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啮齿类动物心脏中的病毒转基因表达及心脏心律失常风险评估

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DOI：

10.3791/64073

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2022年7月27日

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1University of Ottawa Heart Institute, 2Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Ottawa, 3Department of Biochemistry, Microbiology and Immunology, University of Ottawa

本文内容

摘要

本方案描述了在超声心动图引导下，通过直接心肌内注射病毒在大鼠和小鼠心脏中实现外源基因表达的方法。同时，本文还介绍了通过程序性电刺激离体、Langendorff灌注心脏来评估心脏对心室心律失常易感性的方法。

摘要

心脏病是全球范围内导致发病和死亡的首要原因。由于操作简便 以及转基因品系丰富，啮齿类动物已成为心血管研究不可或缺的模型。然而，在心脏病患者中常导致死亡的自发性致死性心律失常，在啮齿类动物的心脏病模型中却较为罕见。这主要归因于人类 与啮齿类动物在心脏电生理特性上的物种差异，从而为利用啮齿类动物研究心律失常带来了挑战。本实验方案描述了一种通过超声心动图引导下肌肉内注射重组病毒（腺病毒和腺相关病毒），实现小鼠和大鼠心室心肌中高效转基因表达的技术。此外，本文还介绍了一种利用分离的、Langendorff灌流的小鼠和大鼠心脏，在肾上腺素能刺激与程序性电刺激条件下，可靠评估心脏对心律失常易感性的方法。这些技术对于研究心肌梗死等损伤后不良心脏重构相关的心律失常具有重要意义。

引言

心血管疾病是全球死亡的首要原因，仅在2017年就导致了1800万人死亡1。啮齿类动物，尤其是小鼠和大鼠，由于易于操作且拥有多种转基因过表达或基因敲除品系，已成为心血管研究中最常用的模型。啮齿类动物模型对于理解心肌梗死2、高血压3、心力衰竭4和动脉粥样硬化5等疾病的发病机制以及识别潜在的新的治疗靶点具有基础性作用。然而，由于啮齿类动物心脏体积较小且心率较人类或大型动物模型更快，其在心脏心律失常研究中的应用受到限制。因此，小鼠或大鼠在心肌梗死后发生自发性致死性心律失常的情况极为罕见2。研究人员被迫专注于可能反映促心律失常基质的间接继发性改变，例如纤维化或基因表达变化，而无法观察到心律失常负荷或促心律失常倾向的有意义改变。为了克服这一局限性，本实验方案描述了一种方法，可用于可靠评估经基因修饰6,7或心肌梗死2后小鼠和大鼠心脏对室性心动过速性心律失常的易感性。该方法结合肾上腺素能受体刺激与程序性电刺激，用于在离体的、Langendorff灌注8的小鼠和大鼠心脏中诱导室性心动过速性心律失常。

在啮齿类动物心肌组织中进行病毒基因转移的标准方法通常需要通过开胸手术暴露心脏9,10,11，这是一种侵入性操作，可能导致动物在术后恢复延迟。本文介绍了一种直接心肌内注射的方法 在超声成像引导下对病毒进行注射以实现外源基因的过表达。相较于开胸手术，这种侵入性更小的操作方式可加快动物在病毒注射后的恢复速度，减少组织损伤，降低术后疼痛与炎症反应，从而更准确地评估基因过表达所产生的效应 转基因对心脏功能的影响。

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方案

本研究中描述的所有方法和操作程序均经渥太华大学动物研究伦理审查委员会以及渥太华心脏研究所生物安全审查委员会批准。Ctnnb1flox/flox 和 αMHC-MerCreMer 小鼠（8–12 周龄，性别不限）以及 Sprague-Dawley 大鼠（200–250 g，雄性）用于本研究。实验动物购自商业来源（见材料表）。所有涉及动物的操作均由经过机构监管委员会培训并获准的人员执行。在所有操作过程中均使用了适当的人体防护装备。所有与重组腺病毒或腺相关病毒（AAV）相关的操作均在二级生物安全柜中进行。所有接触过病毒的物品在实验结束后均经过彻底去污处理。

