啮齿类动物心脏中的病毒转基因表达及心脏心律失常风险评估

摘要

本方案描述了在超声心动图引导下，通过直接心肌内注射病毒在大鼠和小鼠心脏中实现外源基因表达的方法。同时，本文还介绍了通过程序性电刺激离体、Langendorff灌注心脏来评估心脏对心室心律失常易感性的方法。

摘要

心脏病是全球范围内导致发病和死亡的首要原因。由于操作简便 以及转基因品系丰富，啮齿类动物已成为心血管研究不可或缺的模型。然而，在心脏病患者中常导致死亡的自发性致死性心律失常，在啮齿类动物的心脏病模型中却较为罕见。这主要归因于人类 与啮齿类动物在心脏电生理特性上的物种差异，从而为利用啮齿类动物研究心律失常带来了挑战。本实验方案描述了一种通过超声心动图引导下肌肉内注射重组病毒（腺病毒和腺相关病毒），实现小鼠和大鼠心室心肌中高效转基因表达的技术。此外，本文还介绍了一种利用分离的、Langendorff灌流的小鼠和大鼠心脏，在肾上腺素能刺激与程序性电刺激条件下，可靠评估心脏对心律失常易感性的方法。这些技术对于研究心肌梗死等损伤后不良心脏重构相关的心律失常具有重要意义。

引言

心血管疾病是全球死亡的首要原因，仅在2017年就导致了1800万人死亡¹。啮齿类动物，尤其是小鼠和大鼠，由于易于操作且拥有多种转基因过表达或基因敲除品系，已成为心血管研究中最常用的模型。啮齿类动物模型对于理解心肌梗死²、高血压³、心力衰竭⁴和动脉粥样硬化⁵等疾病的发病机制以及识别潜在的新的治疗靶点具有基础性作用。然而，由于啮齿类动物心脏体积较小且心率较人类或大型动物模型更快，其在心脏心律失常研究中的应用受到限制。因此，小鼠或大鼠在心肌梗死后发生自发性致死性心律失常的情况极为罕见²。研究人员被迫专注于可能反映促心律失常基质的间接继发性改变，例如纤维化或基因表达变化，而无法观察到心律失常负荷或促心律失常倾向的有意义改变。为了克服这一局限性，本实验方案描述了一种方法，可用于可靠评估经基因修饰^6,7或心肌梗死²后小鼠和大鼠心脏对室性心动过速性心律失常的易感性。该方法结合肾上腺素能受体刺激与程序性电刺激，用于在离体的、Langendorff灌注⁸的....

方案

本研究中描述的所有方法和操作程序均经渥太华大学动物研究伦理审查委员会以及渥太华心脏研究所生物安全审查委员会批准。Ctnnb1^flox/flox 和 αMHC-MerCreMer 小鼠（8–12 周龄，性别不限）以及 Sprague-Dawley 大鼠（200–250 g，雄性）用于本研究。实验动物购自商业来源（见材料表）。所有涉及动物的操作均由经过机构监管委员会培训并获准的人员执行。在所有操作过程中均使用了适当的人体防护装备。所有与重组腺病毒或腺相关病毒（AAV）相关的操作均在二级生物安全柜中进行。所有接触过病毒的物品在实验结束后均经过彻底去污处理。

1. 啮齿类动物心室组织中的病毒转基因表达

注意：将表达目标基因的重组腺病毒或AAV以及相应的对照病毒（如Ad-GFP（滴度为1 × 10¹⁰ PFU/mL）或AAV9-GFP（滴度为1 × 10¹³ GC/mL））（见材料表）保存于−80 °C冰箱中。

1. 在病毒注射当天，将病毒置于冰上解冻。分别用两支带有30 G 1/2针头的注射器（体积 = 50 µL）吸取表达目标基因的病毒和对照病毒，并在使用前保持在冰上。
   注意：必须小心去除注射器和针头中的任何气泡....

