分钟，以确保每个孔底部形成细胞沉淀。
    注意：此步骤应在接种后尽快进行。作者观察到，若两步之间间隔时间过长，细胞会沉降并附着于孔板各孔的底部及侧壁，从而抑制其在孔底聚集和形成聚集体的能力。
  7. 将培养板孵育 4 天，此时细胞聚集体被认为已成熟。
    注意：使用基底膜基质制备的AU565细胞聚集体需额外延长5天培养时间用于药物反应研究（总计9天，第4天更换培养基）。

2. 向 AU565 细胞聚集体施用曲妥珠单抗（TZM）

  1. 在AU565生长培养基中配制500 µg/mL的TZM溶液（参见材料表）。在第4天，向每孔加入10 µL该溶液，使每孔终浓度为50 µg/mL。
  2. 加入TZM后继续培养聚集体5天，并在关键时间点进行评估。
    ​注意：本研究中，分别在给药前0 h、给药后24 h和120 h的时间点分析药物作用。

3. 光学相干断层扫描成像

注意：本研究中的样品在成熟过程的每一天（第1-4天）均采用光学相干断层扫描（OCT）进行成像，随后在选定的加药聚集体中，于第5天（加药后24小时）和第9天（加药后120小时）再次进行成像。本研究使用了一种商用的谱域光学相干断层扫描（SDOCT，参见材料表）系统进行OCT成像。尽管该方法适用于几乎任何OCT系统，且不同系统之间的操作流程总体相似，但以下某些具体步骤是针对当前所用设备的。

  1. 使用 OCT 系统进行结构成像。将 A 扫描速率设置为 5.5 kHz，以实现高分辨率图像采集。对于液体介质中的样品，将折射率设置为 1.33。体素尺寸设置为 1.10 × 1.10 × 2.58 µm3。
  2. 在屏幕右侧的图像参数窗口中，通过输入 X、Y 和 Z 值（单位为 mm）来设定视场（FOV），确保样品位于该兴趣区域内。
    注意：本研究中视场通常设置为 1.5 × 1.5 × 0.5 mm3。通过将“角度”输入值在 0 和 90 度之间切换并进行视觉确认，确保样品完全位于该区域内。
  3. 单击3D 采集模式，然后单击记录，以采集样品的三维体积扫描数据。

