本文介绍了一种制备干燥大孔海藻酸盐支架的方案，该支架可介导高效的病毒基因转导，用于T细胞的基因工程改造，包括用于CAR-T细胞治疗的T细胞。研究表明，该支架对活化的原代T细胞的转导效率超过>85%。
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本文内容
摘要
摘要
近年来，用于CAR-T细胞治疗的T细胞基因工程已成为癌症治疗的前沿技术。CAR-T细胞通常通过将病毒介导的基因转移至T细胞中来制备。目前病毒基因转移的金标准方法是使用逆转录病毒结合素（retronectin）包被的培养板进行离心转导（spinoculation），但该方法成本高且耗时。因此，亟需开发高效且经济的CAR-T细胞制备方法。本文介绍了一种制备低成本、干燥大孔海藻酸盐支架（称为Drydux支架）的方法，该支架可高效促进活化T细胞的病毒转导。该支架可用于替代金标准的、接种病毒的retronectin包被板的离心转导法，从而简化细胞转导流程。海藻酸盐通过与钙-D-葡萄糖酸盐交联，并经 overnight 冷冻形成支架前体，随后在冻干机中冻干72小时，完成干燥大孔支架的制备。当病毒与活化T细胞共同接种于支架表面时，支架即可介导病毒基因转移，从而生成基因修饰细胞。该支架可实现>85%的原代T细胞转导效率，与retronectin包被板上离心转导的效率相当。结果表明，干燥大孔海藻酸盐支架可作为传统转导方法的一种更廉价且更便捷的替代方案。
引言
免疫疗法因其能够特异性靶向肿瘤、限制脱靶细胞毒性并预防复发，已成为一种革命性的癌症治疗范式。其中，嵌合抗原受体T细胞（CAR-T细胞）疗法因在治疗淋巴瘤和白血病方面取得的成功而备受关注。美国食品药品监督管理局（FDA）于2017年批准了首个CAR-T细胞疗法，此后又陆续批准了四种CAR-T细胞疗法。1,2,3,4,5CARs 具有一个抗原识别域，通常由单克隆抗体的单链可变区片段组成，该片段特异性识别肿瘤相关抗原3,4当CAR与肿瘤相关抗原相互作用时，CAR-T细胞被激活，从而引发抗肿瘤反应，包括细胞因子释放、细胞毒性脱颗粒、转录因子表达以及T细胞增殖。为制备CAR-T细胞，需采集患者的血液以获取其T细胞，并通过病毒载体将CAR基因导入患者的T细胞中。随后对CAR-T细胞进行扩增培养 体外 并回输至患者体内2,3,
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方案
所有涉及人原代细胞和逆转录病毒载体的操作均遵循北卡罗来纳州立大学的生物安全指南，并已获得环境健康与安全部门的批准。人外周血单个核细胞从商业来源购买，形式为血沉棕黄层。人原代细胞必须从人血沉棕黄层组分中分离获得，且操作需具备生物安全二级（Biosafety Level 2）许可，并遵循所在机构的详细标准操作程序及获得相应批准。病毒载体（包括用于转导的逆转录病毒载体上清液，其制备方法如先前所述19）根据所编码的蛋白质，可被归类为生物安全一级（Biosafety Level 1）或生物安全二级（Biosafety Level 2），并须获得相关机构生物安全委员会的批准。
1. 制备大孔海藻酸盐支架
- 通过在烧杯中将无菌过滤的去离子水加入D-葡萄糖酸钙，配制0.4%（质量/体积）的D-葡萄糖酸钙储备液。以中等速度搅拌直至D-葡萄糖酸钙完全溶解（约1.5小时），然后进行无菌过滤，并于室温下保存。
注意：无需检测该溶液的pH值。 - 在带螺口盖的小瓶或烧杯中配制2%（质量/体积）的海藻酸钠溶液。小心地将超纯海藻酸钠加入容器中，再加入无菌过滤的去离子水。选择尽可能大但不影响混合的搅拌子，并将其加入容器中。
注意：本实验方案所用超纯海藻酸钠的类型信息可参见材料表及Novamatrix公司网站
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结果
这些大孔海藻酸盐支架易于制备，经冷冻干燥后应呈现为多孔、蓬松且呈白色的圆盘状。尽管本实验未对此进行研究，但可根据使用者需求，将钙-海藻酸盐溶液浇铸至不同模具中，以制备出不同形状的支架。9,10支架具有静电，可能会粘附到培养板的盖子上或戴手套的手指上。 图2 展示了支架完成后的预期形态。图中还显示了24孔和48孔支架的大致尺寸。
图 2：.......