结果

按照本文所述方案灌流时（图1），离体大鼠或小鼠心脏可稳定、节律性地搏动至少4小时。若实验设计需要更长时间的心脏灌流，可在灌流液中添加白蛋白，以减少长时间灌流后心肌水肿的发生¹⁴。在灌流液中加入异丙肾上腺素可模拟在心肌梗死和心力衰竭等多种致心律失常条件下所发生的交感神经系统激活。在程序性电刺激过程中，心脏起搏成功可通过以下两点确认：（1）连续S1刺激期间出现1:1的心搏捕获；（2）S1起搏期间QRS波群延长（或增宽）（图3 和 图4）。后者是因为心脏在心尖部位被起搏，而心室组织中电活动传导较慢，导致QRS波群持续时间增加。

如已发表的数据^2,7（图3 和

讨论

Langendorff灌流离体心脏制备的成功依赖于多个关键步骤。首先，在心脏采集过程中必须避免任何损伤（例如因意外挤压或使用剪刀切割造成损伤）。其次，采集后应尽快将心脏放入冷的台氏液中，因为这可以停止心脏跳动并降低心肌的耗氧量。第三，将针头插入主动脉时深度不宜过深——理想情况下，针尖应接近主动脉瓣水平，以确保冠状动脉得到充分灌流。最后，在进行主动脉插管前必须清除灌流针头内的气泡——通常在插管前短暂启动灌流泵数秒钟，有助于排出针尖处的气泡。

离体心脏灌流制备具有多个优于其他方法的优势 体内 在动物研究中，该方法具有以下优势：首先，能够精确控制施加于心脏的药物浓度和作用时间（例如本研究中使用的异丙肾上腺素）；其次，便于对心脏不同区域进行干预操作，例如在心尖部位进行电刺激起搏（如本文所述），或记录生理信号（例如在心室组织负载Ca²⁺敏感荧光染料后进行光学标测）²⁺-敏感或电压敏感性染料（此处未描述）。此外，通过将球囊插入左心室并将其连接至压力传感器，可方便地测量心脏功能，如心室收缩力。⁸第三，可在排除.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
30 G 1/2 PrecisionGlide 针头	Becton Dickinson (BD)	305106
腺相关病毒（AAV9-GFP）	Vector Biolabs	7007
腺病毒（Ad-GFP）	Vector Biolabs	1060
腺病毒（Ad-Wnt3a）	Vector Biolabs	ADV-276318
生物安全柜（II 级）	Microzone Corporation	N/A	型号：BK-2-4
布托啡诺	Vetergesic	DIN 02342510
氯化钙	Sigma-Aldrich	102378
D-葡萄糖	Fisher Chemical	D16-1
毛发剪	WAHL Clipper Corporation	78001
Hamilton 注射器	Sigma-Aldrich	20701	705 LT，第50卷 μL
加热垫	Life Brand	E12107
肝素	Fresenius Kabi	DIN 02264315
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
异氟烷	Fresenius Kabi Ltd.	M60303
盐酸异丙肾上腺素	Sigma-Aldrich	1351005
LabChart 8 软件	ADInstruments 公司	版本 8.1.5	用于心电图记录
六水合氯化镁	Sigma-Aldrich	M2393
小鼠（Ctnnb1flox/flox)	杰克逊实验室	4152
小鼠（αMHC-MerCreMer	杰克逊实验室	5650
显微镜	Leica	S9i	用于兰格多夫系统
MS400 探头	VisualSonic 公司	N/A
眼用软膏	Systane	DIN 02444062
氯化钾（KCl）	Sigma-Aldrich	P9541
压力计	NETECH	DigiMano 1000	用于兰格多夫系统
泵	Cole-Parmer	UZ-77924-65	用于兰格多夫系统
大鼠（Sprague-Dawley，雄性）	Charles River	400
手术刀片	精细科学工具	10010-00
手术刀柄	精细科学工具	10007-12
硅酮弹性体	Down Inc.	Sylgard 184	用于兰格多夫系统
小型动物心电图系统	ADInstruments 公司	N/A	Powerlab 8/35 和 Animal Bio Amp
氯化钠	Sigma-Aldrich	S7653
氢氧化钠	Sigma-Aldrich	567530
刺激器	IonOptix	MyoPacer EP
VEVO3100 临床前成像系统	VisualSonic 公司	N/A