S1P 通过鞘氨醇-1-磷酸受体（S1PRs）亚家族发挥其多种生理作用。本文描述了一种用于阐明 S1PRs 结构与功能的研究流程。
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本文内容
摘要
摘要
溶血磷脂（LPLs）是一类具有生物活性的脂质，包括鞘氨醇-1-磷酸（S1P）、溶血磷脂酸等。S1P 是细胞膜中鞘脂类物质的代谢产物，是目前研究最为清楚的 LPL 之一，可通过鞘氨醇-1-磷酸受体（S1PRs）介导的信号通路调控多种细胞生理反应。via 该通路的作用表明，S1P-S1PRs 信号系统在多种疾病中具有重要的治疗潜力，这些疾病包括多发性硬化症（MS）、自身免疫性疾病、癌症、炎症，甚至包括 COVID-19。S1PRs 属于 A 类 G 蛋白偶联受体（GPCR）家族中的一个小亚类，包含五个亚型：S1PR1、S1PR2、S1PR3、S1PR4 和 S1PR5。然而，由于缺乏详细的结构信息，靶向 S1PRs 的药物研发受到阻碍。本文中，我们采用冷冻电子显微镜技术解析了 S1P-S1PRs 复合物的结构，并结合基于细胞的功能实验，阐明了其激活机制、药物选择性识别以及 G 蛋白偶联的分子基础。该策略也可用于研究其他溶血磷脂受体（LPLRs）及 G 蛋白偶联受体（GPCRs）。
引言
鞘氨醇-1-磷酸（S1P）是细胞膜鞘脂类的一种代谢产物，是一种普遍存在的溶血磷脂酸信号分子，参与多种生物学活动，包括淋巴细胞迁移、血管发育、内皮完整性以及心率调节1,2,3。S1P通过五种S1P受体亚型（S1PR1-5）发挥其多样的生理作用；这些受体分布于多种组织中，并对下游G蛋白表现出独特的偏好性4,5。S1PR1主要与Gi蛋白偶联，进而抑制cAMP的生成；S1PR2和S1PR3可与Gi、Gq及G12/13蛋白偶联，而S1PR4和S1PR5则通过Gi和G12/13蛋白传导信号6。
S1P-S1PR 信号通路是多种疾病的關鍵治療靶點，包括自身免疫性疾病7、炎症8、癌症9以及新型冠狀病毒病（COVID-19）10。2010年，芬戈莫德（fingolimod，FTY720）被批准作為首個靶向S1PRs的藥物，用於治療復發型多發性硬化症（MS）<....
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方案
1. S1PRs-蛋白G复合物的纯化
- 为纯化人S1PRs-蛋白G复合物，克隆S1PR1的cDNA 缺少C末端残基338-382的野生型S1PR3、C末端截短345-398的S1PR5以及野生型Gi1插入pFastBac1载体，以及野生型G的cDNAβ1 和 Gγ2插入pFastBacdual载体中（材料表).
注意：所有S1PR的构建体均包含血凝素（HA）信号序列，其N端带有Flag表位标签，C端带有10x his标签。此外，还包含一段合成DNA序列（材料表) 为了促进受体的表达与纯化，将用于翻译T4溶菌酶（T4L）的序列插入S1PRs的N端。 - 编码S1PRs、Gi1和G的杆状病毒的制备β1γ2
- 加入重组载体 50 µL DH5的α 感受态 大肠杆菌（Escherichia coli） 保存于 -80 °C 的 1.5 mL 离心管中80 °C，冰上孵育30分钟。
- 将细胞进行热激处理 42 °C 90秒后立即将其转移至冰上，冰浴2分钟。
- 震荡试管 37 °C 补充后3-5小时 300 µL 的溶菌肉汤（LB）培养基。平板 100 µL 将细胞接种至LB琼脂平板，并在 37....
