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方法文章

研究鞘氨醇-1-磷酸受体结构与信号通路的实验流程

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DOI：

10.3791/64054

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2022年6月8日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Nephrology and Kidney Research Institute, State Key Laboratory of Biotherapy and Cancer Center, West China Hospital, Sichuan University, 2Department of Neurosurgery, West China Hospital, Sichuan University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

S1P 通过鞘氨醇-1-磷酸受体（S1PRs）亚家族发挥其多种生理作用。本文描述了一种用于阐明 S1PRs 结构与功能的研究流程。

摘要

溶血磷脂（LPLs）是一类具有生物活性的脂质，包括鞘氨醇-1-磷酸（S1P）、溶血磷脂酸等。S1P 是细胞膜中鞘脂类物质的代谢产物，是目前研究最为清楚的 LPL 之一，可通过鞘氨醇-1-磷酸受体（S1PRs）介导的信号通路调控多种细胞生理反应。via 该通路的作用表明，S1P-S1PRs 信号系统在多种疾病中具有重要的治疗潜力，这些疾病包括多发性硬化症（MS）、自身免疫性疾病、癌症、炎症，甚至包括 COVID-19。S1PRs 属于 A 类 G 蛋白偶联受体（GPCR）家族中的一个小亚类，包含五个亚型：S1PR1、S1PR2、S1PR3、S1PR4 和 S1PR5。然而，由于缺乏详细的结构信息，靶向 S1PRs 的药物研发受到阻碍。本文中，我们采用冷冻电子显微镜技术解析了 S1P-S1PRs 复合物的结构，并结合基于细胞的功能实验，阐明了其激活机制、药物选择性识别以及 G 蛋白偶联的分子基础。该策略也可用于研究其他溶血磷脂受体（LPLRs）及 G 蛋白偶联受体（GPCRs）。

引言

鞘氨醇-1-磷酸（S1P）是细胞膜鞘脂类的一种代谢产物，是一种普遍存在的溶血磷脂酸信号分子，参与多种生物学活动，包括淋巴细胞迁移、血管发育、内皮完整性以及心率调节1,2,3。S1P通过五种S1P受体亚型（S1PR1-5）发挥其多样的生理作用；这些受体分布于多种组织中，并对下游G蛋白表现出独特的偏好性4,5。S1PR1主要与Gi蛋白偶联，进而抑制cAMP的生成；S1PR2和S1PR3可与Gi、Gq及G12/13蛋白偶联，而S1PR4和S1PR5则通过Gi和G12/13蛋白传导信号6。

S1P-S1PR 信号通路是多种疾病的關鍵治療靶點，包括自身免疫性疾病7、炎症8、癌症9以及新型冠狀病毒病（COVID-19）10。2010年，芬戈莫德（fingolimod，FTY720）被批准作為首個靶向S1PRs的藥物，用於治療復發型多發性硬化症（MS）11。然而，該藥物可結合除S1PR2外的所有S1PR亞型，其對S1PR3的非特異性結合會導致大腦皮層水腫、血管和支氣管收縮以及肺上皮滲漏12。為提高治療選擇性，研究人員已開發出針對該受體的亞型特異性配體。西波尼莫德（siponimod，BAF312）於2019年獲批用於治療復發型MS13；其可有效靶向S1PR1和S1PR5，但對S1PR3無親和力，因此在臨床應用中副作用更少14。2020年，美國食品藥品監督管理局（FDA）批准了奧扎尼莫德（ozanimod）用於MS治療15。據報導，奧扎尼莫德對S1PR1的選擇性比對S1PR5高出25倍16。值得注意的是，在當前COVID-19大流行的背景下，研究發現靶向S1PRs的激動劑藥物可通過免疫調節療法技術用於治療COVID-1917。與芬戈莫德相比，奧扎尼莫德在減輕COVID-19患者症狀方面表現出更優越的效果，目前正處於臨床試驗階段10。闡明S1PRs的結構基礎與功能，為開發選擇性靶向S1PRs的藥物奠定了重要基礎18。

研究生物大分子结构信息的方法有多种，包括X射线晶体学、核磁共振（NMR）和电子显微镜（EM）。截至2022年3月，蛋白质数据库（PDB）中已收录超过180,000个结构，其中大多数是通过X射线晶体学解析的。然而，自2013年程亦凡（Yifan Cheng）和大卫·朱利叶斯（David Julius）报道了TRPV1的首个近原子分辨率结构（分辨率为3.4 Å）以来19，冷冻电子显微镜（cryo-EM）已成为解析蛋白质结构的主流技术，EM解析的PDB结构总数已超过10,000个。关键的技术突破主要集中在新型成像相机（即直接电子探测相机）和新型图像处理算法的发展上。在过去十年中，冷冻电镜技术彻底改变了结构生物学和基于结构的药物发现领域20。由于理解大分子复合物如何在活细胞中执行其复杂功能是生命科学的核心课题之一，冷冻电镜有望揭示动态分子复合物的构象变化，尤其适用于跨膜蛋白的研究21。G蛋白偶联受体（GPCRs）是最大的跨膜蛋白超家族，也是目前超过30%市售药物的作用靶点22。冷冻电镜技术的发展推动了大量高分辨率GPCR-G蛋白复合物结构的解析，使得那些在药物设计中仍无法通过X射线晶体学分析的“难处理”靶点得以进行结构解析23。因此，冷冻电镜的应用为在接近天然条件下以近原子分辨率解析GPCR的三维结构提供了可能24。冷冻电镜技术的进步使得人们能够可视化GPCR激活或抑制的分子机制，并进一步有助于发现靶向GPCR的新药物结合位点25。