4. 图像分析

  1. 将 OCT 文件导出为软件格式（Imaris，参见 材料表).
    1. 在软件开发工具包中打开 OCT 文件。点击 导出，将文件类型设置为 .jpg，并将图像导出到一个空文件夹中。
    2. 打开图像处理软件（FIJI，参见 材料列表) 并从存储导出的 JPEG 图像的文件夹中导入图像序列。使用软件将图像序列拼接成完整图像，然后将该文件保存为 TIFF 图像。
  2. 按照以下步骤创建体积重建。
    1. 打开 Imaris 软件，在 Arena 中导航至已转换的 TIFF 文件。前往 编辑 > 图像属性 并输入体素大小（以 µm) 从OCT图像中提取并填入相应的XYZ坐标框中。然后，点击 好的.
      注意：在屏幕左侧的样本对象树中，取消选中 体积 切换以防止软件延迟。
    2. 点击 添加新表面 对象树上方。在树下方的菜单中，单击 跳过自动创建 并手动编辑。在 显示调节 窗口中，手动滑动红色和黑色箭头，以增强样本与背景之间的对比度，改善样本的可视化效果。
    3. 将“切片位置”调整至样本边缘的切片处，即样本信号首次出现的位置。按下 Esc 键将鼠标从导航模式切换至选择模式，然后单击 绘制. 手动勾画出显示信号的区域轮廓。
    4. 通过在输入框中输入下一个位置来推进切片位置。下一个位置必须比前一个位置向样本内部推进不超过100个切片。手动勾画显示信号的区域。
    5. 重复步骤 4.2.4，贯穿样品的整个厚度，直至到达样品的对侧边缘。然后，单击 创建表面 在左侧菜单中拼接这些切片，以完成体积重建。
    6. 点击 编辑，然后点击 口罩选择这将在显示调整窗口中创建一个新通道，仅包含被分离的样本。现在可在此处获取样本的形态学特征 统计学 > 详细 表。
      注意：本研究中报告的球形度和体积均采用此方法测定。
  3. 按照以下步骤获取样品的总细胞密度。
    1. 在对象树上方，选择 添加新斑点. 在 算法设置 菜单，取消选中所有复选框。单击 蓝色箭头 进入源通道界面。
      1. 从出现的下拉菜单中选择在步骤 5.2.8 中创建的掩膜通道，通常命名为 Channel 2。在 XY 直径框中输入样品的平均细胞直径。确保 背景扣除 进行检查。
        注意：本实验使用 AU565 和 MDA-MB-231 细胞，直径设定为 10 µm. 此选择基于细胞大小（详见讨论部分）。
    2. 点击 蓝色箭头 移动到 分类斑点 屏幕。在菜单底部的图表中，点击并拖动黄色阈值的左边缘至图表的左边缘，使所有对象均包含在黄色阴影阈值范围内。然后，点击 绿色箭头 完成斑点的制作。
    3. 点击以获取已识别对象的数量（即，样本细胞计数） 统计学 > 总体 > 斑点总数.
    4. 为确定聚集体的平均细胞密度，将聚集体的细胞数（步骤 4.3.3 中测得）除以聚集体体积（步骤 4.2.6 中确定）。
  4. 评估球形聚集体同心层中的区域密度图1A).
    1. 在完成形态学和细胞密度分析后，评估区域密度。单击第 4.2.5 步中创建的表面并导航至 表面样式/质量 选项卡。更改选择为 中心点 并将像素宽度更改为 ≤20 以获得最佳可见性。导航至 统计学 > 详细 > 位置 并记录中心点的位置。
    2. 选择 添加新的参考坐标系 从对象树上方的菜单中。选中 可见 和 固定 菜单中 XY 旁边的方框。点击并拖动参考系图标的中心，使其与中心点对齐。取消选择 XY 可见 和 固定 盒子并选择它们以进行 XZ。
      1. 再次点击并拖动参考系图标的中心，使其与中心点对齐。最后，对 YZ 平面重复此操作，交替在这三个固定平面之间切换，直至参考系与中心点完全对齐。在对象树中双击参考系，并将其重命名 中心 或 相似.
    3. 单击步骤 4.3 中创建的斑点并导航至 统计学 > 详细 > 位置参考系. 点击 参考坐标系 X 的位置 直到数值从高到低排序为止。记录最大值——该值表示样品的最远边缘，即样品半径。
      注意：由于此处使用的样品在 XY 平面上呈圆形，因此沿 X 轴或 Y 轴进行计算均可获得相似结果。对于不具有 X-Y 对称性的样品（如不对称、椭球形、不规则几何形状等），建议沿多个轴向进行此类分析。
    4. 导航至统计。在菜单右下角，单击 将所有统计结果导出至文件 并将数据保存到电子表格中。
    5. 通过手动计算确定沿 X 轴的同心层。
      注意：本研究中使用的样本量约为 500 µm 直径；因此，有两个外侧 200 µm 厚的同心环和一个内部区域 100 µm 较厚的中央区域。建议保持这些区域 200 µm 较厚，因为扩散行为预计会随着这一距离而发生变化7,28,29,30因此，建议对较大的样本使用更多同心区域，而对较小的样本则相反。
    6. 设置 A 200 µm 通过相减获得外层区域 200 µm 从步骤 4.4.3 中找到的外半径起算。因此，外周区域将包含 X 位置介于 X 之间的斑点半径 和 X外侧，内侧边缘 (图1A，橙色区域）。