1. 啮齿类动物心室组织中的病毒转基因表达

注意：将表达目标基因的重组腺病毒或AAV以及相应的对照病毒（如Ad-GFP（滴度为1 × 1010 PFU/mL）或AAV9-GFP（滴度为1 × 1013 GC/mL））（见材料表）保存于−80 °C冰箱中。

  1. 在病毒注射当天，将病毒置于冰上解冻。分别用两支带有30 G 1/2针头的注射器（体积 = 50 µL）吸取表达目标基因的病毒和对照病毒，并在使用前保持在冰上。
    注意：必须小心去除注射器和针头中的任何气泡。
  2. 对大鼠或小鼠给予丁丙诺啡（大鼠剂量为0.05 mg/kg，小鼠剂量为0.1 mg/kg，皮下注射），1小时后使用3%异氟烷诱导麻醉，并在后续操作中以100%氧气（流速为 0.5–1.0 L/min）维持2%异氟烷麻醉。
  3. 用镊子轻轻夹住动物身体（例如尾巴），若动物对夹持无任何身体反应，则确认已达到适当麻醉状态。
  4. 使用电热垫维持动物体温在37 °C。使用毛发修剪器剃除胸部区域的毛发。
    注意：使用电热垫时需谨慎，因其可能存在热量分布不均的情况。
  5. 在双眼涂抹眼用软膏，以防止角膜干燥。
  6. 将动物保持仰卧位，并使用临床前成像系统（见材料表）对动物心脏进行短轴切面的超声成像。
    注意：以下步骤均在II级生物安全柜中进行，以提供无菌环境。采用包括安全针具操作在内的标准安全程序。
  7. 用碘伏或氯己定消毒液与酒精交替擦拭动物 左下胸部区域，以圆形方式重复三次。
  8. 在超声成像引导下，将步骤1.1中准备好的含病毒注射器的 30 G 1/2 针头从动物身体左侧下胸部插入胸腔。
  9. 将针尖推进至左心室前游离壁，并缓慢注射10–15 μL病毒。通过超声图像中针尖附近回声增强来确认注射成功。
    注意：每个注射位点的病毒注射量不得超过15 μL，以避免对心肌组织造成物理损伤。
  10. 将针头从心脏退出后，插入左心室其他区域，进行第二和第三次相同剂量的病毒注射。
    注意：总注射位点数量由实验设计决定。若需要局灶性转基因表达，仅需一次注射；若需要更广泛的转基因表达，通常需要多个注射位点（三至五个）。
  11. 完成注射后，将动物放回笼中。
  12. 密切监测动物，直至其恢复足够的意识以维持胸卧位，然后将其送回饲养室。
  13. 在接下来的2天内，给予动物盐酸丁丙诺啡（小鼠0.1 mg/kg，每日两次；大鼠0.05 mg/kg，每日两次，皮下注射）。将动物送回动物房，并每日监测是否有异常疼痛或痛苦迹象，如发现异常，应按照机构动物护理委员会的规程进行处理。

