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方法文章

脂质补充对寿命延长及基因转录分析的影响 秀丽隐杆线虫

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DOI：

10.3791/64092

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2022年12月9日

 ,  ,  , 
1Graduate Program in Developmental Biology, Baylor College of Medicine, 2Huffington Center on Aging, Baylor College of Medicine, 3Integrative Program of Molecular and Biochemical Sciences, Baylor College of Medicine, 4Department of Molecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine, 5Howard Hughes Medical Institute, Baylor College of Medicine

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本实验方案描述了在线虫 Caenorhabditis elegans 的液体培养和平板培养中添加脂质的方法，并结合对大量或少量线虫及其组织的纵向研究和基因转录分析。

摘要

衰老是一个复杂的过程，其特征是由于环境和遗传因素共同作用而导致的渐进性生理变化。脂质在构成细胞膜的结构组分、能量储存以及作为信号分子方面具有关键作用。调控脂质代谢和信号传导对于激活不同的长寿通路至关重要。线虫Caenorhabditis elegans是解析脂质代谢和信号传导在长寿调控中作用的理想且强大的模式生物。已有大量研究报道，通过饮食补充特定的脂质分子可延长C. elegans的寿命；然而，补充条件的微小差异可能导致不同实验室之间实验结果的重复性问题。本文报道了两种针对C. elegans的详细脂质补充方法，分别采用在培养板上接种含脂质的细菌或在液体培养中使用细菌悬液进行补充。同时，本文还提供了在整个生命周期中进行脂质补充的寿命测定实验以及利用少量线虫的全虫裂解物或显微解剖组织进行qRT-PCR分析的具体操作步骤。结合长期观察与脂质补充后的转录水平研究，这些饲喂实验为解析脂质如何影响寿命和健康衰老提供了可靠的技术手段。该方法还可适用于多种营养筛选策略，用于评估少量显微解剖组织或少数个体中特定转录本的变化情况。

引言

脂质
脂质是可溶于有机溶剂但不溶于水的小型疏水性或两亲性分子1,2。不同的脂质分子根据其碳链中的碳原子数目、双键的位置与数量以及所连接的结构（包括甘油或磷酸基团）而相互区分。脂质在不同细胞内及细胞间发挥关键作用，调控机体功能，例如构成膜双层结构、提供能量储存以及作为信号分子发挥作用3,4。

首先，脂质是生物膜的结构成分，包括质膜以及将细胞内区室与细胞外环境分隔开的细胞内亚细胞膜。其次，脂质是脊椎动物和无脊椎动物体内主要的能量储存形式。中性脂质（包括三酰甘油）可在多种组织中长期储存，例如脂肪组织。在线虫中 秀丽隐杆线虫 肠道是主要的代谢性脂肪储存器官，其功能不仅涉及营养物质的消化与吸收，还参与解毒过程，这一功能类似于哺乳动物肝细胞的活动。其他脂肪储存组织包括生殖系，其中脂质对卵母细胞的发育至关重要，以及由类似皮肤的表皮细胞构成的下皮组织3,5第三，近年来越来越多的证据表明，脂质是重要的信号分子，可通过直接作用于多种受体（包括G蛋白偶联受体和核受体）或间接方式参与细胞内和细胞外信号传导 通过 膜流动性调节或翻译后修饰6,7,8,9未来的研究将继续阐明脂质信号通路在促进长寿和健康寿命中的潜在分子机制。

模式生物对于研究在人类中过于复杂而难以探讨的特定生物学问题具有重要意义。例如，线虫 秀丽隐杆线虫 是进行遗传学分析以解析与人类营养和疾病相关生物学过程的优良模型10高度保守的分子通路与人类生理学密切相关，加之其复杂的组织结构、行为模式以及丰富的遗传操作工具，使得 秀丽隐杆线虫 一种卓越的模式生物11例如， 秀丽隐杆线虫 在开展正向遗传筛选以鉴定表型特异性基因，以及全基因组范围的反向遗传筛选方面具有显著优势 通过 RNA干扰12.

