本文介绍了一种制备干燥大孔海藻酸盐支架的方案，该支架可介导高效的病毒基因转导，用于T细胞的基因工程改造，包括用于CAR-T细胞治疗的T细胞。研究表明，该支架对活化的原代T细胞的转导效率超过>85%。
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摘要
摘要
近年来，用于CAR-T细胞治疗的T细胞基因工程已成为癌症治疗的前沿技术。CAR-T细胞通常通过将病毒介导的基因转移至T细胞中来制备。目前病毒基因转移的金标准方法是使用逆转录病毒结合素（retronectin）包被的培养板进行离心转导（spinoculation），但该方法成本高且耗时。因此，亟需开发高效且经济的CAR-T细胞制备方法。本文介绍了一种制备低成本、干燥大孔海藻酸盐支架（称为Drydux支架）的方法，该支架可高效促进活化T细胞的病毒转导。该支架可用于替代金标准的、接种病毒的retronectin包被板的离心转导法，从而简化细胞转导流程。海藻酸盐通过与钙-D-葡萄糖酸盐交联，并经 overnight 冷冻形成支架前体，随后在冻干机中冻干72小时，完成干燥大孔支架的制备。当病毒与活化T细胞共同接种于支架表面时，支架即可介导病毒基因转移，从而生成基因修饰细胞。该支架可实现>85%的原代T细胞转导效率，与retronectin包被板上离心转导的效率相当。结果表明，干燥大孔海藻酸盐支架可作为传统转导方法的一种更廉价且更便捷的替代方案。
引言
免疫疗法因其能够特异性靶向肿瘤、限制脱靶细胞毒性并预防复发，已成为一种革命性的癌症治疗范式。其中，嵌合抗原受体T细胞（CAR-T细胞）疗法因在治疗淋巴瘤和白血病方面取得的成功而备受关注。美国食品药品监督管理局（FDA）于2017年批准了首个CAR-T细胞疗法，此后又陆续批准了四种CAR-T细胞疗法。1,2,3,4,5CARs 具有一个抗原识别域，通常由单克隆抗体的单链可变区片段组成，该片段特异性识别肿瘤相关抗原3,4当CAR与肿瘤相关抗原相互作用时，CAR-T细胞被激活，从而引发抗肿瘤反应，包括细胞因子释放、细胞毒性脱颗粒、转录因子表达以及T细胞增殖。为制备CAR-T细胞，需采集患者的血液以获取其T细胞，并通过病毒载体将CAR基因导入患者的T细胞中。随后对CAR-T细胞进行扩增培养 体外 并回输至患者体内2,3,4,6CAR-T细胞的成功制备取决于转导效率，该指标描述了被遗传修饰为CAR-T细胞的T细胞数量。
目前，CAR-T细胞制备的金标准是在纤维连接蛋白（retronectin）包被的培养板上对活化的T细胞和病毒进行离心转导（spinoculation）7,8。当病毒颗粒与T细胞表面结合时，转导过程即开始。纤维连接蛋白通过提高病毒颗粒与细胞之间的结合效率，促进病毒与细胞的共定位，从而增强转导效率7,8。纤维连接蛋白单独使用效果不佳，需结合离心转导，后者通过浓缩病毒颗粒并增加T细胞的表面通透性，促进病毒更易感染细胞，从而提高基因转移效率8。尽管在纤维连接蛋白包被板上进行离心转导已取得成功，但该过程较为复杂，需要多次离心步骤和昂贵的试剂。因此，开发更快速、更经济的病毒基因转移替代方法具有重要意义。
海藻酸盐是一种天然的阴离子多糖，因其成本低、安全性好，并且在与二价阳离子混合后能够形成水凝胶，而在生物医学领域得到广泛应用9,10,11,12。海藻酸盐是一种符合药品生产质量管理规范（GMP）的聚合物，并被美国食品药品监督管理局（FDA）普遍认为是安全的（GRAS）13。通过阳离子交联海藻酸盐可形成稳定的水凝胶，常用于伤口愈合、小分子化学药物和蛋白质递送以及细胞运输9,10,11,12,14,15,16。由于其优异的凝胶性能，海藻酸盐是通过冷冻干燥法制备多孔支架的首选材料10,17。这些特性使海藻酸盐成为制备可介导活化细胞病毒基因转导支架的理想候选材料。