得益于冷冻电镜（cryo-EM）技术的巨大进步，我们近期解析了激动状态下S1PR1-、S1PR3-和S1PR5-Gi信号复合物的结构26,27。在人体中，S1PRs分布于多种组织，并对下游G蛋白表现出独特的偏好性4,5。S1PR1主要与Gi蛋白偶联，进而抑制3′,5′-环磷酸腺苷（cAMP）的生成。S1PR3和S1PR5也能够与Gi蛋白偶联6,28。由于Gi偶联受体的激活会降低cAMP的产生29，因此引入了一种基于Gi抑制的cAMP检测方法，用于测量cAMP的抑制效应，从而捕捉功能变化26,27。该cAMP检测方法采用一种经过改造的Photinus pyralis荧光素酶，其结构中插入了一个cAMP结合蛋白结构域，因而可通过细胞内cAMP浓度的变化，简便而可靠地监测GPCR活性30。该方法是一种灵敏且非放射性的功能性检测手段，可用于实时监测多种GPCR的下游信号通路，在药物发现中具有广泛应用前景31。

本文总结了解析S1PRs激活机制及药物识别模式的关键方法，主要包括冷冻电镜操作和Gi抑制型cAMP检测。本文章旨在为深入探索G蛋白偶联受体（GPCRs）的结构与功能提供全面的实验指导。

