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方法文章

可现场部署的结合重组酶聚合酶扩增与CRISPR-Cas12a技术的Candidatus Liberibacter asiaticus检测方法

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DOI：

10.3791/64070

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2022年12月23日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1China-USA Citrus Huanglongbing Joint Laboratory, National Navel Orange Engineering Research Center, Gannan Normal University, 2Department of Biological Sciences, Gannan Normal University, 3Citrus Research and Education Center, Department of Microbiology and Cell Science, University of Florida - Institute of Food and Agricultural Sciences

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本研究建立了一种基于重组酶聚合酶扩增联合CRISPR-Cas12a的快速、灵敏且便携的Candidatus Liberibacter asiaticus检测方法。

摘要

柑橘种植者对Candidatus Liberibacter asiaticus（CLas）的早期检测有助于及时干预并防止病害扩散。本文介绍一种简便、快速且可便携的黄龙病（HLB）诊断方法，该方法结合了重组酶聚合酶扩增技术与基于CRISPR/Cas12a系统核酸酶活性的荧光报告体系。该技术的灵敏度远高于PCR。此外，当使用叶片样本时，该方法的结果与qPCR结果相似。与传统的CLas检测方法相比，本方法可在90分钟内完成，且在等温条件下进行，无需使用PCR仪。此外，检测结果可通过手持式荧光检测设备在田间直接观察。

引言

黄龙病（HLB）是全球最具危害性的柑橘病害之一1。HLB由韧皮部定殖且难以培养的细菌Candidatus Liberibacter spp.引起，包括Candidatus Liberibacter asiaticus（CLas）、Ca. L. africanus和Ca. L. americanus2。在中国和美国，最主要的HLB相关病原是CLas，其通过亚洲柑橘木虱（Diaphorina citri）传播或通过嫁接传播3。柑橘树感染CLas后，生长势逐渐衰退，最终死亡2。CLas感染的柑橘叶片常见症状包括斑驳黄化、绿岛（小型圆形深绿色斑点）、叶片增厚变革质化并伴有隆起的木栓化叶脉，以及新梢黄化不均匀2。此外，感染CLas的果实表现为个头偏小且形状歪斜2。

由于目前尚无对黄龙病（HLB）具有抗性的柑橘品种，且黄龙病尚无有效的治疗方法，因此预防黄龙病需要对检测出亚洲韧皮杆菌（CLas）阳性的柑橘树进行检疫和隔离2,3。因此，早期检测对于监测和实施检疫、防止CLas扩散以及减少经济损失至关重要3。此外，由于CLas在植物感染初期的菌体浓度较低，因此需要高灵敏度的CLas检测方法3。在中国，CLas检测通常由特定的认证检测中心进行。然而，检测过程通常至少需要1周时间，且检测费用较高。 因此，为协助监测黄龙病的发生情况

已采用多种技术来诊断黄龙病4,5,6,7,8,9。聚合酶链式反应（PCR）和定量PCR（qPCR）由于具有高灵敏度和高特异性，是检测CLas最常用的方法4,5。然而，这些技术严重依赖昂贵的仪器和高技能的专业人员。此外，已开发出多种等温扩增方法，例如环介导等温扩增（LAMP），因其操作简便、快速且成本低，被视为传统PCR方法的有吸引力的替代方案8,9,10。然而，由于存在非特异性扩增信号，可能导致假阳性结果，因此将其准确应用于CLas检测仍具挑战性。

基于RNA引导的CRISPR/Cas（成簇规律间隔短回文重复序列/CRISPR相关蛋白）核酸酶的核酸检测技术，因其高灵敏度、高特异性和高可靠性，已被开发为下一代分子诊断技术11,12,13,14。这些CRISPR/Cas诊断技术依赖Cas蛋白的附带核酸酶活性，切割两端分别标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团的单链DNA（ssDNA），并结合荧光检测设备捕获释放的荧光报告基团11,12。当CRISPR RNA（crRNA）与靶标序列形成双链结构后，可激活多种Cas效应蛋白的核酸酶活性，从而非特异性地切割周围非靶标的单链DNA11。CRISPR-Cas12a（亦称为Cpf1），属于第2类V-A型CRISPR/Cas系统，相较于Cas9具有若干优势，例如更低的错配容忍度和更高的特异性13。 Cas12a/crRNA系统已被成功应用于人源病原体和植物病原体核酸的高灵敏度、高特异性检测14,15,16,17,18。因此，利用Cas12a/crRNA系统应可实现对CLas核酸的准确且灵敏的检测。

