定制灌注生物反应器中猪带血管皮瓣的获取与灌注脱细胞处理

摘要

该方案描述了通过定制的灌注生物反应器，将十二烷基硫酸钠洗涤剂经皮瓣血管系统灌注，从而对手术获取的带血管猪皮瓣进行脱细胞处理的过程。

摘要

大体积软组织缺损可导致功能障碍，并显著影响患者的生活质量。尽管可通过自体游离皮瓣移植或带血管复合组织异体移植（VCA）进行手术重建，但这些方法也存在局限性。供区并发症及可用组织量有限等问题制约了自体游离皮瓣移植的应用，而VCA则受到免疫抑制治疗这一显著限制。在重建外科中，采用脱细胞/再细胞化方法制备的工程化组织代表了一种潜在解决方案。脱细胞组织通过特定方法去除原有细胞成分，同时保留其下方的细胞外基质（ECM）微观结构。这些无细胞支架随后可接种受者特异性细胞，实现再细胞化。

本方案详细描述了在猪模型中获取并进行脱细胞处理以获得无细胞支架的方法。此外，还介绍了灌注生物反应器的设计与组装。所涉及的皮瓣包括猪大网膜、阔筋膜张肌和桡侧前臂皮瓣。脱细胞处理通过灌注方法进行 通过离体实验 在定制的灌注生物反应器中，依次进行低浓度十二烷基硫酸钠（SDS）洗涤剂灌注、脱氧核糖核酸酶（DNase）酶处理以及过氧乙酸灭菌。

成功的组织脱细胞化在宏观上表现为瓣膜呈现白色不透明外观。组织学染色显示无细胞瓣膜中无细胞核，且DNA含量显著降低。本方案可高效用于制备保留细胞外基质（ECM）和血管微结构的脱细胞软组织支架。此类支架可用于后续的再细胞化研究，并在重建外科的临床转化中具有应用潜力。

引言

创伤性损伤和肿瘤切除可能导致大面积且复杂的软组织缺损。这些缺损会损害患者的生活质量，导致功能丧失，并引发永久性残疾。尽管自体组织皮瓣移植等技术已被广泛应用，但皮瓣来源有限以及供区并发症仍是主要局限性^1,2,3。血管化复合组织异体移植（VCA）是一种有前景的替代方案，可将多种复合组织（如肌肉、皮肤、血管等）作为一个整体单位移植给受者。然而，VCA需要长期使用免疫抑制剂，可能导致药物毒性、机会性感染以及恶性肿瘤的发生^4,5,6。

组织工程脱细胞支架可能是解决这些局限性的潜在方案⁷。脱细胞组织支架可通过脱细胞方法获得，该方法可去除天然组织中的细胞成分，同时保留其原有的细胞外基质（ECM）微观结构。与在组织工程中使用合成材料不同，使用生物来源的支架可提供一种仿生的ECM基质，具有良好的生物相容性，并具备临床转化潜力⁸。脱细胞处理后，再以受体特异性细胞对支架进行重新接种，即可生成具有功能且带血管化的组织，其免疫原性极低甚至....

方案

所有涉及动物实验的操作均经大学健康网络机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准，并严格遵循大学健康网络动物资源中心的方案与程序以及加拿大动物护理委员会指南。所有实验共使用五只约克夏猪（35-50 kg；年龄约12周）。

1. 灌注生物反应器的制备

1. 参见图1了解灌注生物反应器使用的所有组件。组织培养室的制备可采用市售的聚丙烯快锁容器，容器需带有防水、防气密封盖，并内置硅胶密封圈。确保容器可耐受高压灭菌。
2. 在容器两侧各钻一个1/4英寸的孔，穿入一段较短的L/S-16铂涂层硅胶管。其中一根用于输送灌注液流入，另一根用于流出。
3. 对于流入管路，在其内侧端部连接一个雄性鲁尔接头，用于连接组织插管；在外侧端部连接一个雌性鲁尔接头，用于连接三通旋塞阀。
4. 在培养室盖上钻一个1/4英寸的孔，穿入另一段较短的L/S-16铂涂层硅胶管，作为排气管。
5. 制备流入和流出管路时，取长约50 cm的L/S-16铂涂层硅胶管，一端连接黄色三滚泵管，另一端连接无菌的2 mL移液管，用于将灌注液从洗涤剂储液罐输送至生物反应器腔室。
6. 将所有组件（腔室和管路）分别用无菌包装纸包裹后进行高压灭菌。

结果

该血管化猪皮瓣脱细胞方案依赖于通过定制的灌注生物反应器，将基于离子型的去垢剂SDS经皮瓣血管系统进行灌注。在脱细胞处理前，根据主要供血血管，从猪模型中获取三个血管化的皮瓣并进行插管。获取皮瓣后立即进行冲洗，以维持血管通畅，确保后续脱细胞过程中的有效灌注。采用密封的带扣盖容器，设计了一种定制的生物反应器，使皮瓣可在封闭环境中完成灌注。在生物反应器内，通过连接至组织腔室的两台蠕动泵，实现皮瓣的单程灌注。灌注压力由内置压力传感器实时监测。

在脱细胞过程中，SDS 处理时间取决于所处理组织的类型。采用所述的灌注脱细胞技术，大网膜、阔筋膜张肌和桡动脉前臂皮瓣分别使用 0.05% SDS 脱细胞 2 天、3 天和 5 天。脱细胞后成功灭菌通过以下方式证实：对皮瓣进行拭子取样，并将拭子在琼脂平板上培养 14 天后未观察到微生物菌落生长。在整个脱细胞过程的所有阶段，三种皮瓣在 2 mL/min 的流速下监测灌注压力，压力范围为 20–60 mmHg。脱细胞完成后，在手动控制下对皮瓣进行冲洗，可见血液从留置用于自由引流的静脉套管流出（补充视频 1，补.......

