在膜上重建隔蛋白组装以研究其生物物理特性与功能

摘要

无细胞重建是研究细胞骨架组装的关键工具，过去十年的研究已建立了在简化系统中研究 septin 动态的方法。本文介绍了三种互补的方法，用于在不同膜环境中观察 septin 的组装：平面双层膜、球形支撑体和杆状支撑体。

摘要

大多数细胞能够感知并改变其形态，以执行基本的细胞活动。在许多真核生物中，Septin细胞骨架是协调细胞形态变化（如胞质分裂、极性生长和迁移）的关键组分。Septin是一类能够形成丝状结构的蛋白质，可组装成多种高级结构，在许多情况下分布于质膜的不同区域，尤其集中在微米尺度正曲率的膜区域。监测Septin组装过程 在体 由于光学显微镜在细胞中的局限性，以及 Septin 与膜结构和细胞骨架成分相互作用的复杂性，使得在活体系统中量化 Septin 动态变得困难。幸运的是，在过去十年中，已在无细胞体系中成功重建 Septin 细胞骨架，从而能够在高时空分辨率下解析调控 Septin 组装的分子机制。Septin 组装的核心步骤包括：Septin 异源寡聚体与膜的结合与解离、聚合成丝状结构，以及通过丝状体之间的相互作用形成更高阶的结构。本文介绍了三种在不同条件下观察 Septin 组装的方法：平面双分子层、球形支撑体和棒状支撑体。这些方法可用于测定 Septin 在不同组装阶段的生物物理参数：单个八聚体与膜结合的状态、丝状体状态，以及丝状体的组装态。我们将这些参数与曲率感知和优先吸附的实验测量相结合，以理解曲率感应在多种空间和时间尺度上的作用机制。

引言

细胞及其许多内部区室的形态依赖于包围它们的脂质膜。膜是具有黏弹性的结构，可通过与蛋白质的相互作用、脂质分选以及内外部作用力的参与发生形变，从而形成多种多样的形态^1,2,3,4。这些形态通常以膜曲率来描述。细胞利用多种不同的蛋白质，这些蛋白质能够优先组装到特定曲率的膜上，或"感知"特定的膜曲率，从而确保对细胞运输、胞质分裂和细胞迁移等过程实现精确的时空调控^5,6。由于难以在时间分辨率、空间分辨率与细胞健康之间取得平衡，细胞膜上分子机器动态过程的观测尤为困难。尽管超分辨率成像技术可提供这些结构的详细视图，但其成像过程耗时较长，难以匹配大多数分子机器组装与解聚的时间尺度。此外，这些复合物在其天然环境中具有复杂的分子组成，且单个组分可能具有多种功能，因此构建简化的重建系统成为研究分子功能能力的重要工具。

已开发出最小化的膜模拟物，用于在细胞外研究膜的性质及蛋白质与膜之间的相互作用。膜模拟物包括游离脂质双层（如脂质体或巨型单层脂质囊泡）以及支撑脂质双层（SLBs）。^....

方案

注意：制备支撑脂质双层需要先制备单一分散的小单层囊泡（SUVs）。有关SUV的制备，请参考先前发表的方案²⁴。简而言之，所有SUV均通过探针超声处理制备，总时长为12分钟，超声功率为70%，采用4分钟超声与2分钟冰水浴中静置交替进行的方式。SUV溶液必须澄清且粒径均一。SUV的粒径分布可通过例如动态光散射²⁵等方法测定。

1. 平面脂双层

1. 载玻片的等离子清洗
   注意：等离子清洗可去除有机污染物，并增强玻璃表面的亲水性，从而确保脂质有效吸附。以下步骤可能需要根据所使用的等离子清洗仪和玻璃盖玻片进行调整或优化。
   1. 使用氧气对等离子清洗仪吹扫5分钟，以清除管路和腔室中的空气。此步骤可确保在运行等离子清洗时，管路和腔室内主要为氧气，从而获得更一致的双分子层制备效果。
   2. 在吹扫的同时，用惰性气体（如N₂或Ar）吹拂微型盖玻片表面，以去除灰尘和颗粒物。
      可选：可用100%异丙醇喷洒盖玻片两面，随后用水冲洗。重复异丙醇-水清洗3次，再用N₂气流吹干。
   3. 将干燥的盖玻片整齐排列于陶瓷支架中。将支架置于等离子腔室后部，使盖玻片与腔室长边平行（以确保等离子清洗过程中盖玻片保持稳定）。以最大功率在氧气环境中运行等离....