理论上，仅使用Cas12a的灵敏度不足以检测低水平的核酸。因此，为了提高其检测灵敏度，CRISPR-Cas12a检测通常需结合等温扩增步骤14,15。重组酶聚合酶扩增（RPA）可在37 °C至42 °C的温度范围内实现灵敏且快速的等温DNA扩增19。

一种名为DETECTR（DNA核酸酶靶向CRISPR反式报告系统）的检测平台 recently 被开发出来12，该平台结合了Cas12a的DNase活性、RPA技术以及荧光信号读出，已被证明可更灵敏地检测核酸20。此外，阳性样本发出的荧光信号可在现场通过便携式荧光检测设备进行观察。

由于我们使用RPA扩增DNA，并设计了靶向五拷贝的crRNA nrdB (核糖核苷酸还原酶 β亚基) 针对CLas的基因特异性21，利用Cas12a蛋白的DNase活性，我们将这种CLas检测方法命名为CLas-DETECTR。与现有的CLas检测方法相比，CLas-DETECTR具有快速、准确、灵敏和可部署性强的优点。

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方案

1. CLas-DETECTR 的构建

注意：CLas-DETECTR 的构建包含四个步骤：溶液配制、柑橘总 DNA 提取、等温 DNA 扩增和结果可视化。CLas-DETECTR 检测方法的示意图见图 1A。

  1. 溶液配制
    1. 配制缓冲液A：6% PEG 200中的20 mM NaOH。配制100 mL时，将113 mg NaOH和6 g PEG 200加入80 mL H₂O中2瓶中的O。将瓶子置于60 °C水浴中孵育，直至所有PEG 200完全溶解。然后，加入H2加水至100 mL体积。
    2. 配制溶液B：每个反应中加入10 μL RPA缓冲液、0.8 μL F-RPA-RNRf、0.8 μL R-RPA-RNRr以及3.9 μL ddH₂O2加水至终体积为15.5 μL。
      注意：F-RPA-RNRf 和 R-RPA-RNRr 是用于针对 RNR 基因的等温扩增检测中的引物 nrdB 基因。参见 表1 用于该序列。
    3. 配制溶液C：每个反应中加入1 μL ssDNA报告探针、3 μL NEB buffer 3.1、1 μL crRNA、4 μL Cas12a和11 μL ddH₂O。2加水至终体积为20 μL。
      注意：如果待检测的样本较多，可先配制大量溶液B和溶液C，之后再分装使用。
  2. 柑橘总DNA提取
    注意：为了节省时间并使该方法适用于田间CLas检测，采用基于碱性聚乙二醇（PEG）的方法制备粗提植物DNA用于扩增22,23
    1. 本方案中使用了柑橘叶片。首先，从一片叶片上打取五个叶盘。然后，将叶盘放入一个1.5 mL微量离心管中，并加入200 μL缓冲液A。
      注意：在野外操作时，若叶片表面有灰尘，应先清洁叶片。可使用1.5 mL离心管的管盖作为打孔工具获取叶圆片，以避免交叉污染。本实验方案也可用于其他柑橘组织，如根、茎、果实和花。
    2. 用塑料棒手动研磨叶盘，直至均匀。
    3. 静置试管10分钟。然后，取上清液用于DNA扩增。
      注意：此处可暂停实验，通过碱性-PEG方法提取的粗制植物提取物可在−20 °C下保存至少1年。纽荷尔甜橙（Citrus sinensis 视频中展示的纽荷尔脐橙（Osbeck var. Newhall）植株种植于江西赣南师范大学校园内玻璃温室中的花盆里，盆内基质按9/3/1（v/v/v）体积比混合泥炭土、蛭石和珍珠岩。柑橘黄龙病（HLB）感染植株通过嫁接携带CLas阳性纽荷尔芽片进行接种。HLB感染与未感染植株均经PCR确认。采用针对CLas特异性标记基因的引物对（F-RPA-RNRf/R-RPA-RNRr）检测CLas。 nrdB另一方面，典型的黄龙病症状，如斑驳的花叶和叶片黄化，可在CLas阳性植株上观察到，但在CLas阴性植株上则无此现象。
  3. 等温DNA扩增
    1. 向溶液B中加入1 μL步骤1.2.3的上清液和1 μL MgOAc（终浓度为14 mM），充分混匀。
    2. 在实验室中，将它们置于简单的培养箱中，37 °C 孵育 15 分钟。
      注意：在野外操作时，可将试管握于手中孵育15分钟。若条件允许，建议将试管置于37 °C的简易孵育器中孵育15分钟。
  4. 结果可视化
    1. 将步骤1.3.2中的10 μL混合物加入溶液C中，充分混匀。
    2. 在37 °C培养箱中孵育60分钟。
    3. 佩戴护目镜，并通过观察5’端标记有6-荧光素、3’端标记有荧光淬灭剂的单链DNA报告分子所释放的绿色荧光信号 手持式荧光检测装置（激发波长：440 nm，发射波长：500 nm）。
      注意：绿色荧光信号可维持数天，最好在
      警告：荧光检测设备发出的光线对眼睛有害。观察结果前务必佩戴护目镜。