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方案

1. S1PRs-蛋白G复合物的纯化

  1. 为纯化人S1PRs-蛋白G复合物，克隆S1PR1的cDNA 缺少C末端残基338-382的野生型S1PR3、C末端截短345-398的S1PR5以及野生型Gi1插入pFastBac1载体，以及野生型G的cDNAβ1 和 Gγ2插入pFastBacdual载体中（材料表).
    注意：所有S1PR的构建体均包含血凝素（HA）信号序列，其N端带有Flag表位标签，C端带有10x his标签。此外，还包含一段合成DNA序列（材料表) 为了促进受体的表达与纯化，将用于翻译T4溶菌酶（T4L）的序列插入S1PRs的N端。
  2. 编码S1PRs、Gi1和G的杆状病毒的制备β1γ2
    1. 加入重组载体 50 µL DH5的α 感受态 大肠杆菌（Escherichia coli） 保存于 -80 °C 的 1.5 mL 离心管中80 °C，冰上孵育30分钟。
    2. 将细胞进行热激处理 42 °C 90秒后立即将其转移至冰上，冰浴2分钟。
    3. 震荡试管 37 °C 补充后3-5小时 300 µL 的溶菌肉汤（LB）培养基。平板 100 µL 将细胞接种至LB琼脂平板，并在 37 °C 避光孵育 48 小时。
    4. 将白色菌落接种至5 mL含有相应抗生素的LB培养基中 50 µg/mL 卡那霉素， 10 µg/mL 四环素，和 7 µg/mL 庆大霉素，以及培养于 37 °C 16小时。
    5. 使用质粒小提试剂盒提取重组bacmid（材料清单按照制造商的说明，用于产生P0杆状病毒。
      注意：使用前，采用 pUC/M13 正向和反向引物对纯化的 bacmid 进行 PCR 分析。PCR 反应的循环次数 = 30 个循环，退火温度 = 58 °C，延伸时间为每1 Kb 1分钟。
    6. 按照先前的方案制备P0杆状病毒32.
      1. 培养 sf9 细胞（ESF921培养基）接种于六孔板中，并确认细胞处于对数生长期（1.0-1.5 x 106 cells/mL
      2. 稀释 8 µL 杆状病毒转染试剂 100 µL Grace's 培养基，并在室温下孵育 30 分钟。稀释 10 µg 重组杆状病毒基因组中的 100 µL 加入Grace's培养基，轻轻混匀。将稀释的bacmid与稀释的杆状病毒转染试剂混合，轻轻混匀后于室温孵育30分钟。
      3. 将混合物（bacmid 和试剂）加入细胞（步骤 1.2.6.1）中，并进行铺板 27 °C 3小时。
      4. 吸去Grace's培养基，加入2 mL ESF921细胞培养基。将六孔板置于 27 °C 转染后5天收集ESF921细胞培养基。
      5. 500 x g 离心 g 在 4 °C 离心10分钟以去除细胞和碎片。将上清液转移至2 mL离心管中。此即P0杆状病毒原液。
    7. 分离P1病毒株
      1. 转移 30 mL 的 sf9 细胞转入锥形瓶中，培养于 27 °C 以270 rpm振荡培养，并确认细胞达到对数生长期（1.0–1.5 × 10⁸ cells/mL）6 cells/mL
      2. 将2 mL P0病毒原液加入瓶中，在270 rpm条件下振荡培养4天 27 °C.
      3. 将细胞转移至50 mL离心管中，以1,800 x g 10 分钟 4 °C 去除细胞和碎片，将上清液转移至50 mL离心管中。此即为P1杆状病毒原液。
    8. 扩增杆状病毒毒株
      1. 使用 50 mL 重复步骤 1.2.7 sf9 对数期细胞（1.0-1.5 x 106 细胞/mL）和1 mL P1储备液。
      2. 将获得的P2杆状病毒储备液保存于 4 °C避光保存。
        注意：不要无限扩增杆状病毒，因为每次传代都会产生有害突变体。
  3. S1PRs-蛋白复合物的表达
    1. 培养 sf9 昆虫细胞以达到 2.5 x 106 细胞/mL 密度，与编码 S1PRs、Gi1 和 G 的 P2 杆状病毒共感染β1γ2，体积比为1:2:1，再次培养 27 °C 48 小时。
    2. 通过在 700 x g 条件下离心收集细胞 g 在 4 °C 15分钟，液氮中速冻，然后于-80 °C 供使用。
  4. 蛋白质纯化
    1. 将步骤 1.3 中获得的细胞沉淀在室温下解冻，然后重悬于裂解缓冲液（20 mM HEPES pH 7.5，50 mM NaCl，5 mM MgCl₂，1 mM DTT，1× 蛋白酶抑制剂）中2，5 mM CaCl2) 加入补充 100 µg/mL 苯甲脒， 100 µg/mL 亮抑蛋白酶肽， 100 µg/mL 抑肽酶，25 mU/mL 阿皮拉司 10 µM 激动剂。室温下搅拌细胞悬液2小时，以诱导S1PRs-G蛋白复合物的形成。
      注意：Apyrase 是一种 ATP 二磷酸水解酶，可催化从 ATP 中去除 γ 磷酸基团以及从 ADP 中去除 β 磷酸基团。
    2. 将溶液转移至离心管中，在70,000 x g 孵育10分钟，小心移除上清液。将沉淀重悬于溶解缓冲液（20 mM HEPES pH 7.5，100 mM NaCl，5 mM MgCl₂）中。2，5 mM CaCl20.5% (w/v) LMNG，0.1% (w/v) CHS，1% (w/v) 胆酸钠，10% (v/v) 甘油
    3. 将悬液转移至玻璃Dounce匀浆器中，充分匀浆沉淀。加入 10 µM 激动剂，4 mg scFv16， 100 µg/mL 苯甲脒， 100 µg/mL 亮抑蛋白酶肽， 100 µg/mL 抑肽酶和25 mU/mL 脱磷酸酶加入悬浮液中，混匀并搅拌 4 °C 2小时。
      注意：沉淀物的匀浆步骤对于GPCR-蛋白复合物的制备至关重要。
    4. 将溶液转移至离心管中，在100,000 x g 30 分钟 4 °C.
    5. 用洗涤缓冲液（20 mM HEPES pH 7.5，100 mM NaCl，5 mM MgCl₂）预平衡 Flag 树脂2，5 mM CaCl2, 10 µM 激动剂，0.0375% (w/v) LMNG，0.0125% (w/v) GDN，0.01% (w/v) CHS。
    6. 将上清液转移至管中，与 Flag 树脂孵育 4 °C 2小时。
    7. 将上述混合物上样至玻璃柱，并用50 mL洗涤缓冲液冲洗柱子，洗涤缓冲液中添加有 100 µg/mL 苯甲脒， 100 µg/mL 亮抑蛋白酶素，和 100 µg/mL 抑肽酶
    8. 用含有 20 mM HEPES（pH 7.5）、100 mM NaCl、5 mM EDTA 的洗脱缓冲液 10 mL 洗脱层析柱， 200 µg/mL Flag肽 10 µM 激动剂，0.0375% (w/v) LMNG，0.0125% (w/v) GDN，0.01% (w/v) CHS 100 µg/mL 苯甲脒， 100 µg/mL 亮抑蛋白酶素，和 100 µg/mL 抑肽酶
    9. 收集S1PRs-蛋白G复合物，并使用100 kDa截留分子量的浓缩器在1,300 x g条件下浓缩至1 mL g 在 4 °C. 通过一个滤器过滤 0.22 µM 过滤，并在13,000 x g 10 分钟 4 °C 以去除聚集体。
    10. 将S1PRs-蛋白G复合物上样至预先用SEC缓冲液（含20 mM HEPES pH 7.5、100 mM NaCl）平衡的尺寸排阻色谱（SEC）凝胶过滤柱中 10 µM 激动剂，100 Μm TCEP，0.00375% (w/v) LMNG，0.00125% (w/v) GDN 和 0.001% (w/v) CHS，以 0.5 mL/min 的流速通过 4 °C.
    11. 收集洗脱峰组分，并使用100 kDa截留分子量的浓缩器在1,300 x g条件下进行浓缩 g 在 4 °C 用于冷冻电镜。