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结果
在冷冻S1PRs-Gi复合物样品之前，需要通过尺寸排阻色谱法（SEC）对纯化后的样品进行分离，并利用凝胶过滤色谱进行分析。图2以S1PR3-Gi复合物为例进行展示。均一的GPCR-G蛋白复合物的主峰组分通常出现在尺寸排阻色谱的约10.5 mL处（图2A）。S1PR3-Gi复合物的SDS-PAGE分析结果（图2B）显示四条条带，分别对应S1PR3、Gαi、Gβ和scFv16的理论分子量，表明该复合物已成功纯化。受不同程度修饰（如糖基化或棕榈酰化）的影响，受体条带常呈现弥散状，而Gγ条带则未被检测到。
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讨论
本方案描述了通过冷冻电镜（cryo-EM）测定S1PRs结构以及通过Gi介导的cAMP抑制实验测定S1PRs激活效力的主要流程。其中某些步骤对实验成功至关重要。
为了纯化S1PRs-Gi复合物，应更加关注病毒的质量和sf9细胞的健康状态。在状态不佳的sf9细胞中，受体的表达水平会显著降低。通过测量细胞直径来评估sf9细胞的健康状况，健康的sf9细胞直径约为15 µm。S1PRs-Gi复合物的产量受到受体、Gi和Gβγ病毒体积比的影响，这一问题可通过体外组装S1PRs-G蛋白复合物来克服in vitro42。此外，GPCR-G蛋白复合物并不总是稳定的，因此开发了NanoBiT策略，并已被频繁用于稳定该复合物43。
样品的质量是冷冻电镜实验中一切工作的基础。在样品筛选过程中，经常观察到样品发生聚集或解离的现象。某些方法可能有助于G蛋白偶联受体（GP.......
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致谢
S1PRs-Gi 复合物的数据采集在四川大学华西冷冻电镜中心和南方科技大学（SUSTech）冷冻电镜中心完成，并在四川大学杜宇高性能计算中心进行处理。本研究受到国家自然科学基金（32100965 资助 L.C.，32100988 资助 W.Y.，31972916 资助 Z.S.）和四川大学全职博士后研究基金（2021SCU12003 资助 L.C.）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.05% 胰蛋白酶-EDTA | GIBCO | Cat# 25300054 | |
| 0.22 µM 滤膜 | Thermo Fisher Scientific | Cat# 42213-PS | |
| 100 kDa 截留分子量浓缩管 | Thermo Fisher Scientific | Cat# 88533 | |
| 6 孔板 | Corning | Cat# 43016 | |
| 96 孔板 | Corning | Cat# 3917 | |
| 抑肽酶 | Sigma-Aldrich | Cat# 9087-70-1 | |
| apyrase | NEB | Cat# M0398S | |
| 杆状病毒转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | Cat# 10362100 | 用于制备 P0 代杆状病毒 |
| 苯甲脒 | Sigma-Aldrich | Cat# B6506 | |
| CHO-K1 | ATCC | N/A | |
| CHS | Sigma-Aldrich | Cat# C6512 | |
| CryoSPARC | Punjani, A., 等, 2017 | https://cryosparc.com/ | |
| DH5α 感受态大肠杆菌 | Thermo Fisher Scientific | Cat# EC0112 | |
| D-荧光素钾盐 | Sigma- Aldrich | Cat# 50227 | |
| DMSO | Sigma- Aldrich | Cat# D2438 | |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific | Cat# S311-500 | |
| ESF921 细胞培养基 | Expression Systems | Cat# 96-001 | |
| Excel | microsoft | N/A | |
| F12 培养基 | Invitrogen | Cat# 11765 | |
| FBS | Cell Box | Cat# SAG-01U-02 | |
| Flag 树脂 | Sigma- Aldrich | Cat# A4596 | |
| 福斯科林 | APExBIO | Cat# B1421 | |
| Gctf | Zhang, 2016 | https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/ | |
| GDN | Anatrace | Cat# GDN101 | |
| 凝胶过滤柱 | GE healthcare | Cat# 28990944 | |
| Gen5 3.11 | BIO-TEK | N/A | |
| 庆大霉素 | Solarbio | Cat# L1312 | |