2. 特异性检测

注意：为了检测CLas-DETECTR的特异性，使用根际细菌 根癌农杆菌 GV3101 Xanthomonas citri 亚种 citri (Xcc，以及实验室分离的稳定伯克霍尔德菌1440菌株24 接受了CLas-DETECTR检测。 

注意： Candidatus Liberibacter（CLas）无法进行培养，只能通过提取感染CLas的柑橘组织中的基因组DNA来获得CLas DNA。Xcc 是另一种重要柑橘病害——柑橘溃疡病的致病菌。Burkholderia stabilis 菌株1440是一种在实验室中分离得到的抗Xcc 细菌。因此，本研究使用了这三种细菌的纯培养菌株

  1. 使用细菌基因组DNA提取试剂盒，按照制造商提供的说明书提取细菌基因组DNA（gDNA）。以水作为空白对照。
  2. 使用带光学盖的 0.2 mL PCR 管条进行 PCR 扩增 在含有1 μL F-RPA-RNRf、1 μL R-RPA-RNRr、12.5 μL Ex Taq Version 2.0 plus dye、1 μL DNA模板和9.5 μL H₂O的25 μL反应体系中2O.
    1. 使用以下热循环反应条件：98 °C 预变性 1 分钟；随后进行 35 个循环，每个循环包括 98 °C 变性 10 秒、55 °C 退火 30 秒、72 °C 延伸 15 秒；然后 72 °C 最终延伸 10 分钟；最后在 16 °C 保存。
    2. 在1%琼脂糖凝胶中以120 V电压电泳运行PCR产物15分钟。
  3. 在20 μL反应体系中进行qPCR，体系包含0.8 μL F-RPA-RNRf、0.8 μL R-RPA-RNRr、10 μL 2x TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)、1 μL DNA模板和7.4 μL H₂O。2O.
    1. 使用以下热循环反应条件：95 °C 下 30 s；随后进行 45 个循环，每个循环为 95 °C 下 5 s 和 60 °C 下 32 s；然后进行熔解曲线阶段，依次为 95 °C 下 15 s、60 °C 下 1 min 和 95 °C 下 15 s。
    2. 每次重复实验中包含三个技术重复。
  4. 按照步骤 1.1–1.4 执行 CLas-DETECTR 方法。

3. 灵敏度比较

  1. 为测试CLas DETECTR的灵敏度，按照上述方法，使用PCR、CLas-DETECTR和qPCR检测一系列CLas DNA片段稀释液。
  2. 扩增一段长度为1,060 bp的DNA片段 nrdB 使用引物组 F-RNR 和 R-RNR，在含有 4 μL F-RNR、4 μL R-RNR、50 μL PrimeSTAR Max Premix、2 μL DNA 模板和 40 μL H₂O 的 100 μL 反应体系中进行扩增2O，按照以下热循环反应条件进行（98 °C 预变性 30 s；随后进行 35 个循环：98 °C 变性 10 s，55 °C 退火 15 s，72 °C 延伸 30 s；然后 72 °C 最终延伸 10 min；最后于 16 °C 保存）。
    注意： nrdB（核糖核苷酸还原酶β亚基）基因特异于CLas21可以轻松获得 nrdB 使用引物组F-RNR和R-RNR对CLas阳性柑橘基因组DNA进行扩增，获得扩增子。引物组F-RNR和R-RNR可扩增出一段长度为1,060 bp的nrdB基因片段，而引物组F-RPA-RNR和R-RPA-RNR则扩增nrdB基因中的一段104 bp片段，该片段位于1,060 bp片段之内 nrdB 片段
  3. 使用DNA凝胶回收试剂盒，按照生产商说明书纯化PCR产物。
  4. 含有PCR产物的溶液进行稀释 nrdB 经灭菌处理的ddH中的扩增子2O.
  5. 计算目标序列的拷贝数 nrdB 使用市售的在线DNA拷贝数和稀释计算器确定基因的拷贝数。
  6. 制备含有 2.01 × 10 的 DNA 稀释液6 拷贝数/μL，2.01 × 105 拷贝数/μL，2.01 × 104 拷贝数/μL，2.01 × 103 拷贝数/μL，2.01 × 102 拷贝数/μL，2.01 × 101 拷贝数/μL，2.01 × 100 拷贝数/μL，以及 2.01 × 10−1 拷贝数/μL 的 CLas DNA 片段