在实验室中，线虫培养于铺有细菌菌苔的琼脂培养皿中 大肠杆菌 细菌，提供作为能量来源和结构单元的宏量营养素，如蛋白质、碳水化合物以及饱和与不饱和脂肪酸，以及作为辅因子和维生素的微量营养素13与哺乳动物类似，线虫可利用棕榈酸和硬脂酸（分别为饱和的16碳和18碳分子）合成脂肪酸，这些脂肪酸经过连续的去饱和和延长反应，生成多种单不饱和脂肪酸（MUFAs）和多不饱和脂肪酸（PUFAs）。14,15,16,17,18有趣的是， 秀丽隐杆线虫 能够 从头合成 合成脂肪酸生物合成、去饱和及延长过程中所需的所有脂肪酸和核心酶，促进长链多不饱和脂肪酸的合成19与其他动物物种不同， 秀丽隐杆线虫 可利用自身的ω-3去饱和酶将18碳和20碳的ω-6脂肪酸转化为ω-3脂肪酸。此外，线虫还具有Δ12去饱和酶，可催化油酸（OA, 18:1）生成亚油酸（LA）20,21大多数动物或植物缺乏Δ12和ω-3去饱和酶，因此依赖膳食摄入ω-6和ω-3以获取其多不饱和脂肪酸（PUFAs），而 秀丽隐杆线虫 不需要膳食脂肪酸22缺乏功能性去饱和酶的突变体已被用于研究特定脂肪酸在不同生物过程中的功能，包括繁殖、生长、寿命和神经传递。通过遗传学方法和饮食补充，可探究单个脂肪酸对特定生物通路的影响。16,17,23迄今为止，脂质研究主要集中在表征与神经系统及发育状况中脂质合成、降解、储存和分解相关的基因24然而，脂质在寿命调控中的作用才刚刚开始被揭示。

脂质信号在寿命调控中的作用
脂质通过在不同组织和细胞类型中激活细胞信号级联反应，在寿命调控中发挥关键作用。近期研究强调了脂质在调节转录过程和细胞间通讯中的重要作用。 通过 脂质结合蛋白或膜受体识别25此外，膳食脂质补充是研究脂质代谢如何影响寿命的一个极佳工具 秀丽隐杆线虫不同的单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸已被证明可通过激活转录因子来促进长寿26,27.

包括胰岛素/IGF-1信号通路和生殖前体细胞消融在内的长寿模型均与单不饱和脂肪酸（MUFA）生物合成途径相关，而补充单不饱和脂肪酸（包括油酸、棕榈油酸和顺式-11-十八碳烯酸）足以延长C. elegans的寿命26。尽管MUFA给药带来的长寿效应仍需进一步研究，但其潜在机制可能由SKN-1/Nrf2转录因子介导，该因子是氧化应激反应和寿命调控的关键激活因子28,29。在单不饱和脂肪酸中，一类称为N-酰基乙醇胺（NAEs）的脂肪酰乙醇胺在炎症、过敏、学习、记忆和能量代谢等多种机制中发挥重要作用30。特别是，一种名为油酰乙醇胺（OEA）的脂质分子已被鉴定为长寿的正向调节因子，它可促进脂质结合蛋白8（LBP-8）向细胞核内转位，从而激活核激素受体NHR-49和NHR-807。补充OEA类似物KDS-5104足以延长寿命，并可诱导参与氧化应激反应和线粒体β-氧化相关基因的表达7,8。