| GloSensor cAMP 检测试剂盒 | Promega | Cat# E1291 | Gi 抑制型 cAMP 检测试剂盒 |
| GloSensor 质粒 | Promega | Cat# E2301 | 传感器质粒 |
| Grace’s 培养基 | GIBCO | Cat# 11595030 | |
| GraphPad Prism 8 | Graphpad | N/A | |
| HBSS | Thermo Fisher Scientific | Cat# 88284 | |
| HEPES | Sigma- Aldrich | Cat# H4034 | |
| jetPRIME 试剂 | Polyplus Transfection | Cat# 114-15 | 转染试剂 |
| 嘉纳霉素 | Solarbio | Cat# K1030 | |
| LB 培养基 | Invitrogen | Cat# 12780052 | |
| 亮抑蛋白酶肽 | Sigma-Aldrich | Cat# L2884 | |
| LMNG | Anatrace | Cat# NG310 | |
| MotionCor2 | (Zheng 等, 2017) | https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software | |
| NanoCab | Thermo Fisher Scientific | Cat# 1121822 | |
| PBS | Invitrogen | Cat# 14190-144 | |
| pcDNA3.1-HA-FLAG-S1PRs | GenScript | N/A | |
| pFastBac1-Gαi | GenScript | N/A | |
| pFastBac1-HA-FLAG-T4L-S1PRs-His10 | GenScript | N/A | |
| pFastBacdual-Gβ1γ2 | GenScript | N/A | |
| PureLink HiPure 质粒小提试剂盒 | Invitrogen | Cat# K210003 | 用于质粒和 P0 代杆状病毒的制备 |
| Q5 定点突变试剂盒 | NEB | Cat# E0554S | 用于质粒制备 |
| Quantifoil 载网 | Quantifoil | Cat# 251448 | |
| RELION-3.1 | (Zivanov 等, 2018) | https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion | |
| S1PRs cDNA | addgene | N/A | |
| scFv16 | Invitrogen | Cat# 703976 | |
| Sf9 | Expression Systems | N/A | |
| 西波尼莫德 | Selleck | Cat# S7179 | |
| 胆酸钠 | Sigma-Aldrich | Cat# C1254 | |
| Synergy H1 微孔板读板仪 | BIO-TEK | N/A | |
| 合成 T4L DNA（序列） | N/A | N/A | Aacatcttcgagatgctgcgcatcgacgaagg cctgcgtctcaagatttacaagaataccgaagg ttattacacgattggcatcggccacctcctgaca aagagcccatcactcaacgctgccaagtctga actggacaaagccattggtcgcaacaccaac ggtgtcattacaaaggacgaggcggagaaac tcttcaaccaagatgtagatgcggctgtccgtgg catcctgcgtaatgccaagttgaagcccgtgt atgactcccttgatgctgttcgccgtgcagcctt gatcaacatggttttccaaatgggtgagaccgg agtggctggttttacgaactccctgcgcatgctcc agcagaagcgctgggacgaggccgcagtga atttggctaaatctcgctggtacaatcagacacc taaccgtgccaagcgtgtcatcactaccttccg tactggaacttgggacgcttac |
| TCEP | Thermo Fisher Scientific | Cat# 77720 | |
| 四环素 | Solarbio | Cat# T8180 | |
| Vitrobot Mark IV | Thermo Fisher Scientific | N/A |
参考文献
- Verstockt, B., et al. Sphingosine 1-phosphate modulation and immune cell trafficking in inflammatory bowel disease. Nature Reviews: Gastroenterology & Hepatology. , 1-16 (2022).
- Rosen, H., Stevens, R. C., Hanson, M., Roberts, E., Oldstone, M. B.
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