2. 利用电子显微镜解析S1PRs的结构

  1. 数据采集
    1. 制备冷冻电镜载网时，用镊子夹住300目金质R1.2/1.3载网，置于辉光放电清洗系统中，在15 mA条件下辉光放电60秒。
    2. 按照之前所述的方法进行样品玻璃化处理33,34在冷冻仪的冷冻控制界面中，将温度设置为 4 °C 相对湿度设为100%，以满足样品室的工作环境要求。使用0的 blot 力，等待时间为0 s，blot 时间为2或3 s，排出时间为0 s。通常仅需 3 µL 样品浓度为5-10 mg/mL，用于单个玻璃化冷冻。
    3. 将载网剪切并装入自动载网架，将自动载网架装入Nanocab，再通过自动进样器将Nanocab装入显微镜，操作步骤如前所述35使用 EPU2 软件筛查样品质量34通常，冰层厚度适宜区域采集到的数据质量更佳。
    4. 按照先前详细描述的方法收集冷冻电镜数据35对于S1P受体，将离焦偏移量设置在-1.0 µm 和 -1.8 µm 电子曝光剂量为50–65 e-/Å2对于S1PR1-Gi复合物，使用EPU2软件在计数模式下，以K2探测器进行电影堆栈的自动采集，总曝光时间为2秒，采集速率为每秒5个原始帧，总剂量为56 e⁻/Ų。-/Å2 每堆栈生成35帧。
      注：通常需要超过 5,000 个电影文件才能重建受体结构。
  2. 使用 RELION 组合处理数据36 和 cryoSPARC37 以获得理想的冷冻电镜密度图。首先使用 RELION-3.1_gpu_ompi4 处理数据，其操作步骤与此前所述类似。34.
    1. 在 Linux 系统终端中，进入数据存储目录的上级目录。
    2. 输入 relion 在终端中输入命令以打开 RELION 图形用户界面（GUI）。
      注意：如果这是首次在该目录中打开 RELION 图形用户界面，将弹出提示窗口；请点击 是.
    3. 点击 导入 在 RELION 图形用户界面右侧的功能栏中，将原始数据导入 RELION。
      1. 在 视频/麦克风 选项，选择 是 用于 是否导入原始电影/显微照片？，输入数据路径 原始输入文件 字段（建议使用通配符），并选择 是 用于 这些是多帧电影吗？. 在“像素大小（埃）”字段中输入电影的像素大小，在“显微镜工作电压（kV）”字段中输入电压值 电压（kV） 场，以及显微镜的球面像差 球面像差（mm） 领域。这些是在数据采集时记录的参数。
      2. 在 运行 选项，修改 队列名称 根据程序运行所在的服务器设置（其他功能也需要修改此参数）。其余参数保持 RELION 设定的默认值。最后，当所有参数均被正确检测后，点击 跑！ 运行程序。
    4. 使用 运动校正 所有帧对齐功能38.
      1. 在 输入/输出 选项，单击 浏览 并选择输出 导入 名为的函数 视频集锦.星标 作为输入 输入电影 STAR 文件. 在每帧中输入剂量 每帧剂量（e/A）2) 场强，等于总剂量除以帧数。选择 无 用于 是否保存功率谱的总和？.
      2. 在 运动 选项，输入 250 用于 B因子，5.5 用于 X、Y方向的补丁数量，以及 2 用于 组框架 （确保该组的剂量） >3). 如果在采集期间数据未进行增益参考校正，则需要获取增益参考图像，可通过采集空白网格区域获得。选择 无 用于 使用 RELION 自带的实现？ 并输入包含可执行文件的目录 MOTIONCOR239 在 MOTIONCOR2 可执行文件 领域
      3. 在 运行 选项，根据服务器的计算能力选择合适的 MPI 和线程数；此处使用 MPI = 8 和线程数 = 3。
    5. 使用 CTF 估计 调控玻璃化样品冷冻电镜图像的功能40. 在 输入/输出 选项，单击 浏览 并选择输出 运动校正 命名为 校正后的显微照片.star 作为输入 输入电影文件 STAR 文件. 在 Gctf 选项，选择 是 用于 改用 Gctf？.
    6. 使用 子集选择 用于移除具有特定值的显微照片的功能 rlnCtfMaxResolution >4.
      1. 在 输入/输出 选项，单击 浏览 位于右侧 或从 micrographs.star 中选择 并选择输出 CtfFind 命名为 micrographs_ctf.star 作为输入。在 子集 选项，选择 是 用于 根据元数据值进行选择？ 并输入 4 对于 最大元数据值 以去除不良数据。
    7. 手动挑选：手动挑选部分图像用于初步挑选与分类。
      1. 在 输入/输出 选项，单击 浏览 并选择 micrographs_selected.star 从前一个 选择 目录（步骤 2.2.6）作为输入。
      2. 点击 跑！ （一个窗口弹出）。单击 文件 在新窗口的左上角并单击 反向选择 取消选择所有图像。勾选每条目对应行中最左侧的选择框，然后点击 挑选 检查图像并选择约500张优质图像。点击 文件 > 保存所选内容 保存选定的图像并关闭窗口。
    8. 自动挑选：自动颗粒挑选软件包既实用又强大41.
      1. 在 输入/输出 选项，单击 浏览 在……的右侧 自动挑选输入的显微照片 并选择 micrographs_selected.star 从前述 手动挑选 目录（步骤 2.2.7）作为输入。首先使用高斯拉普拉斯算法，因此选择 是 用于 或：使用高斯拉普拉斯算子.
      2. 在 拉普拉斯算符 选项，设置 LoG 滤波器的最小直径（A） 至 80 和 LoG 滤波器的最大直径（A） 到 130. 在 自动挑取 选项，设置 最小粒子间距离（A） 到 65，并选择 是 用于 使用 GPU 加速 如果可以访问 GPU。