同时，多不饱和脂肪酸（PUFAs）的作用也与寿命调控相关。给予ω-3多不饱和脂肪酸α-亚麻酸（ALA）可通过激活NHR-49/PPARα和SKN-1/NRF转录因子并诱导线粒体β-氧化而促进长寿31有趣的是，α-亚麻酸（ALA）的过氧化产物（称为氧化脂质）能够激活SKN-1/NRF，这表明多不饱和脂肪酸（PUFAs）及其氧化衍生物均可带来延长寿命的益处23补充ω-6脂肪酸花生四烯酸（AA）和二高-γ-亚麻酸（DGLA）可延长寿命 通过 自噬激活，促进蛋白质质量控制，导致废弃和有毒蛋白质聚集体的降解27,32最近，研究发现脂质结合蛋白3（LBP-3）与二高-γ-亚麻酸（DGLA）介导的非细胞自主性信号调控可通过向神经元传递外周信号来促进长寿，提示脂质分子在系统水平上参与组织间远距离通讯的重要作用33本研究报道了在平板上接种细菌或液体培养中细菌悬液进行脂质补充的每一步骤。这些方法可用于评估寿命及转录分析，所用样本为少量线虫的全虫内容物或解剖所得组织。以下技术可适用于多种营养学研究，并为解析脂质代谢如何影响寿命及健康衰老提供有效的工具。

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方案

图1展示了在不同实验条件下进行脂质喂养的示意图。

1. 脂质处理细菌的制备

  1. 通过将 5.85 g NaCl、1.0 g K2HPO4 和 6.0 g KH2PO4（见材料表）溶解于 999 mL 去离子水中，配制细菌稀释饮食限制（BDR）基础溶液。用 0.5 M KOH 将 pH 调至 6.0，然后经 0.22 µm 滤膜过滤。
    注意：BDR 溶液可在室温下长期保存。
  2. 向每 10 mL BDR 基础溶液中加入 10 µL 浓度为 5 mg/mL 的胆固醇溶液（溶于无水乙醇），配制 BDR 培养基。
  3. 从 -80 °C 保存的菌种中挑取 OP50 细菌（见材料表）划线接种至 LB 琼脂平板，于 37 °C 培养过夜。
    注意：在 37 °C 培养过夜后，OP50 平板可在 4 °C 保存最多 1 周，以保证稳定的喂养效果。
  4. 从 OP50 LB 琼脂平板中挑取菌落接种至 LB 液体培养基中，于 37 °C 摇床培养过夜（16 小时）。
    注意：所需 LB 培养基体积取决于实验设置。建议在每个 6 cm 培养皿上接种 200 µL 5 倍浓缩的细菌，在每个 10 cm 培养皿及每份液体喂养条件下接种 1 mL 5 倍浓缩的细菌。因此，每份脂质喂养培养应分别准备 1 mL 和 5 mL 的初始 LB 接种液。
  5. 在室温下以 4,000 × g 离心 10 分钟收集细菌，弃去上清液。
  6. 将细菌沉淀重悬于 20 mL BDR 基础溶液中，再以 4,000 × g 离心 10 分钟，弃去上清液。
    注意：此步骤至关重要，用于去除细菌沉淀中残留的 LB 成分。
  7. 将每份细菌沉淀用 BDR 培养基重悬，制备成 20 倍浓缩的 BDR 细菌储备液。使用前用 BDR 培养基将 20 倍浓缩液稀释至 5 倍浓度。
    注意：使用相当于原始 LB 体积 1/20 体积的 BDR 培养基，可获得 20 倍浓度的细菌。20 倍细菌储备液可在 4 °C 保存最多 1 周。
  8. 在新的灭菌玻璃小瓶中，使用乙醇或二甲基亚砜（DMSO）作为溶剂配制脂质储备液，并向小瓶中充入氩气或氮气以防止氧化。
    注意：储备液浓度通常在 250 mM 至 1 mM 之间。
  9. 将脂质储备液加入适量的 BDR 细菌溶液中，以达到喂养条件所需的终浓度。涡旋混匀 20 秒，确保充分混合。
    注意：喂养条件下脂质的终浓度通常为 1 µM 至 1 mM，具体取决于脂质种类和测试条件。若使用新型脂质，建议先进行预实验，测试 0.1 µM 至 1 mM 范围内的不同浓度。在将细菌接种至培养皿或加入线虫液体培养体系前，应立即混合脂质储备液与 BDR 细菌。脂质处理的细菌应在喂养前不超过 1 小时内配制完成。
  10. 根据脂质喂养组所用溶剂，取等体积的过滤乙醇或 DMSO 与 BDR 细菌混合，作为溶剂对照。

