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方法文章

通过二次贴壁法从大鼠骨骼中分离单核-巨噬细胞系细胞

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DOI：

10.3791/64053

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2022年7月13日

 ,  ,  ,  , 
1School of Medical Technology and Information Engineering, Zhejiang Chinese Medical University, 2School of Basic Medical Sciences, Fudan University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种从SD大鼠分离BMMs的方案，称为二次贴壁法。

摘要

随着骨矿物质密度的降低，骨骼更易发生骨折，从而对患者的生活质量产生负面影响。骨的生长和发育主要由成骨细胞和破骨细胞调控。目前普遍认为，破骨细胞起源于骨髓单核-巨噬细胞（BMMs）。BMMs 与其他造血干细胞均位于骨髓腔内。因此，从不同且异质的细胞群体中分离出单一稳定的 BMMs 是一项巨大挑战。本文介绍了一种从 SD 大鼠中分离 BMMs 的方案，称为二次贴壁法。在原代培养中贴壁培养 24–48 小时后收集贴壁细胞。流式细胞术分析显示，约 37.94% 的细胞为 CD11b/c+（单核-巨噬细胞表面抗原）。抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色及蛋白质印迹分析表明，BMMs 可在体外分化为破骨细胞in vitro。上述结果提示，二次贴壁获得的细胞可作为破骨细胞分化研究的合适细胞模型。

引言

据报道，存在于骨髓中的单核-巨噬细胞系细胞可分化为血液单核细胞和组织巨噬细胞1,2上述细胞可分化为破骨细胞，以平衡骨的生长与发育，常被用作诱导破骨细胞的细胞模型 体内3,4骨髓是一种特殊的组织，包含多种不同类型的细胞，包括但不限于骨髓间充质干细胞、骨髓单核-巨噬细胞（BMMs）、造血干细胞、内皮细胞和免疫细胞。事实上，已有若干先前研究表明，从长骨骨髓腔中迁移出的贴壁细胞可分化为成骨细胞、破骨细胞、软骨细胞或脂肪细胞。5,6,7,8尽管已采用不同的分离和培养方法来获得不同的同质细胞群体，但从多种不同细胞类型中分离和培养BMMs仍面临巨大挑战。

目前已开发出多种提取骨髓单个核巨噬细胞（BMSCs）的方法。然而，大多数这些方法较为复杂9,10,11。例如，密度梯度离心法需要使用专用试剂盒，且操作耗时、繁琐。该方法适用于从大体积血液样本中分离BMMs，但不适用于骨髓样本9,12,13。此外，采用胶原酶消化法提取组织样本是一种复杂且耗时的过程；该方法不推荐用于从骨髓样本中分离BMMs14,15。另外，尽管流式分选可以获得高纯度的单核细胞/巨噬细胞群体，但其需要非常大的样本量，并对仪器设备有较高要求10,16。此外，磁珠富集法成本极高，在普通实验室中难以实现17。

因此，本研究提出了一种简便、快速且经济的方法，用于从骨髓中分离单核巨噬细胞。通过将骨髓细胞分别贴壁不同时间，采用二次贴壁法分离骨髓源性巨噬细胞（BMMs）。利用上述方法提取的BMMs可诱导破骨细胞的形成 体外从而为未来骨质疏松症的研究提供了一种简单且便捷的细胞模型 体外.