    7. 通过减去设定一个过渡区域 200 µm 来自 X外侧，内侧边缘. 这一过渡区域将包含X位置介于X之间的点外侧，内侧边缘，和 X过渡区，内边缘 (图1A，粉红色区域）。
    8. 设定一个中心核心区域，涵盖样本中心与X之间剩余的点位过渡区，内边缘 (图1A，蓝色区域）。
    9. 打开在步骤 4.4.4 中创建的已保存电子表格文件。转到“距原点距离参考系”选项卡。
    10. 使用函数“COUNTIF（列”计算核心区域中的斑点数量x, "< X过渡区，内边缘"），其中列x 是“距原点参考坐标系的距离”列。所得数值为此区域中的细胞数量。将该数值除以区域体积，得到细胞密度。
    11. 以类似方式，使用“COUNTIF（列”计算过渡区域中的细胞数量x, "< X外侧，内侧边缘") - COUNTIF（列x, "> X过渡区，内边缘").
    12. 使用“COUNTIF（列”计算外周区域的细胞数量x,"> X过渡区，内边缘").
  5. 评估非球形样本中的区域细胞密度 通过 区域塞图1B).
    注意：对于不具有同心层结构的非球形样品，已开发出“区域塞”法，以在聚集体的不同径向深度处采样局部细胞密度。
    1. 重复步骤 4.4.1–4.4.3 以设定中心参考帧图1B，中央黄色圆圈）并获取总样本半径。
    2. 通过手动计算确定参考框架在过渡区和外周区域内的位置，以便在这些位置评估样本中的细胞密度。
      1. 计算外侧位置时，用减法 50 µm 根据步骤4.5.1得到的样本半径值，并将该值用作X位置。
        注意：对同一样本内的所有凝胶柱，使用在步骤 4.5.1 中记录的相同 Y 和 Z 位置值，以沿样本的 X 轴方向测量细胞密度。图1B，最左侧的黄色圆圈。
      2. 在对象树上方，单击 添加新斑点 并点击 跳过自动创建，手动编辑. 将指针置于“选择”模式，按住 Shift 键并单击，在屏幕上放置一个标记点。在左侧菜单中输入上述计算得到的 XYZ 位置值。将 XY 和 Z 方向的直径调整至 ≤20，以获得最佳可见度。
      3. 重复步骤 4.4.2，在此位置添加一个参考坐标系。在对象树中将此参考坐标系重命名为 outer 或类似名称。
      4. 为计算过渡点（中点）位置，求 X 的平均值中心 位置值和 X外层 位置值。将该值用作过渡参考帧的 X 位置。与上述步骤相同，对同一样本内所有栓塞样本使用步骤 4.5.1 中记录的相同 Y 和 Z 值，以测量样本 X 轴方向上的细胞密度（图1B，中间黄色圆圈）。
      5. 重复步骤 4.4.2，将中间参考框架置于该位置，创建后将其重命名为“过渡”或类似名称。
    3. 单击步骤 4.3 中创建的位点并导航至 统计学在菜单的右下角，单击 将所有统计结果导出至文件 并将数据保存到电子表格中。
    4. 打开电子表格，导航至“距原点参考系距离”工作表。每件物体到各参考系的距离显示在 A 列，每件物体的参考系分组显示在 G 列。使用“MOD”函数将每个距离数值分配至其对应的参考系，其中 0 为中心参考系，1 为过渡参考系，2 为外层参考系。
    5. 筛选此列中的数值，以处理每个参考系中的距离。对于每个参考系，使用函数“COUNTIF（列”计算位于该参考系50微米范围内的对象数量。x, "≤50"），其中列x 是每个组的“距原点参考坐标系的距离”列。所得值对应于该区域凝块中的细胞数量。将该值除以100-μm 插上插头以获取细胞密度。
  6. 执行空间精细区域插件法（Spatially-Refined Regional Plug method）图1C).
    注：该方法用于评估药物施加后区域细胞活力的变化。增加参考帧的数量可提高在整个模型厚度范围内可计算的细胞密度的分辨率。
    1. 重复步骤 4.4.1–4.4.3 以设定中心参考帧（图1C，中央黄色圆圈）并获取样本半径。
    2. 通过手动计算确定其他感兴趣的位点。为此，添加 100 µm 到 X中心 值，然后使用中心点的 Y 和 Z 值来定义中心轴上的第一个位置。在此位置添加参考坐标系，如步骤 4.4.2 所述。图1C，中心圆旁边的黄色圆圈。
      注意：添加更少量 µm 在此步骤中，若需实现更高分辨率的密度追踪。
    3. 重复步骤 4.6.2，加入 100 µm （或所需数量） µm) 依次分配至每个X轴位置，以在样品厚度方向上建立一系列等距的圆柱形组织样本。将最后一个参考框架置于≤50 µm 远离样品的外半径（图1C，黄色圆圈。
    4. 重复步骤 4.5.3–4.5.5，以获得每个区域内的细胞计数 100 µm 直径的圆柱样本。将这些数值除以相应圆柱样本的体积，以获得局部细胞密度。
    5. 对药物试验中每个时间点采集的 OCT 数据重复本节中的所有步骤。通过治疗过程中的每个时间点比较各位置的细胞数量，可以揭示细胞密度下降的位置（即发生细胞死亡的区域），并由此推断药物渗透的深度（即哪些层次出现细胞密度下降） 与. 那些维持或表现出细胞密度水平增加的细胞。