2. 脂质补充用同步化 C. elegans 的制备

  1. 通过混合以下成分制备M9缓冲液（使用指定的终浓度）：22 mM KH2PO4、22 mM Na2HPO4、85 mM NaCl 和 2 mM MgSO4（见材料表）。将缓冲液高压灭菌以达到无菌。
  2. 用60%家用漂白剂（v/v，见材料表）和终浓度为1.6 M的NaOH配制新鲜漂白液。
  3. 使用10 mL M9缓冲液将成年雌雄同体线虫收集至15 mL锥形管中。
    注：用于同步化的线虫数量和培养板数量取决于实验条件（即条件数、重复数和喂养方法）。理想情况下，每块完整的6 cm培养板上的成年线虫在同步化后应至少产生600条L1期线虫。
  4. 在1,450 × g 条件下离心30秒使线虫沉淀。弃去上清液，并用10 mL M9缓冲液再冲洗一次。
  5. 在1,450 × g 条件下离心30秒。吸除上清液，保留4 mL液体于锥形管中。加入2 mL漂白液，剧烈振荡1分钟。
  6. 在室温下以1,450 × g 离心30秒。
  7. 弃去上清液，加入4 mL M9缓冲液和2 mL漂白液。振荡试管直至线虫体完全溶解。
  8. 在室温下以1,450 × g 离心30秒使虫卵沉淀。
  9. 弃去上清液，并用10 mL M9缓冲液洗涤虫卵。
  10. 重复步骤2.8 和2.9 三次。
  11. 用6 mL M9缓冲液重悬胚胎，在20 °C下于旋转仪上轻轻摇动2天，使其孵化并实现同步化。
  12. 将L1幼虫转移至接种了OP50的培养板上。在20 °C下培养48小时以收集同步化的L4期线虫，培养72小时以收集第1天成虫，培养96小时以收集第2天成虫。
    注：OP50培养板的制备方法为向每块10 cm线虫生长培养基（NGM）平板中加入1 mL 20倍浓缩的OP50细菌悬液34。在当前实验条件下，若目标是收获L4期线虫，则每块OP50平板可接种30,000条L1线虫；若目标是收获第1天成虫，则每块平板可接种20,000条L1线虫。不同实验室条件可能有所不同，建议预先测试适宜的接种密度，以确保线虫在收获前仍有充足的食物供应。
  13. 使用10 mL M9缓冲液将L4期、第1天或第2天成虫线虫收集至15 mL锥形管中。再用5 mL M9缓冲液冲洗培养板上残留的线虫。
  14. 在1,450 × g 条件下离心30秒使线虫沉淀，弃去上清液。用10 mL BDR培养基洗涤线虫沉淀，于1,450 × g 离心30秒后弃去上清液。
  15. 对于采用液体喂养方法的线虫，加入BDR培养基使线虫浓度达到3,000条/mL。对于采用平板喂养方法的线虫，应减少加入的BDR培养基体积，以缩短平板上的干燥时间。