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方案

本研究中的所有实验均按照浙江中医药大学实验动物研究中心的动物实验指南进行（批准号：IACUC-20181029-11）。

1. 细胞提取

  1. 将 Sprague-Dawley 大鼠（SD 大鼠，1-10 日龄，雄性或雌性）放入充满 CO2 的安乐死箱中，以每分钟 30%-70% 容器体积的平衡速率通入气体。待大鼠失去意识（20-60 分钟）后，通过颈椎脱位法处死大鼠，以确保无痛死亡。
  2. 将大鼠浸入 75% 酒精中消毒 10 分钟。
  3. 使用剪刀和镊子小心去除大鼠的所有四肢，用移液器吸取 PBS 冲洗，并冲洗掉附着在四肢上的血液。
  4. 将 5 mL 青霉素/链霉素溶液加入 500 mL DMEM 培养基中，充分混匀。取一个 50 mL 无菌离心管，加入 5 mL FBS 和 45 mL DMEM 培养基，彻底混匀，得到含 10% FBS 和 1% 青霉素/链霉素的 DMEM 培养基。取 2 mL 上述培养基加入一个 5 mL 离心管中。
  5. 将四肢骨骼转移至该 5 mL 离心管中。用剪刀在管内将骨骼剪成小块（1-3 mm），混匀匀浆液，使骨髓细胞重新悬浮于培养基中。静置 5 分钟，直至组织碎片沉降至管底。
  6. 向 100 mm 培养皿中加入 10 mL 含 10% FBS 的 DMEM 培养基，然后将上清液转移至该培养皿中。吸取上清液时，避免将组织碎片转移至培养皿中。
  7. 在 37 °C、5% CO2 条件下培养约 24 小时。培养结束后，大部分间充质干细胞将贴附于培养皿壁并缓慢生长，而大多数骨髓来源巨噬细胞（BMMs）仍悬浮于培养基中。
  8. 将 100 mm 培养皿中的细胞悬液转移至新的 25 cm2 培养瓶中，在 37 °C、5% CO2 条件下继续培养 24 小时。BMMs 通常在培养 24-48 小时后贴附于瓶壁。待 BMMs 完全贴壁后，小心移除旧培养基，并更换为新鲜培养基。
  9. 当培养瓶中细胞融合度达到 80%-90% 时进行传代培养。
    ​注意：所有细胞均在 37 °C、5% CO2 条件下培养。培养过程中，细胞形态逐渐趋于均一，表现为体积较大、形状不规则、呈放射状生长，并以盘状贴附于培养瓶表面，可观察到多个细胞核。

2. 细胞的FACS染色

  1. 使用1-2 mL商品化胰蛋白酶在37 °C、5% CO2条件下消化5分钟，收集继代贴壁细胞，并进行细胞计数以确保每样本终末细胞数为100,000个（使用Neubauer血细胞计数板计数细胞）。
  2. 将细胞分为三组（每500 µL PBS中含100,000个细胞）：(1) 空白对照组，不进行染色的细胞；(2) 同型对照组；(3) 实验组（CD11b/c染色）。
  3. 将一抗（空白对照组不加抗体；同型对照组加入抗CD11同型对照抗体，每样本0.6 µL，1 µg/样本；实验组加入抗CD11b/c抗体，每样本1 µL，1 µg/样本）置于冰上避光孵育30分钟。
  4. 以300-350 × g离心5分钟，弃上清，加入500 µL PBS重悬细胞。重复上述步骤一次，以确保未结合的一抗被充分洗去。
  5. 加入相应的二抗（空白对照组不加抗体；同型对照组和实验组均加入羊抗兔IgG，每样本0.25 µL抗体，稀释比例1:2,000），置于冰上避光孵育30分钟。
  6. 以300-350 × g离心5分钟，弃上清，加入500 µL PBS重悬细胞。重复上述步骤一次，以确保未结合的二抗被充分洗去。
  7. 通过流式细胞术检测CD11b/c阳性细胞（每样本检测10,000个细胞），并使用软件（例如FlowJo 7.5）分析数据。
    ​注意：计算CD11b/c+细胞最终百分比时，采用以下公式：实验组中CD11b/c+细胞百分比减去同型对照组中CD11+细胞百分比。

3. 瑞氏-吉姆萨染色

  1. 将已传代三次的贴壁继代细胞接种于35 mm2的细胞爬片上（每孔1 × 106个细胞），在37 °C、5% CO2条件下培养24小时。
  2. 弃去培养基，用PBS洗涤三次。
  3. 向细胞爬片中加入瑞氏-吉姆萨染液（0.5 mL–0.8 mL），染色1分钟。
  4. 用棉签将染液与蒸馏水（0.5 mL–0.8 mL）混合，静置10分钟。
  5. 用蒸馏水洗去染液，干燥1–3分钟，显微镜下观察。

4. TRAP 染色

  1. 将已传代三次的贴壁继代细胞接种至35 mm2的细胞爬片上（每孔1 × 106个细胞），在37 °C、5% CO2条件下培养24小时。
  2. 弃去旧培养基，更换为含10%胎牛血清的DMEM培养基或添加了50 ng/mL核因子-κB受体活化因子配体（RANKL）和30 ng/mL巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）的破骨细胞诱导培养基，在37 °C、5% CO2条件下继续培养7天。
  3. 按照试剂盒说明书使用TRAP染色试剂盒对细胞进行染色，并在显微镜下观察。
    ​注意：TRAP阳性细胞定义为破骨细胞，在光学显微镜下呈紫色。使用ImageJ软件计数TRAP阳性细胞数量。