本文介绍了一种制备干燥大孔海藻酸盐支架（称为Drydux支架）的方案，该支架可通过病毒基因转移实现T细胞的静态转导17,18。该支架的制备流程见图1。此类支架无需使用离心接种法处理纤连蛋白包被的培养板。大孔海藻酸盐支架可促进病毒颗粒与T细胞之间的相互作用，从而在单步操作中实现高效的基因转移，同时不影响工程化T细胞的功能性和存活率17。若操作正确，此类大孔海藻酸盐支架的转导效率至少可达80%，显著简化并缩短了病毒转导过程。
图1：实验方案示意图与时间线。（A）制备干燥大孔海藻酸盐支架的时间线。海藻酸盐与D-葡萄糖酸钙交联后，过夜冷冻。将冷冻的支架冻干72小时，以制得Drydux支架。（B）活化细胞的病毒转导时间线。将活化后的细胞与病毒（MOI为2）接种于支架表面，并在添加IL-7和IL-15的完全培养基中孵育。支架可吸收混合液并促进病毒基因转移。使用EDTA溶解支架以分离转导后的细胞。用PBS洗涤两次后，细胞沉淀可用于后续分析。缩写：PBS = 磷酸盐缓冲液；PBMCs = 外周血单个核细胞。请点击此处查看该图的放大版本。
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方案
所有涉及人原代细胞和逆转录病毒载体的操作均遵循北卡罗来纳州立大学的生物安全指南，并已获得环境健康与安全部门的批准。人外周血单个核细胞从商业来源购买，形式为血沉棕黄层。人原代细胞必须从人血沉棕黄层组分中分离获得，且操作需具备生物安全二级（Biosafety Level 2）许可，并遵循所在机构的详细标准操作程序及获得相应批准。病毒载体（包括用于转导的逆转录病毒载体上清液，其制备方法如先前所述19）根据所编码的蛋白质，可被归类为生物安全一级（Biosafety Level 1）或生物安全二级（Biosafety Level 2），并须获得相关机构生物安全委员会的批准。
1. 制备大孔海藻酸盐支架
- 通过在烧杯中将无菌过滤的去离子水加入D-葡萄糖酸钙，配制0.4%（质量/体积）的D-葡萄糖酸钙储备液。以中等速度搅拌直至D-葡萄糖酸钙完全溶解（约1.5小时），然后进行无菌过滤，并于室温下保存。
注意：无需检测该溶液的pH值。 - 在带螺口盖的小瓶或烧杯中配制2%（质量/体积）的海藻酸钠溶液。小心地将超纯海藻酸钠加入容器中，再加入无菌过滤的去离子水。选择尽可能大但不影响混合的搅拌子，并将其加入容器中。
注意：本实验方案所用超纯海藻酸钠的类型信息可参见材料表及Novamatrix公司网站20。本研究未探索不同类型的海藻酸钠，因其可能导致支架孔隙率和生物相容性发生不期望的变化9,10,11。 - 高速搅拌溶液直至海藻酸钠完全溶解（约1小时）。若容器壁上有较大结块，可倾斜容器使其脱落。少量附着在壁上的海藻酸钠在搅拌过程中会逐渐溶解，无需担心。
注意：无需检测该溶液的pH值。 - 待海藻酸钠完全溶解后，降低搅拌速度，缓慢向海藻酸钠溶液中加入等体积的0.4% D-葡萄糖酸钙溶液，以防止形成交联结块，随后剧烈搅拌15分钟。
- 将烧杯或小瓶倾斜，以去除可能形成的结块。
注意：建议使用均质器。最终溶液应呈光学透明状态。 - 用移液器将所需体积的溶液加入48孔板或24孔板的每个孔中。48孔板每孔加300 µL，24孔板每孔加1 mL。浇注时应缓慢操作，并频繁更换吸头，因为溶液黏稠，容易粘附在吸头表面。
- 盖上板盖，于-20 ˚C冷冻过夜。
- 将板从冻干机中取出，去掉盖子，用擦拭纸和橡皮筋固定顶部，然后将板放入750 mL至2,000 mL的冻干瓶中，置于冻干机中冻干72小时。
- 72小时后，从冻干机中取出板，重新盖上盖子。密封板并储存在4 ˚C。如需长期保存，应在4 ˚C储存前对板进行真空密封。使用前保持干燥。
注意：由于体积误差（部分溶液会粘附在小瓶壁或移液器吸头表面），建议多配制一些钙-海藻酸钠溶液。例如，若需在24孔板中制备4个支架，理论上需要4 mL混合溶液（2 mL海藻酸钠 + 2 mL D-葡萄糖酸钙），但建议配制2.5 mL的2%海藻酸钠溶液和2.5 mL的0.4% D-葡萄糖酸钙溶液。
2. 转导
- 使用 100 kDa 滤膜浓缩病毒上清液