2. 心律失常易感性的评估

注意：在腺病毒注射后4-6天以及AAV注射后1-2周，按照步骤2.1-2.2评估动物心脏对心律失常的易感性。

  1. 对大鼠或小鼠心脏进行朗根多夫灌注。
    1. 通过向 1 L 水中加入以下成分来配制 Tyrode 溶液：NaCl，7.9 g（终浓度 = 135 mM）；KCl，0.37 g（5.0 mM）；CaCl₂2，0.27 g（1.8 mM）；MgCl₂2，0.24 g（1.2 mM）；HEPES，2.38 g（10 mM）；葡萄糖，1.8 g（10 mM）。用 NaOH 调节 pH 至 7.40（见 材料表).
    2. 使用0.2 μm滤器过滤溶液，并用100% O₂鼓泡2 在步骤 2.1.6–2.2.8 期间持续进行
    3. 向大鼠或小鼠腹腔注射肝素（500 U/kg），10 分钟后使用 3% 异氟烷进行麻醉。通过轻捏动物身体确认麻醉程度是否充分。
    4. 使用手术刀在锁骨中线处做一1-1.5 cm的纵向切口，进行左侧开胸术，暴露心脏。
    5. 在主动脉弓水平用剪刀剪下心脏，并立即放入冰冻的Tyrode溶液中。
      ​注意：采集心脏时需小心操作，避免损伤心脏。
    6. 用钝针（大鼠使用18 G，小鼠使用23 G）连接改良的朗根多夫灌流系统，插管心脏的主动脉（参见 材料表) 在恒定流速模式下，调节流速以维持灌注压在70-80 mmHg。
      注意：主动脉插管前必须排除灌注针中的任何气泡。使用解剖显微镜有助于插管操作。
    7. 将插管的心脏置于硅酮弹性体包被的9，将10 cm塑料培养皿中的心脏左心室朝上并灌注心脏9,12 与O2-在37 °C下通入气体的Tyrode溶液。
    8. 通过观察灌注开始时前两到三个心跳周期内心脏血液被冲洗出以及心脏颜色由红色变为苍白，来确认主动脉插管正确。
    9. 放置小型动物心电图系统的电极（参见 材料表）围绕心脏，通过将它们插入培养皿中硅胶弹性体涂层内（图1使用兼容软件记录心电图。
  2. 进行肾上腺素能受体刺激和程序性电刺激以诱发室性心动过速心律失常。
    1. 成功进行主动脉插管后，继续用Tyrode溶液灌注心脏20分钟，以稳定心脏制备。
    2. 加入1 μM异丙肾上腺素（参见 材料表) 加入用于心脏灌注的Tyrode液中（步骤2.2.3–2.2.8）。
    3. 异丙肾上腺素灌注10分钟后，使用连接至电刺激器的两个铂电极在心尖部位刺激心脏（参见 材料表).
    4. 从刺激程序开始（图2），包括10个连续刺激（S1，5 V，100 ms 间隔），随后是一个额外刺激（S2），其初始间隔为80 ms。每次将S2间隔递减2 ms，直至无法捕获心跳反应（即达到心脏的有效不应期，ERP）13.
    5. 通过心电图监测任何诱发的室性心动过速性心律失常（包括室性心动过速和心室颤动）。
    6. 如果上述步骤未诱发出心律失常，则在S2之后增加第三个额外刺激（S3），初始间期为80 ms，以2 ms递减，直至达到有效不应期（ERP）。
    7. 若仍未诱发出室性心动过速或心律失常，可在S3之后再增加一个额外刺激（S4），其初始和递减间期与前述相同，直至达到有效不应期。
    8. 如果仍未诱发出室性心动过速（如对照组健康心脏所预期的那样），则停止电刺激方案，并认定该心脏为不可诱导。

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结果

按照本文所述方案灌流时（图1），离体大鼠或小鼠心脏可稳定、节律性地搏动至少4小时。若实验设计需要更长时间的心脏灌流，可在灌流液中添加白蛋白，以减少长时间灌流后心肌水肿的发生14。在灌流液中加入异丙肾上腺素可模拟在心肌梗死和心力衰竭等多种致心律失常条件下所发生的交感神经系统激活。在程序性电刺激过程中，心脏起搏成功可通过以下两点确认：（1）连续S1刺激期间出现1:1的心搏捕获；（2）S1起搏期间QRS波群延长（或增宽）（图3 和 图4）。后者是因为心脏在心尖部位被起搏，而心室组织中电活动传导较慢，导致QRS波群持续时间增加。