结果

在制备每张支持性脂双层（SLB）后，可将septin蛋白或目标蛋白与所需的支撑表面孵育，并通过全内反射荧光显微镜（TIRFM）、共聚焦显微镜或扫描电镜（SEM）进行成像。本文所示结果使用了从E. coli¹⁷中重组表达并纯化的septin蛋白。利用TIRFM对平面SLB进行观察，可测定丝状结构的长度及其柔韧性，测量扩散系数，并实时观察其组装过程^28,29。为了获得最高质量的测量数据，首先必须确认脂双层的质量，尤其是在首次制备或改变脂质组成时。通过TIRFM对双分子层上蛋白分布进行视觉检查，有助于识别被划伤或形态异常的区域。蛋白分布应均匀（图3A），双分子层上不应出现孔洞或间隙（图3B）。应尽量避免使用带有孔洞的膜，因为这些孔洞可能由灰尘污染或载玻片操作时的污迹引起，进而影响双分子层其他区域的蛋白分布。为直接观察膜结构本身，可在小单层囊泡（.......

讨论

细胞膜具有多种不同的形态、曲率和理化性质。为了研究细胞如何通过纳米级的分子机制构建微米级的结构，有必要设计出膜模拟物的最小重建系统。本方案介绍了一种能够精确控制膜曲率和组分的技术，同时允许使用者利用广泛可用的显微镜技术轻松进行定量荧光测量。

本方案最关键的步骤是将小室组装在合适的表面上并正确处理脂质。本文所述的小室是使用PCR管和紫外光激活胶水手工制作的；组装过程中应避免将胶水沾到反应区域内部。实验过程中可通过成像观察小室边缘，检查盖玻片上是否存在蛋白质过度吸附，以判断是否发生污染。使用者也可选择其他材料制作小室，例如可从商业渠道购买的硅胶小室，但本文所述方法可制备出坚固、不易移动或泄漏且能容纳较大反应体积的小室。据我们经验，盖玻片的表面特性对于形成平面双分子层极为重要。为实现双分子层的均匀形成，可能需要优化等离子清洗时间，甚至更换不同品牌的盖玻片，因为适当的表面处理和表面电荷对于囊泡的吸附与融合至关重要^31,32,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.2 mL 平盖 PCR 管，透明	Watson	137-211C(EX)
0.5 mL 低吸附管	USA Scientific	1405-2600
β-巯基乙醇（BME）	Sigma-Aldrich	M6250-100ML
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma-Aldrich	A4612-25G
用于制备 PEG 修饰盖玻片的盖玻片	Thermo Scientific	152450	Richard-Allan Scientific SLIP-RITE Cover Glass 24x50 #1.5
DOPC	Avanti Polar Lipids	850375
卵磷脂罗丹明 PE	Avanti Polar Lipids	810146
EMS 25% 水溶液戊二醛，电镜级	VWR	16220
EMS 卡可基酸钠缓冲液	VWR	11652
乙醇，200 证明	Fisher Scientific	04-355-223EA
HEPES	Sigma Aldrich	H3375-1KG
六甲基二硅氮烷	Sigma-Aldrich	440191
氯化镁	VWR	7791-18-6
甲基纤维素 4000cp	Sigma-Aldrich	M052-100G
用于平面双层膜的微型玻璃盖玻片	Matsunami	已停产	22x22
迷你离心机
非功能化二氧化硅微球	Bangs Laboratories, Inc.	根据尺寸而定：SS0200*-SS0500*	水悬浮液中的二氧化硅
光学胶	Norland Thorlabs	NOA 68	适用于玻璃或塑料的柔性胶粘剂
四氧化锇	Millipore Sigma	20816-12-0
Parafilm 封口膜	VWR	52858-000
等离子清洗机	Plasma Etch	PE-25	电压：120V，60Hz；电流：15 安培
氯化钾	VWR	0395-1kg
圆形盖玻片，#1.5，12mm	VWR	64-0712
超声波清洗仪	Branson	1510R-MT	Bransonic 超声清洗器，50-60 Hz，输出功率：70W
大豆磷脂酰肌醇（Soy PI）	Avanti Polar Lipids	840044
台式离心机	Eppendorf	22331
紫外灯	Spectroline	ENF-260C	115 伏，60 Hz，0.20 安培
Whatman 玻璃微纤维滤纸	VWR	28455-030	直径 42.5 mm，GF/C 级