    9. 提取颗粒用于后续步骤。
      1. 在 输入/输出 选项，单击 浏览 在右侧 显微照片 STAR 文件 并选择 micrographs_selected.star 从步骤 2.2.6 开始。单击 浏览 输入坐标的右侧并选择 cords_suffix_autopick.star 从步骤 2.2.8 开始。
      2. 在 提取 选项，选择 是 用于 重新调整颗粒尺寸 并设置 重新调整后的尺寸（像素） 至 128 以加快后续步骤。
    10. 用于颗粒初步分类的二维分类
      1. 在 输入/输出 选项，单击 浏览 在右侧 输入图像 STAR 文件 并选择 颗粒.star 从步骤 2.2.9 开始。在 优化 选项，设置 类别数量 到 100 和 掩膜直径（A） 至 140.
      2. 在 计算 选项，设置 合并颗粒的数量 至 10，进入位于高速本地磁盘（例如 SSD 磁盘）上的目录 将粒子复制到临时目录 领域，并选择 是 用于 是否使用 GPU 加速？ 以提高处理速度。
    11. 用于选择优质二维结果作为模板以挑选颗粒的子集选择
      1. 在 输入/输出 选项，单击 浏览 在……的右侧 从 model.star 中选择类别 并选择步骤 2.2.10 的输出，命名为 以 run_it025_model.star 作为输入. 点击 跑！. 在弹出窗口中，勾选 排序图像 和 反向排序？ 并点击 显示！.
      2. 选择具有良好代表性的二维结果作为参考 参考文献 的 自动挑选 功能。
        注意：选定的结果以红色框标出。良好的和不良的二维分类结果将在后文展示。
      3. 右键单击并选择 保存选定的类别.
    12. 使用模板进行第二轮自动挑选。在 输入/输出 选项，单击 浏览 在右侧 自动拾取的输入显微照片 并选择 micrographs_selected.star 从步骤 2.2.6 开始。单击 浏览 在右侧 二维参考，选择 class_averages.star 从步骤 2.2.11 开始，并选择 无 用于 或：使用拉普拉斯-高斯算子n.
    13. 再次使用颗粒提取 coord_suffix_autopick.star 来自步骤 2.2.12 和 micrographs_selected.star 从步骤 2.2.6 开始
    14. 再次使用2D分类 颗粒.star 从步骤 2.2.13 开始
    15. 再次使用子集选择 run_it025_optimiser.star 从步骤 2.2.14 开始。
      注意：应选择所有轮廓清晰、形状正确的二维图像。
    16. 按如下步骤进行颗粒提取。在 输入/输出 选项，单击 浏览 在……的右侧 显微照片 STAR 文件，选择 micrographs_selected.star 从步骤 2.2.6 开始，并选择 是 用于 或重新提取纯化后的颗粒？. 点击 浏览 在右侧 优化颗粒的STAR文件 并选择 颗粒.star 从步骤 2.2.15 开始。
    17. 3D 初始模型与生成参考图谱：在 输入/输出 选项，单击 浏览 在右侧 输入图像 STAR 文件 并选择 particles.star 从步骤 2.2.16 开始。 类别数量 至 1，以及 掩膜直径（A） 至 140 在 优化 选项
    18. 3D 分类及生成初步的 3D 图谱：在 输入/输出 选项，单击 浏览 在……的右侧 输入图像 STAR 文件 并选择 颗粒.star 从步骤 2.2.16 开始。单击 浏览 在……的右侧 参考图 并选择 initial_model.mrc 从步骤 2.2.17 开始。设定 类别数量设为4-6个，以及 掩膜直径（A） 至 140 在 优化 选项
    19. 掩模生成：从步骤 2.2.17 中选择质量良好的 3D 图谱作为输入 输入/输出 选项。设置 初始二值化阈值 至 0.05 （根据输出结果进行调整） 扩展二值图的像素数量 至 3，以及 添加此像素数量的柔化边缘 至 8 在 口罩 选项
    20. 使用 cryoSPARC 进行后续处理。
    21. 创建一个新的工作区并点击 职业构建器 对于第一份工作。
    22. 要导入粒子堆栈，请在（步骤 2.2.16）中输入粒子路径 颗粒元路径 视野及影片的路径（步骤 2.2.16）中的 粒子数据路径 领域
      注意：参数 加速电压（kV），球面像差（mm），以及 像素尺寸（埃） 与之前相同。 振幅对比度 （分数）值为 0.1。
    23. 在步骤 2.2.18 中输入最佳 3D 体积数据的路径以导入 3D 体积数据 体积数据路径 并选择 地图 用于 导入的体积类型.
    24. 通过输入掩膜路径（步骤 2.2.19）导入掩膜 体积数据路径 并选择 口罩 用于 导入的体积类型.
    25. 非均匀 refine：以步骤 2.2.22、2.2.23 和 2.2.24 的输出作为输入。
      注意：此功能对于膜蛋白非常有用。
      1. 拖动步骤 2.2.22 的输出结果（导入的颗粒作为非均匀精修（Non-uniform Refinement）的输入 颗粒（particle）第2.2.23步的输出结果导入的体积_1) 作为非均匀精修的输入 体积（volume），以及步骤 2.2.24 的输出 （导入的掩膜_1）) 作为非均匀精修的输入 遮罩（mask）.
        注意：有时不使用掩膜可获得更好的结果。
      2. 点击 队列 开始处理。
    26. 运行步骤 2.2.18–2.2.25 以获得更好的结果。通过上述一系列处理，可获得分辨率良好的 S1PR-Gi 三维图谱。