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讨论
CAR-T细胞疗法在科研和商业应用领域持续受到关注。尽管CAR-T细胞疗法在治疗血液系统癌症方面已取得成功，但其高昂的治疗成本限制了广泛应用。本文介绍了一种无需使用离心接种（spinoculation）预包被retronectin的培养板即可实现T细胞病毒基因转导的新方法。制备用于介导转导的干燥大孔海藻酸盐支架相对简单，是传统方法的一种合适的低成本替代方案。
支架的外观偶尔可能与图示中的不同 图2 可能呈现透明或结晶状，而非白色蓬松状。这可能是由于在-20 ˚C冷冻时温度不一致所致，例如冰箱门频繁开启，或待冷冻的培养板紧邻或放置在冰箱内体积较大的物品之上而受到隔热影响。尽管外观存在差异，但本实验室在使用结晶状支架时，并未观察到转导效率有任何差异。尽管此前关于冷冻凝胶化的研究曾采用更低的冷冻温度24,25我们发现，在较低温度下冷冻会导致支架的外观和功能一致性较差，不如在 -20 ˚C 冷冻时稳定。在 -80 .......
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披露
P.A. 和 Y.B. 是与使用生物材料生成 CAR-T 细胞治疗药物相关专利的发明人。Y.B. 获得了一项与 CAR-T 细胞治疗技术相关的产业资助研究基金（与本研究无关）。 其余所有作者声明不存在竞争利益。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院通过资助编号 R37-CA260223 和 R21CA246414 资助。我们感谢北卡罗来纳州立大学流式细胞术核心设施在流式细胞术分析方面的培训与指导。示意图使用 Biorender.com 制作。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.5 M EDTA | Invitrogen | 15575-038 | UltraPure，pH 8.0 |
| 1x DPBS | Gibco | 14190-144 | 不含氯化钙或氯化镁 |
| 含亚甲蓝的3%乙酸 | Stemcell Technologies Inc | 07060 | |
| 活化的外周血单个核细胞 | - | - | 新鲜或冻存 |
| 葡萄糖酸钙 | Alfa Aesar | A11649 | |
| CD28.2 抗体 | BD | 555725 | 1 mg/mL |
| CD3 抗体 | Miltenyi | 130-093-387 | 100 μg/mL |
| Click's 培养基 | FUJIFILM IRVINE SCIENTIFIC MS | 9195 | |
| 去离子水 | - | - | |
| Glutamax | Gibco | 35-050-061 | |
| HyClone FBS | Cytvia | SH3039603 | |
| HyClone RPMI 1640 培养基 | Cytvia | SH3009601 | |
| 青霉素-链霉素（P/S） | Gibco | 15-140-122 | |
| 外周血单个核细胞 | - | - | 新鲜或冻存 |
| PRONOVA UP MVG | NovaMatrix | 4200101 | 海藻酸钠 |
| 重组人 IL-15 | Peprotech | 200-15 | 5 ng/mL |
| 重组人 IL-7 | Peprotech | 200-07 | 10 ng/mL |
| 逆转录病毒 | - | - | 1 × 106 TU/mL |
参考文献
- Prinzing, B. L., Gottschalk, S. M., Krenciute, G. C. A. R. T-cell therapy for glioblastoma: ready for the next round of clinical testing. Expert Review of Anticancer Therapy. 18 (5), 451-461 (2018).
- Bagley, S. J., Desai, A. S., Linette, G. P., June, C. H., O'Rourke, D. M.
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重印与许可