如已发表的数据2,7（图3 和

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讨论

Langendorff灌流离体心脏制备的成功依赖于多个关键步骤。首先，在心脏采集过程中必须避免任何损伤（例如因意外挤压或使用剪刀切割造成损伤）。其次，采集后应尽快将心脏放入冷的台氏液中，因为这可以停止心脏跳动并降低心肌的耗氧量。第三，将针头插入主动脉时深度不宜过深——理想情况下，针尖应接近主动脉瓣水平，以确保冠状动脉得到充分灌流。最后，在进行主动脉插管前必须清除灌流针头内的气泡——通常在插管前短暂启动灌流泵数秒钟，有助于排出针尖处的气泡。

离体心脏灌流制备具有多个优于其他方法的优势 体内 在动物研究中，该方法具有以下优势：首先，能够精确控制施加于心脏的药物浓度和作用时间（例如本研究中使用的异丙肾上腺素）；其次，便于对心脏不同区域进行干预操作，例如在心尖部位进行电刺激起搏（如本文所述），或记录生理信号（例如在心室组织负载Ca²⁺敏感荧光染料后进行光学标测）2+-敏感或电压敏感性染料（此处未描述）。此外，通过将球囊插入左心室并将其连接至压力传感器，可方便地测量心脏功能，如心室收缩力。8第三，可在排除...

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披露

作者无竞争性财务利益。

致谢

本研究工作得到了加拿大卫生研究院（CIHR）项目资助（PJT-148918 和 PJT-180533，授予 WL）、CIHR 早期职业研究者奖（AR8-162705，授予 WL）、加拿大心脏与中风基金会（HSFC）麦克唐纳奖学金及新研究者奖（S-17-LI-0866，授予 WL）、博士生奖学金（授予 JW 和 YX）以及渥太华心脏研究所心脏研究捐赠基金提供的博士后奖学金（授予 AL）的支持。作者感谢 Richard Seymour 先生提供的技术支持。图 2 使用 Biorender.com 在获得授权许可的情况下绘制。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
30 G 1/2 PrecisionGlide 针头Becton Dickinson (BD)305106
腺相关病毒（AAV9-GFP）Vector Biolabs7007
腺病毒（Ad-GFP）Vector Biolabs1060
腺病毒（Ad-Wnt3a）Vector BiolabsADV-276318
生物安全柜（II 级）Microzone CorporationN/A型号：BK-2-4
布托啡诺VetergesicDIN 02342510
氯化钙Sigma-Aldrich102378
D-葡萄糖Fisher ChemicalD16-1
毛发剪WAHL Clipper Corporation78001
Hamilton 注射器Sigma-Aldrich20701705 LT，第50卷 μL
加热垫Life BrandE12107
肝素Fresenius KabiDIN 02264315
HEPESSigma-AldrichH4034
异氟烷Fresenius Kabi Ltd.M60303
盐酸异丙肾上腺素Sigma-Aldrich1351005
LabChart 8 软件ADInstruments 公司版本 8.1.5用于心电图记录
六水合氯化镁Sigma-AldrichM2393
小鼠（Ctnnb1flox/flox)杰克逊实验室4152
小鼠（αMHC-MerCreMer杰克逊实验室5650
显微镜LeicaS9i用于兰格多夫系统
MS400 探头VisualSonic 公司N/A
眼用软膏SystaneDIN 02444062
氯化钾（KCl）Sigma-AldrichP9541
压力计NETECHDigiMano 1000用于兰格多夫系统
泵Cole-ParmerUZ-77924-65用于兰格多夫系统
大鼠（Sprague-Dawley，雄性）Charles River400
手术刀片精细科学工具10010-00
手术刀柄精细科学工具10007-12
硅酮弹性体Down Inc.Sylgard 184用于兰格多夫系统
小型动物心电图系统ADInstruments 公司N/APowerlab 8/35 和 Animal Bio Amp
氯化钠Sigma-AldrichS7653
氢氧化钠Sigma-Aldrich567530
刺激器IonOptixMyoPacer EP
VEVO3100 临床前成像系统VisualSonic 公司N/A

参考文献

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