3. 脂质补充用于  秀丽隐杆线虫

  1. 按照以下步骤在液体培养基中进行脂质补充。
    注意：该方法适用于使用补充了脂质的大量线虫检测转录水平变化。
    1. 将所需量的脂质或载体对照分别加入12孔板的每个孔中。每种喂养条件准备三到四个孔，作为生物学重复。
    2. 将步骤2.15中的线虫悬液与5倍浓度的BDR细菌按1:1比例混合，使线虫终浓度为1,500条/mL，细菌终浓度为2.5倍。
    3. 将2 mL BDR培养基中的线虫-细菌混合物转移至12孔板的每个孔中。
    4. 用铝箔包裹12孔板，在20 °C摇床培养箱中以100 rpm转速振荡培养至所需时间。
      注意：为测试不同的饲喂条件，可将脂质与线虫共孵育不同时间，例如6 h、12 h和24 h。此外，可测试不同发育阶段的线虫以获得最佳结果，包括从L4期或成虫第1天开始进行脂质饲喂。
  2. 按照以下步骤在10 cm NGM琼脂平板上进行脂质补充。
    注意：该方法适用于使用补充了脂质的大量线虫检测转录水平变化。
    1. 将1.9步骤中脂质处理的细菌取1 mL接种于每个10 cm培养皿的中心。当制备较多数量的培养皿时，每接种几个培养皿后需对工作液进行多次涡旋振荡。使用生物安全柜在避光条件下干燥培养皿。
    2. 从步骤 2.15 转移 3,000 条线虫 向每个10 cm培养皿中加入适量脂质。在生物安全柜中干燥培养皿，直至线虫能够在添加脂质的培养皿表面爬行而非游动。
    3. 将线虫置于脂质处理过的培养板上，在20 °C培养箱中孵育所需时间。若使用多不饱和脂质，需避光保护。
      注意：为测试不同的饲喂条件，可将脂质与线虫共孵育不同时间，例如6 h、12 h和24 h。此外，可测试不同发育阶段的线虫以获得最佳效果，包括在L4期或成虫第1天进行脂质饲喂。
  3. 在6 cm NGM琼脂平板上进行脂质补充，用于转录分析。
    注意：该方法适用于检测少量补充了脂质的线虫中的转录变化。
    1. 将1.9步骤中脂质处理的细菌取300 µL接种至每个6 cm培养皿的中心。当制备较多数量的培养皿时，每接种几块需多次涡旋振荡工作液以保持均匀。在生物安全柜中避光干燥培养皿。
    2. 从步骤2.15中将最多300条线虫转移至每个6 cm培养皿中。在生物安全柜中干燥培养皿，直至线虫能够在添加脂质的培养皿上爬行而非游泳。
    3. 将线虫置于脂质处理过的培养板上，在20 °C培养箱中孵育所需时间。若使用多不饱和脂质，需避光保护。
      注意：为测试不同的饲喂条件，可在不同时间点（如6 h、12 h和24 h）将脂质与线虫共同孵育。此外，可测试不同发育阶段的线虫以获得最佳效果，包括在L4期或成虫第1天进行脂质饲喂。
  4. 在6 cm NGM琼脂平板上进行脂质补充，用于长期寿命测定。
    1. 在每个6 cm NGM平板的中心接种200 µL脂质条件化细菌（含1倍脂质浓度和5倍浓缩的细菌）。每种喂养条件准备三个平板。
      注意：平板必须在使用当天新鲜制备（最好在使用前立即制备）。
    2. 在生物安全柜中干燥培养板。若使用多不饱和脂质，请关闭生物安全柜及房间的照明。
    3. 挑选30-40条同步化的L4期线虫至每个培养皿中。将培养皿置于20 °C恒温培养箱中培养。若使用多不饱和脂质喂养，则将培养皿置于20 °C恒温培养箱内的避光盒中。
      注意：可以使用普通6 cm传代培养板中的OP50（未经条件处理的OP50）作为黏附剂来挑取线虫，但关键在于不得在检测板中残留大量未经条件处理的OP50。
    4. 将线虫转移至新制备的脂质条件化平板上，每天或隔天一次，具体频率取决于所需的喂养条件。生存率的评分方法同前所述。4.