- 用 1 mL 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）水化离心过滤管 2 分钟，弃去 PBS。
- 将 2 mL 病毒悬液（1 × 106 TU/mL）加入离心过滤管中，使用水平转子在 1,500 × g 条件下离心 10 分钟，以浓缩病毒悬液。
注意：每个支架需要 100–200 微升浓缩病毒。 - 若浓缩后的病毒悬液体积大于 200 µL，可再额外离心数分钟。
- 对每个支架重复步骤 2.1.1–2.1.3。
注意：也可先大量浓缩病毒，再从浓缩储备液中取 100–200 µL 分装使用。
- 将活化细胞与病毒共同接种。
- 对每个支架，取 1 × 106 个活化的外周血单个核细胞（PBMCs），重悬于 50 µL 完全细胞培养基中（250 mL Click's 培养基 + 250 mL RPMI 1640 培养基 + 50 mL 胎牛血清 + 5 mL 谷氨酰胺替代物 + 5 mL 青霉素/链霉素）作为分装液。
注意：PBMC 活化方法详见 补充文件 1。 - 将浓缩的病毒上清液（约 2 × 106 TU，MOI 为 2）加入细胞悬液中。细胞-病毒混合悬液的总体积不应超过 48 孔支架的 200 µL 或 24 孔支架的 350 µL。
- 将细胞-病毒混合液逐滴加至干燥支架的表面。对于阴性对照实验，用完全细胞培养基替代浓缩病毒，并将细胞悬液加至干燥支架表面。
- 对每个支架重复步骤 2.2.1–2.2.3。
- 将支架置于 37 ˚C 细胞培养箱中孵育 45–60 分钟。孵育期间，支架将完全吸收溶液。
- 为诱导细胞增殖，向每孔中加入含 IL-15（5 ng/mL）和 IL-7（10 ng/mL）的完全细胞培养基；也可使用 IL-2。每块 48 孔支架加 500 µL，每块 24 孔支架加 1 mL。
- 在 37 ˚C 下继续孵育 72 小时。随着细胞增殖，培养基颜色将变为橙色。
- 对每个支架，取 1 × 106 个活化的外周血单个核细胞（PBMCs），重悬于 50 µL 完全细胞培养基中（250 mL Click's 培养基 + 250 mL RPMI 1640 培养基 + 50 mL 胎牛血清 + 5 mL 谷氨酰胺替代物 + 5 mL 青霉素/链霉素）作为分装液。
- 从支架中分离细胞用于分析。
- 将 0.5 M EDTA 用 1× PBS 稀释为 0.25 M EDTA。
- 移除每个孔中的多余培养基，并分别收集至 15 mL 离心管中。
- 为从支架中分离细胞，向每个支架中加入 0.25 M EDTA。48 孔支架每孔加 300 µL，24 孔支架每孔加 1 mL。静置或轻柔振荡 3–4 分钟。
- 当支架大部分溶解后，在孔内轻柔吹打数次。可能需要多次吹打才能完全溶解支架。若 10 分钟内未完全溶解，可再加入 200 µL 0.25 M EDTA。
- 待支架完全溶解后，将溶液转移至 15 mL 离心管中。
- 对每个支架重复步骤 2.3.4 和 2.3.5。
- 通过向每个离心管中加入 12 mL PBS 并在 400 × g 条件下离心 5 分钟，洗涤细胞两次。每次离心后，管底将形成细胞沉淀。吸除上清液并重复洗涤一次。每次洗涤时务必彻底吸除上清液，以确保完全去除 EDTA。
- 完成第二次 PBS 洗涤后，细胞沉淀即可用于后续分析。请根据具体分析需求选择相应的实验流程。
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结果
这些大孔海藻酸盐支架易于制备，经冷冻干燥后应呈现为多孔、蓬松且呈白色的圆盘状。尽管本实验未对此进行研究，但可根据使用者需求，将钙-海藻酸盐溶液浇铸至不同模具中，以制备出不同形状的支架。9,10支架具有静电，可能会粘附到培养板的盖子上或戴手套的手指上。 图2 展示了支架完成后的预期形态。图中还显示了24孔和48孔支架的大致尺寸。
图 2：...