3. S1PRs-Gi 介导的 cAMP 抑制实验

注意：S1PRs-Gi 介导的 cAMP 抑制实验分为多个部分，以下是详细的实验步骤。实验原理和总体实验流程以流程图形式展示在图1中。

  1. 质粒构建
    1. 将野生型 S1PR1、S1PR3 和 S1PR5 的 cDNA 亚克隆至 pcDNA3.1+ 载体中，使其 N 末端带有 HA 信号序列，后接 Flag 标签（材料表).
      注意：所有受体的突变均使用定点突变试剂盒（mutagenesis kit）生成（材料表).
  2. 质粒的制备
    1. 加入重组的 pcDNA3.1+ 载体或 Sensor 质粒（材料表) 到 50 µL DH5的α 感受态 大肠杆菌（E. coli） 保存于 -80 °C 的 1.5 mL 离心管中80 °C 分别处理，并在冰上孵育30分钟。将细胞进行热激处理，温度为 42 °C 90秒后，立即将其转移至冰上，冰浴2分钟。
      注意：Gi抑制cAMP检测试剂盒提供的传感器质粒（材料表) 表达一种与cAMP结合域融合的修饰型荧光素酶基因，当cAMP结合时，其发光活性增强。
    2. 震荡试管 37 °C 补充后孵育1小时 300 µL 的溶菌肉汤（LB）培养基。平板 100 µL 将细胞接种至LB琼脂平板，37°C培养 37 °C 在黑暗条件下孵育48小时。将白色菌落接种至5 mL含有抗生素的LB培养基中 100 µg/mL 氨苄青霉素，以及培养于 37 °C 16小时。
    3. 使用质粒小提试剂盒分离 DNA（材料清单）按照制造商说明书操作；质粒浓度超过 350 ng/µL 其值为 A260/A280 介于 1.7 和 1.9 之间。
  3. 细胞培养
    1. 将CHO-K1细胞接种于10 cm培养皿中，在37°C、5% CO₂条件下培养 37 °C 5% CO₂ 培养箱2，当单层细胞融合度达到80%–90%时进行收获。
    2. 吸弃CHO-K1细胞的生长培养基，加入4 mL预热的0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液 37 °C 轻轻加入培养皿中，孵育15秒。然后加入4 mL由F12培养基加10%胎牛血清组成的生长培养基。
    3. 通过轻轻摇晃并敲击培养皿侧面，使细胞从培养皿表面脱落。将细胞悬液转移至锥形管中。轻轻搅拌并缓慢移液，以轻柔去除细胞团块。
    4. 以 250 x 离心细胞 g 室温孵育5分钟，吸除上清液，加入3 mL PBS重悬。重复此步骤一次。
    5. 使用血细胞计数板确定细胞数量，并在250 x g条件下离心细胞 g 室温下孵育5分钟。
    6. 吸去 PBS 缓冲液，并用 3 mL 含 10% FBS 的 F12 培养基重悬 CHO-K1 细胞。
    7. 向六孔板的每孔中加入 2 mL 由 F12 培养基和 10% FBS 组成的生长培养基，并接种 150 µL 将细胞悬液加入每个孔中，使细胞密度保持在1.5 × 105 细胞/mL。将六孔板置于培养箱中孵育 37 °C 含5% CO₂的组织培养箱2 约 24 小时。
  4. 瞬时转染
    1. 稀释 2 µg DNA（步骤 3.2.3）的导入 200 µL 转染试剂缓冲液（材料清单）。使用前涡旋振荡10秒混匀，并短暂离心。
      注意：此处的 2 µg DNA 含有 0.5 µg 受体载体（S1PR1、S1PR3 或 S1PR5）以及 1.5 µg 传感器质粒
    2. 添加 4 µL 转染试剂的材料清单），涡旋10秒，短暂离心后使用。室温孵育15分钟。
    3. 缓慢滴加 200 µL 将转染混合物加入每孔（含CHO-K1细胞）中，使其均匀分布。轻轻摇动六孔板，确保充分混匀。
    4. 4–6 小时后，将转染培养基更换为含 F12 培养基 + 10% FBS 的细胞生长培养基，将六孔板放回培养箱中继续培养。
    5. 转染后24-48小时收集细胞。
      1. 用胰蛋白酶消化孔中的CHO-K1细胞 500 µL 0.05% 胰蛋白酶-EDTA（预热于 37 °C）15 秒，加入 1 mL 含 F12 培养基 + 10% FBS 的生长培养基。通过轻轻摇晃并轻敲孔板侧壁，使细胞从孔底表面脱落。
      2. 将细胞悬液转移至锥形管中，以 250 x g 室温孵育5分钟。弃去上清液，收集转染的细胞。
        注意：在测定荧光信号之前，按照此前所述方法通过 ELISA 检测受体的细胞表面表达水平26.
  5. D-荧光素钾盐平衡材料表)
    1. 将收获的细胞（转染后24-48 h）立即用3 mL检测缓冲液重悬（即含10 mM HEPES pH 7.4的Hank's平衡盐溶液（HBSS）），并额外加入体积分数为3%的D-荧光素钾盐。
    2. 添加 90 µL 每孔加入细胞悬液，使用多通道移液器加入96孔板中，并轻轻混匀。
    3. 室温孵育40分钟。
  6. 荧光信号测定
    1. 预先配制10 mM的西尼莫德（Siponimod）DMSO储存液，并使用含HBSS缓冲液进行系列稀释 25 µM 在配体刺激前使用佛司可林。
      注意：除无配体的对照组外，其余组别均具有10的浓度梯度范围-11-10-5 mol/L
    2. 刺激 10 µL （每孔）不同浓度的激动剂溶液，孵育30分钟。
    3. 使用配套软件在微孔板读板仪上计数发光信号材料清单）参数，操作如下：选择 发光 用于 检测方法，终点法 用于 读取类型，以及 发光纤维 用于 光学类型. 设置 光学增益 到 255.
      注：每次测量均在至少三次独立实验中进行，每次实验设三个重复。
    4. 获取荧光信号的数值，将数据导入电子表格程序，并使用非线性回归（曲线拟合）剂量-反应函数处理数据。