4. 转录分析用RNA提取

  1. 从大量完整线虫中提取 RNA。
    1. 将步骤 3.1 中液体培养物中的线虫转移至 1.5 mL 微量离心管中。用 M9 缓冲液冲洗步骤 3.2 中的 10 cm 培养皿，将线虫连同 M9 缓冲液一并转移至 1.5 mL 微量离心管中。
    2. 使用台式小型离心机（见材料表）短暂离心线虫 10 秒，迅速吸除上清液。
    3. 将液体喂养孔中残留的线虫或平板喂养冲洗下来的线虫转移至同一离心管中，离心沉淀，弃去上清液。
    4. 用 1 mL 冰冷的 M9 缓冲液洗涤线虫沉淀，使用小型离心机短暂离心 10 秒，吸除上清液。根据上清液的透明程度重复洗涤 1 至 2 次。
    5. 将微量离心管置于冰上 2 分钟，用 200 µL 移液器尽可能吸除上清液，保留体积不超过 15 µL 的紧密线虫沉淀。
    6. 向每支微量离心管中加入 15 µL 含苯酚和异硫氰酸胍的 RNA 提取液（材料表），使用电动研磨器研磨约 30 秒，直至肉眼不可见完整线虫。
      警告：RNA 提取液具有毒性和易燃性，任何涉及敞口容器的操作均须在化学通风橱中进行。
    7. 向微量离心管中再加入 285 µL RNA 提取液，同时冲洗电动研磨器尖端残留的线虫样品至管中，涡旋混匀。
      注意：此为可暂停步骤。样品可在 RNA 提取液中于 -80 °C 保存数月。从 -80 °C 取出后，让样品在室温下自然解冻。
    8. 向每个样品中加入 60 µL 氯仿，剧烈涡旋，室温静置 10 分钟。
      警告：氯仿具有毒性，必须在化学通风橱中操作。
    9. 在 4 °C 条件下以 21,000 x g 离心 20 分钟。使用 200 µL 移液器小心吸取上层水相 140 µL，分两次每次 70 µL 转移至新的无 RNase 污染的微量离心管中。
      注意：从本步骤起，所有与样品直接接触的移液器吸头和容器均需为无 RNase 的。建议使用 RNase 去污染溶液擦拭所有设备和工作区域。
    10. 向样品管中加入 140 μL 异丙醇，剧烈涡旋，室温静置 10 分钟。在 4 °C 条件下以 21,000 x g 离心 20 分钟，小心吸除全部上清液。
    11. 向含有 RNA 沉淀的样品管中加入 0.5 mL 冰冷的 80% 乙醇（v/v）。剧烈涡旋，直至 RNA 沉淀脱离管底并在乙醇溶液中悬浮。在 4 °C 条件下以 21,000 x g 离心 10 分钟，弃去上清液。
    12. 将样品管在小型离心机中短暂离心 15 秒，使管壁残留液体沉至管底，然后用移液器尽可能吸除乙醇溶液。
    13. 打开管盖，使 RNA 沉淀自然干燥。若乙醇洗涤充分，干燥时间应少于 10 分钟。
      注意：此为可暂停步骤。干燥后的 RNA 沉淀可在 -80 °C 保存长达 1 个月。
    14. 用 40 µL 无核酸酶水溶解干燥的 RNA 沉淀，并按照试剂盒说明书使用 DNA 去除试剂盒进行处理（见 材料表）。
      注意：建议先用无核酸酶水溶解 RNA。若在将溶液转移至 RNA 管前，将 40 µL 水与 10x DNase 缓冲液混合，则 RNA 沉淀无法完全溶解。溶解 RNA 沉淀时样品应保持在冰上。反复冻融会降低 RNA 质量，因此建议在 DNase 处理当天即进行逆转录反应。
  2. 从少量完整线虫中提取 RNA。
    1. 从细菌菌苔中挑取 15–20 条线虫至新鲜无菌的 NGM 平板上，以去除线虫体表附着的细菌。
    2. 根据 qRT-PCR 两步法试剂盒说明书（见 材料表），在 PCR 管中将 0.2 µL DNase 与 19.8 µL 裂解液混合，配制每份样品 20 µL 的终末裂解液。通过移液器反复吹打 5 次混匀裂解液。
    3. 将 15–20 条线虫（尽量减少细菌携带）转移至含有 20 µL 终末裂解液的 PCR 管中。室温孵育裂解反应 5 分钟。
    4. 使用探头式超声仪（见 材料表）以 30% 振幅对线虫进行超声处理，程序如下：超声 5 秒，暂停 5 秒，重复 4 次，总超声时间为 20 秒。超声过程中将样品置于冰水浴中冷却。
    5. 室温孵育 5 分钟。
      注意：若无逆转录阴性对照显示存在显著水平的 DNA 污染，建议在孵育前加入更多 DNase。
    6. 向裂解反应体系中加入 2 µL 终止液，轻轻敲击混匀。室温孵育 2 分钟，随后置于冰上。
      注意：样品可在冰上保存最多 2 小时，之后进行逆转录反应。
  3. 按照以下步骤从线虫组织中提取 RNA。
    1. 从细菌菌苔中挑取约 20 条线虫，转移至新鲜无菌的 NGM 平板上，以去除细菌。
    2. 将 20 条线虫（尽可能减少细菌携带）转移至含有 500 μL M9 溶液（含 4 µM 左旋咪唑，见 材料表）的表面皿中。线虫将在数秒内被固定。
    3. 线虫固定后，使用可连接 1 mL 注射器的 25 G 针头解剖生殖腺或肠道组织。
      1. 在解剖显微镜下，于咽部第二膨大处进行切割，使肠道和生殖腺自然外翻。根据形态和对比度差异可轻易区分两种组织。使用镊子或针头轻轻分离组织，避免损伤。
        注意：建议在 5–10 分钟内完成解剖。若切割未能获得良好组织外翻，建议立即更换下一条线虫，并在 10 分钟内尽可能完成多条解剖。该操作需在短时间内完成，以避免环境因素引起的转录变化。
    4. 根据 qRT-PCR 两步法试剂盒说明书，在 PCR 管中将 0.2 µL DNase I 与 19.8 µL 裂解液混合，为每份样品配制 20 µL 终末裂解液。通过移液器反复吹打 5 次混匀裂解液。
    5. 使用灭菌玻璃移液器将解剖所得组织转移至 PCR 管中。将 PCR 管置于冰上 2 分钟，使组织沉降至管底。吸除上清液，向管中加入 20 µL 终末裂解液，轻敲混匀。
    6. 室温孵育裂解反应 5 分钟。随后向裂解体系中加入 2 µL 终止液，轻敲混匀，室温孵育 2 分钟。
      ​注意：样品可在冰上保存最多 2 小时，之后进行逆转录反应。