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讨论
CAR-T细胞疗法在科研和商业应用领域持续受到关注。尽管CAR-T细胞疗法在治疗血液系统癌症方面已取得成功，但其高昂的治疗成本限制了广泛应用。本文介绍了一种无需使用离心接种（spinoculation）预包被retronectin的培养板即可实现T细胞病毒基因转导的新方法。制备用于介导转导的干燥大孔海藻酸盐支架相对简单，是传统方法的一种合适的低成本替代方案。
支架的外观偶尔可能与图示中的不同 图2 可能呈现透明或结晶状，而非白色蓬松状。这可能是由于在-20 ˚C冷冻时温度不一致所致，例如冰箱门频繁开启，或待冷冻的培养板紧邻或放置在冰箱内体积较大的物品之上而受到隔热影响。尽管外观存在差异，但本实验室在使用结晶状支架时，并未观察到转导效率有任何差异。尽管此前关于冷冻凝胶化的研究曾采用更低的冷冻温度24,25我们发现，在较低温度下冷冻会导致支架的外观和功能一致性较差，不如在 -20 ˚C 冷冻时稳定。在 -80 ...
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披露
P.A. 和 Y.B. 是与使用生物材料生成 CAR-T 细胞治疗药物相关专利的发明人。Y.B. 获得了一项与 CAR-T 细胞治疗技术相关的产业资助研究基金（与本研究无关）。 其余所有作者声明不存在竞争利益。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院通过资助编号 R37-CA260223 和 R21CA246414 资助。我们感谢北卡罗来纳州立大学流式细胞术核心设施在流式细胞术分析方面的培训与指导。示意图使用 Biorender.com 制作。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.5 M EDTA | Invitrogen | 15575-038 | UltraPure，pH 8.0 |
| 1x DPBS | Gibco | 14190-144 | 不含氯化钙或氯化镁 |
| 含亚甲蓝的3%乙酸 | Stemcell Technologies Inc | 07060 | |
| 活化的外周血单个核细胞 | - | - | 新鲜或冻存 |
| 葡萄糖酸钙 | Alfa Aesar | A11649 | |
| CD28.2 抗体 | BD | 555725 | 1 mg/mL |
| CD3 抗体 | Miltenyi | 130-093-387 | 100 μg/mL |
| Click's 培养基 | FUJIFILM IRVINE SCIENTIFIC MS | 9195 | |
| 去离子水 | - | - | |
| Glutamax | Gibco | 35-050-061 | |
| HyClone FBS | Cytvia | SH3039603 | |
| HyClone RPMI 1640 培养基 | Cytvia | SH3009601 | |
| 青霉素-链霉素（P/S） | Gibco | 15-140-122 | |
| 外周血单个核细胞 | - | - | 新鲜或冻存 |
| PRONOVA UP MVG | NovaMatrix | 4200101 | 海藻酸钠 |
| 重组人 IL-15 | Peprotech | 200-15 | 5 ng/mL |
| 重组人 IL-7 | Peprotech | 200-07 | 10 ng/mL |
| 逆转录病毒 | - | - | 1 × 106 TU/mL |
参考文献
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