4. 样品检测

注意：在完成特异性和灵敏度测试后，采用CLas-DETECTR方法检测了采自中国江西赣南师范大学校园内种质资源苗圃中种植的新会甜橙树的田间叶片样本中是否存在CLas。同时进行qPCR以验证检测结果。

  1. 总共检测15棵树。以水作为阴性对照。
  2. 按照上述方法进行CLas-DETECTR和qPCR检测。
    注意：由于CLas在柑橘中的分布不均，优先采集表现出黄龙病（HLB）症状的叶片。若植株外观健康，则随机采集叶片，以确保CLas-DETECTR系统正常工作。

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结果

本文介绍了一种便携式平台CLas-DETECTR，该平台结合了RPA与CRISPR-Cas12a系统，可用于田间柑橘黄龙病（HLB）的诊断。CLas-DETECTR的工作原理如图1A所示。

对PCR已确认含有CLas的柑橘黄龙病（HLB）感染与未感染的Newhall植株的叶片样本（图1B，CLas的存在经PCR确认，图1C）进行CLas-DETECTR检测时，HLB感染样本中观察到绿色荧光信号，而HLB未感染样本及阴性对照中未见荧光信号（图1D）。

我们利用从其他细菌中提取的核酸确定了CLas-DETECTR的特异性。在CLas-DETECTR检测中使用的引物F-RPA-RNRf和R-RPA-RNRr也用于PCR和qPCR。在PCR实验中，使用CLas阳性柑橘叶片gDNA扩增时可在琼脂糖凝胶...

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讨论

本研究介绍了一种快速便携的CLas检测方法，命名为CLas-DETECTR，该方法结合了RPA与CRISPR-Cas12a系统。工作流程如图所示 图1CLas-DETECTR 可特异性且灵敏地检测 CLas（图2 和 图3）。此外，使用 Newhall 叶片样品时，CLas-DETECTR 检测 CLas 的灵敏度与 qPCR 相当（图4值得注意的是，检测结果可通过手持式便携设备直接可视化，无需依赖实验室仪器，这对于柑橘黄龙病的实时诊断至关重要。

该实验方案有几个重要的注意事项。首先，在采样过程中必须严格避免交叉污染，因为CLas-DETECTR的灵敏度与qPCR相当。反应试剂不得暴露于强光下。所有步骤必须严格按照要求操作，以获得最佳结果。应设置阳性对照，即含有CLas特异性基因片段的质粒，以确保CLas-DET...

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披露

作者声明不存在任何竞争利益。

致谢

本工作由国家重点研发计划 & D 计划（2021YFD1400805），重大科学技术研发项目 &江西省杰出青年人才资助计划（20194ABC28007）、江西省教育厅科研项目（GJJ201449）以及江西省现代农业科学研究协同创新项目（JXXTCX2015002(3+2)-003）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
AxyPrep DNA 胶回收试剂盒Corning09319KE1中国
细菌基因组 DNA 提取试剂盒SolarbioD1600中国
EnGen LbCas12a TOLOBIO32104-01中国
Ex Taq Version 2.0 plus dyeTaKaRaRR902A中国
手持式荧光检测装置 LUYOR3415RG中国
打孔器 Deli114中国
醋酸镁，MgOAcTwistDxTABAS03KIT英国
NaOHSCR10019718中国
NEB buffer 3.1 NEBB7203美国
PCR 条形管LABSELECTPST-0208-FT-C中国
PEG 200 SigmaP3015美国
PrimeSTAR Max DNA 聚合酶TaKaRaR045A中国
Quick-Load Purple 1 kb Plus DNA Marker New England BiolabsN0550S美国
TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)TaKaRaRR820B中国
TwistAmp BasicTwistDxTABAS03KIT英国

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