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图 1：示意图。 （A）用于评估球形聚集体中区域细胞密度的同心层（壳层）方法。（B）区域插件法用于评估非球形聚集体中的局部细胞密度，其中小的（直径 100 µm）球形插件（黄色显示）作为每个区域/厚度的密度指标。（C）空间精细的区域插件法用于药物渗透研究。请点击此处查看此图的放大版本。

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结果

在之前的一项研究中，已建立一种利用光学相干断层扫描（OCT）无损测量细胞聚集体内整体细胞密度的方法10。本文进一步拓展该技术，用于评估发育中细胞聚集体的区域性细胞密度。图1展示了该方法的扩展示意图，其中可通过分析类球体的同心层，或更局部地通过分析直径为100 µm的小型球形区域（如图1B、C中黄色圆圈所示）来评估细胞密度。首先对MDA-MB-231肿瘤类球体进行评估，在聚集体内设定一个中心点，并逐层统计同心层中的细胞/物体数量。结果如图2所示。Student's t检验显示，类球体核心区域的细胞密度显著高于过渡层（p = 4.3e-4）和外层（p = 4.0e-6）。该结果表明，在培养4天后，类球体核心发生了明显的压缩。

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讨论

意义
多细胞肿瘤球体（MCTSs）是研究肿瘤进展和药物筛选的强大三维体外模型1,2,3。提升这些相对简单的聚集体模型的应用价值，在很大程度上依赖于对其关键特征（如形态和细胞密度）的表征，因为这些特征已知会影响肿瘤模型的进展及治疗反应。然而，其必要的尺寸给这些特性的评估带来了挑战，尤其是非破坏性分析方面。本文介绍的方法提供了一种新的工具，可用于对致密三维聚集体模型中特定区域的细胞密度和活力进行无标记、纵向的定量分析。同一聚集体可在多个发育时间点重复进行光学相干断层扫描（OCT）成像。这些三维扫描数据可用于分析MCTS成熟过程中细胞密度在空间上的演变规律。相同原理也适用于药物处理后的聚集体分析，可在整个给药过程中进行纵向成像，以确定细胞密度下降的区域，即药物可能正在杀伤细胞的部位。该方法显著优于以往获取类似细胞尺度信息的传统方法，后者通常需要固定、染色和/或切片，因而无法实现纵向分析。事实上，...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由美国国立卫生研究院（NIH）R01 BRG CA207725（MB/DTC）和 NIH R01 CA233188（MB）资助。我们感谢 AMC 药房为本实验提供的曲妥珠单抗（Trastuzumab）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
96 孔板Greiner Bio-One 650970CellStar 防细胞黏附表面，https://shop.gbo.com/en/usa/products/bioscience/cell-culture-products/cellstar-cell-repellent-surface/
0.25% 胰蛋白酶，2.21 mM EDTACorning25-053-CI
AU565 乳腺癌细胞ATCC
杜尔贝科改良伊格尔培养基（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）Corning10-013-CV
胎牛血清ATCC30-2020
FIJI 软件开源(Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j从 https://imagej.net/software/fiji/ 下载
血细胞计数板Fisher Scientific0267151B
Imaris 图像分析软件Bitplane当前版本 9.8
L-谷氨酰胺Lonza17-605E
MatrigelCorning354263
MDA-MB-231 乳腺癌细胞ATCC
显微镜ZeissZ1 AxioVision
青霉素-链霉素Corning30-0002CI
平板离心机Eppendorf
RPMI 1640 培养基Gibco11875-085
谱域光学相干断层扫描仪（Spectral Domain Optical Coherence Tomography）ThorLabsTEL220C1
T75 细胞培养瓶Greiner Bio-One 658175
曲妥珠单抗本研究使用了曲妥珠单抗的剩余临床样本，由中国台湾奥尔巴尼医学院药房慷慨提供。 

参考文献

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