5. 蛋白质印迹

  1. 将已传代三次的贴壁继代细胞接种于35 mm2的细胞爬片上（每孔1 × 106个细胞），培养24小时。
  2. 弃去旧培养基，更换为新鲜的含10%胎牛血清的DMEM培养基或破骨细胞诱导培养基（含50 ng/mL RANKL和30 ng/mL M-CSF），在37 °C、5% CO2条件下继续培养7天。
  3. 使用RIPA裂解液提取总细胞蛋白，经10% SDS-PAGE分离后，转至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜18,19。
  4. 用5%脱脂奶粉（25 mL）封闭2小时，随后用TBS-Tween 20（TBST）洗涤3次，每次10分钟。
  5. 加入一抗（抗β-actin、抗TRAP和抗组织蛋白酶K抗体；所有一抗均按1:1,000稀释，每条带加入10 mL稀释后的抗体），4 °C孵育过夜，然后用TBST洗涤3次。
  6. 室温下加入二抗（辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG，按1:2,000稀释，每条带加入10 mL稀释后的抗体）孵育2小时，再用TBST洗涤3次，最后使用显色液显影蛋白条带。
    注意：上述蛋白的表达水平均以β-actin作为内参进行标准化处理。

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结果

继代贴壁细胞群体稳定且均一。随着细胞持续增殖，大部分细胞体积增大，形态不规则，并生长成放射状贴壁圆盘（图2C，D）。流式细胞术结果显示，表达单核-巨噬细胞系表面分子标志物CD11b/c的细胞比例约为37.94%（图2A，B）。为进一步验证CD11b/c阳性细胞属于单核-巨噬细胞系，采用RANKL和M-CSF处理细胞，诱导继代贴壁细胞向破骨细胞分化。TRAP染色结果显示，与对照组相比，经RANKL和M-CSF诱导的细胞内紫红色颗粒数量显著增加（图2E，F）。此外，破骨细胞特异性蛋白TRAP和组织蛋白酶K（cathepsin K）的表达水平也显著升高（图2G，H）。

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讨论

破骨细胞是参与骨疾病发生与发展的最重要细胞类型之一，也是骨疾病研究的主要对象之一20单核细胞/巨噬细胞可分化为破骨细胞。由于单核巨噬细胞（RAW264.7细胞）购买成本较高，且在培养过程中易于被激活，因此难以进行 体外 使用该细胞系进行分化实验。尽管已有多种方法用于从骨髓中分离单核细胞/巨噬细胞，包括密度梯度离心、胶原酶消化、微球富集和流式细胞术表1），这些方法耗时较长，且需要较大的样本量和昂贵的设备。因此，本研究旨在提出一种简单快速的方法，从骨髓样本中提取单核细胞/巨噬细胞。

骨髓中存在多种细胞群体，除骨髓单核细胞（BMMs）外，还包括骨髓间充质干细胞（BMSCs）、内皮细胞和免疫细胞。众所周知，BMSCs可分化为成骨细胞，而这一过程将影响BMMs向破骨细胞的分化。21均匀且稳定的BMMs是诱导破骨细胞分化的关键因素 体外因此，在分离和提取BMMs时，尤其需要考虑这些限制因素。同时，BMMs向破骨细胞分化的潜能也会随...

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披露

作者声明不存在任何竞争利益。

致谢

本工作由浙江省自然科学基金（资助号：LY19H060001）和浙江省中医药科学技术计划项目（编号：2022ZB093）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
35 mm2 细胞爬片NEST 生物技术80102
抗组织蛋白酶 K 抗体Abcamab190271:1,000
抗 CD11 同型对照抗体Abcamab1727301 μg/次，1.675 mg/mL
抗 CD11b/c 抗体Absinabs124232 1μg/次，1 mg/mL
抗 TRAP 抗体Abcamab1914061:1,000
抗β-actin 抗体碧云天 AF50031:1,000
细胞爬片NEST 生物技术80102
细胞培养皿Corning430167
细胞培养瓶Corning430168
杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）GibcoC11995500BT
胎牛血清（FBS）Gibco10099141C
山羊抗兔 IgG 抗体Abcamab150077用于免疫荧光，1:2,000
山羊抗兔 IgG 抗体Abcamab6721用于 Western blot，1:2,000
M-CSFPeproTech400-28
PBSBiosharpBL302A
RANKLPeproTech400-30
SD 大鼠上海斯莱克实验动物有限公司1–10 日龄
SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒SolarbioP1200
TRAP/ALP 染色试剂盒Wako294-67001
胰蛋白酶-EDTA 溶液BiosharpBL512A
瑞氏-吉姆萨染液凯基生物KGA225-1

参考文献

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