讨论

本方案采用低浓度十二烷基硫酸钠（SDS）灌注法对多种猪源皮瓣进行脱细胞处理。通过该方法，可成功对大网膜、阔筋膜张肌和桡动脉前臂皮瓣进行脱细胞处理，且该方案优先使用低浓度SDS。初步优化实验结果表明，当使用组织学技术进行分析时，0.05%的低浓度SDS在2至5天内即可有效去除大网膜、阔筋膜张肌及桡动脉前臂皮瓣中的细胞成分（补充图1、补充图2、补充图3）。该方法操作简便，可在较短时间内以合理成本实现脱细胞。根据我们的经验，猪源皮瓣的脱细胞与灭菌过程通常需要2至5天，组织密度越高，所需脱细胞时间越长（例如前臂皮肤需5天，而大网膜仅需2天）。此外，本方案选择低浓度SDS的依据在于，0.05%的SDS浓度低于其临界胶束浓度（约0.2%²¹），因此该表面活性剂可有效溶解细胞膜，同时保留重要的生物活性细胞外基质（ECM）成分。本方案中低浓度SDS的使用，与既往研究者报道的在血管化筋膜皮瓣灌注脱细胞过程中使用相对较高浓度SDS（如1%）的方法形成对比^13,22

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.2 µm 孔径 Acrodisk 滤器	VWR	CA28143-310
0.9% 氯化钠溶液（生理盐水）	Baxter	JF7123
20 L 聚丙烯大容量瓶	Cole-Parmer	RK-62507-20
3-0 Sofsilk 非吸收性外科结扎线	Covidien	LS639
三通旋塞阀	Cole-Parmer	UZ-30600-04
Adson 镊子	Fine Science Tools	11027-12
抗生素-抗真菌素溶液，100X	Wisent	450-115-EL
硫酸阿托品 15 mg/30ml	Rafter 8 Products	238481
BD Angiocath 20 号导管	VWR	BD381134
BD Angiocath 22 号导管	VWR	BD381123
BD Angiocath 24 号导管	VWR	BD381112
氯化钙	Sigma-Aldrich	C4901	DNA酶辅因子
牛胰脱氧核糖核酸酶 I（DNase I）	Sigma-Aldrich	DN25
DNA 定量检测（Quant-iT PicoGreen 双链 DNA 检测试剂盒）	Invitrogen	P7589
DPBS，10X	Wisent	311-415-CL	不含 Ca++/Mg++
Halsted-Mosquito 止血钳	Fine Science Tools	13008-12
肝素，1000 I.U./mL	Leo Pharma A/S	453811
盐酸氯胺酮 5000 mg/50 ml	Bimeda-MTC Animal Health Inc.	612316
Ismatec 泵用 Tygon 三通管路	Cole-Parmer	RK-96450-40	内径： 1.85 mm
Ismatec REGLO 四通道泵	Cole-Parmer	78001-78
Ismatec 管路卡盒	Cole-Parmer	RK-78016-98
异氟烷 99.9%，250 ml	Pharmaceutical Partners of Canada Inc.	2231929
LB 琼脂 Lennox	Bioshop Canada	LBL406.500	无菌检测用琼脂平板
硫酸镁	Sigma-Aldrich	M7506	DNA酶辅因子
Masterflex L/S 16 管路	Cole-Parmer	RK-96410-16
咪达唑仑 50 mg/10 ml	Pharmaceutical Partners of Canada Inc.	2242905
单极电凝笔	Valleylab	E2100
10% 中性缓冲福尔马林	Sigma-Aldrich	HT501128
N°11 手术刀片	Swann Morton	303
木瓜蛋白酶（源自木瓜乳胶）	Sigma-Aldrich	P3125
过氧乙酸	Sigma-Aldrich	269336
用于 1/4" 转 1/8" 管内径的塑料带齿接头	McMaster-Carr	5117K61
塑料带齿管路 90° 弯头连接器	McMaster-Carr	5117K76
塑料快旋式管路堵头	McMaster-Carr	51525K143	雄性鲁尔接头
塑料快旋式管路插座	McMaster-Carr	51525K293	雌性鲁尔接头
活检打孔工具	Integra Miltex	3332
氯化钾 40 mEq/20 ml	Hospira Healthcare Corporation	37869
聚维酮碘，10%	Rougier	833133
血清移液管，2mL	Fisher Science	13-678-27D
带扣盖密封容器	SnapLock	142-3941-4
十二烷基硫酸钠粉末	Sigma-Aldrich	L4509
外科金属结扎夹，小型	Teleflex	001200
Stevens 肌腱剪，115 mm，直型	B. Braun	BC004R
TruWave 压力监测套件	Edwards Lifesciences	PX260