figure-protocol-1
图1实验示意图。 实验设置与操作的详细分步指南。简言之，通过转染试剂将受体和传感器质粒共转染入CHO-K1细胞，实现受体与修饰型荧光素酶的瞬时共表达。转染24小时后，将细胞重悬于含有D-荧光素钾盐（荧光素酶底物）的HBSS溶液中，并接种至96孔板。为使D-荧光素进入细胞，需预先与细胞平衡。氧化酶荧光素酶可将荧光素转化为氧荧光素并发光。而修饰型荧光素酶则产生光信号 通过 只有在结合cAMP时才会发生化学反应，且光强度与细胞内cAMP水平呈正相关。cAMP水平通过激动剂激活的G蛋白偶联受体（GPCR）进行调控。Gi偶联受体降低cAMP水平，因此在Gi抑制型cAMP实验中需添加forskolin以激活腺苷酸环化酶。 请点击此处以查看此图的放大版本。

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结果

在冷冻S1PRs-Gi复合物样品之前，需要通过尺寸排阻色谱法（SEC）对纯化后的样品进行分离，并利用凝胶过滤色谱进行分析。图2以S1PR3-Gi复合物为例进行展示。均一的GPCR-G蛋白复合物的主峰组分通常出现在尺寸排阻色谱的约10.5 mL处（图2A）。S1PR3-Gi复合物的SDS-PAGE分析结果（图2B）显示四条条带，分别对应S1PR3、Gαi、Gβ和scFv16的理论分子量，表明该复合物已成功纯化。受不同程度修饰（如糖基化或棕榈酰化）的影响，受体条带常呈现弥散状，而Gγ条带则未被检测到。

figure-results-1

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讨论

本方案描述了通过冷冻电镜（cryo-EM）测定S1PRs结构以及通过Gi介导的cAMP抑制实验测定S1PRs激活效力的主要流程。其中某些步骤对实验成功至关重要。

为了纯化S1PRs-Gi复合物，应更加关注病毒的质量和sf9细胞的健康状态。在状态不佳的sf9细胞中，受体的表达水平会显著降低。通过测量细胞直径来评估sf9细胞的健康状况，健康的sf9细胞直径约为15 µm。S1PRs-Gi复合物的产量受到受体、Gi和Gβγ病毒体积比的影响，这一问题可通过体外组装S1PRs-G蛋白复合物来克服in vitro42。此外，GPCR-G蛋白复合物并不总是稳定的，因此开发了NanoBiT策略，并已被频繁用于稳定该复合物43。

样品的质量是冷冻电镜实验中一切工作的基础。在样品筛选过程中，经常观察到样品发生聚集或解离的现象。某些方法可能有助于G蛋白偶联受体（GP...

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致谢

S1PRs-Gi 复合物的数据采集在四川大学华西冷冻电镜中心和南方科技大学（SUSTech）冷冻电镜中心完成，并在四川大学杜宇高性能计算中心进行处理。本研究受到国家自然科学基金（32100965 资助 L.C.，32100988 资助 W.Y.，31972916 资助 Z.S.）和四川大学全职博士后研究基金（2021SCU12003 资助 L.C.）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.05% 胰蛋白酶-EDTAGIBCOCat# 25300054
0.22 µM 滤膜Thermo Fisher ScientificCat# 42213-PS
100 kDa 截留分子量浓缩管Thermo Fisher ScientificCat# 88533
6 孔板CorningCat# 43016
96 孔板CorningCat# 3917
抑肽酶Sigma-AldrichCat# 9087-70-1
apyraseNEBCat# M0398S
杆状病毒转染试剂Thermo Fisher ScientificCat# 10362100用于制备 P0 代杆状病毒
苯甲脒Sigma-AldrichCat# B6506
CHO-K1ATCCN/A
CHSSigma-AldrichCat# C6512
CryoSPARCPunjani, A., 等, 2017https://cryosparc.com/
DH5α 感受态大肠杆菌Thermo Fisher ScientificCat# EC0112
D-荧光素钾盐Sigma- AldrichCat# 50227
DMSOSigma- AldrichCat# D2438
EDTAThermo Fisher ScientificCat# S311-500
ESF921 细胞培养基Expression SystemsCat#  96-001
ExcelmicrosoftN/A
F12 培养基InvitrogenCat# 11765
FBSCell BoxCat# SAG-01U-02
Flag 树脂Sigma- AldrichCat# A4596
福斯科林APExBIOCat# B1421
GctfZhang, 2016 https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/
GDNAnatraceCat# GDN101
凝胶过滤柱GE healthcareCat# 28990944
Gen5 3.11BIO-TEKN/A
庆大霉素SolarbioCat# L1312
GloSensor cAMP 检测试剂盒PromegaCat# E1291Gi 抑制型 cAMP 检测试剂盒
GloSensor 质粒PromegaCat# E2301传感器质粒
Grace’s 培养基GIBCOCat# 11595030
GraphPad Prism 8GraphpadN/A
HBSSThermo Fisher ScientificCat# 88284
HEPESSigma- AldrichCat# H4034
jetPRIME 试剂Polyplus TransfectionCat# 114-15转染试剂
嘉纳霉素SolarbioCat# K1030
LB 培养基InvitrogenCat# 12780052
亮抑蛋白酶肽Sigma-AldrichCat# L2884
LMNGAnatraceCat# NG310
MotionCor2(Zheng 等, 2017)https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software
NanoCabThermo Fisher ScientificCat# 1121822
PBSInvitrogenCat# 14190-144
pcDNA3.1-HA-FLAG-S1PRsGenScriptN/A
pFastBac1-GαiGenScriptN/A
pFastBac1-HA-FLAG-T4L-S1PRs-His10GenScriptN/A
pFastBacdual-Gβ1γ2GenScriptN/A
PureLink HiPure 质粒小提试剂盒InvitrogenCat# K210003用于质粒和 P0 代杆状病毒的制备
Q5 定点突变试剂盒NEBCat# E0554S用于质粒制备
Quantifoil 载网QuantifoilCat# 251448
RELION-3.1(Zivanov 等, 2018)https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion
S1PRs cDNAaddgeneN/A
scFv16InvitrogenCat# 703976
Sf9Expression SystemsN/A
西波尼莫德SelleckCat# S7179
胆酸钠Sigma-AldrichCat# C1254
Synergy H1 微孔板读板仪BIO-TEKN/A
合成 T4L DNA（序列）N/AN/AAacatcttcgagatgctgcgcatcgacgaagg
cctgcgtctcaagatttacaagaataccgaagg
ttattacacgattggcatcggccacctcctgaca
aagagcccatcactcaacgctgccaagtctga
actggacaaagccattggtcgcaacaccaac
ggtgtcattacaaaggacgaggcggagaaac
tcttcaaccaagatgtagatgcggctgtccgtgg
catcctgcgtaatgccaagttgaagcccgtgt
atgactcccttgatgctgttcgccgtgcagcctt
gatcaacatggttttccaaatgggtgagaccgg
agtggctggttttacgaactccctgcgcatgctcc
agcagaagcgctgggacgaggccgcagtga
atttggctaaatctcgctggtacaatcagacacc
taaccgtgccaagcgtgtcatcactaccttccg
tactggaacttgggacgcttac
TCEPThermo Fisher ScientificCat# 77720
四环素SolarbioCat# T8180
Vitrobot Mark IVThermo Fisher ScientificN/A

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