5. 逆转录与定量逆转录 PCR

  1. 从大量线虫中进行逆转录和定量逆转录PCR。
    1. 测定RNA浓度，并准备5 µg总RNA用于逆转录。
    2. 通过混合每个样本等量的RNA，并将最终RNA浓度调整为0.556 g/L（5 µg/9 µL），制备混合RNA样本。将混合RNA样本用于qRT-PCR标准曲线和反转录阴性对照。
    3. 按照制造商说明书进行逆转录（参见 材料表）在进行各个RNA样品实验的同时，运行以下质量控制逆转录反应。
      1. 以混合的RNA样本为模板进行逆转录（用于qRT-PCR标准曲线）。
      2. 以混合的RNA样本为模板进行逆转录反应，但不加入逆转录酶（RT阴性对照；用于检测可能的基因组DNA污染的质量控制）。
      3. 以无核酸酶水为模板进行逆转录（RT阴性对照；用于检测试剂中可能存在的RNA污染的质量控制）。
        注意：此处为暂停点。样品可在热循环仪中放置过夜，或于 -20 °C 保存数月。
    4. 将从混合RNA样本中获得的cDNA用无核酸酶水分别稀释4倍、20倍、100倍和500倍，用于qRT-PCR标准曲线制备。
    5. 将每个RNA样本反转录得到的cDNA稀释20-100倍，用作qRT-PCR反应的模板。
      注意：稀释比例取决于目标基因的丰度。对于高表达基因（如看家基因或 egl-3 和 egl-21 本研究中使用, 建议进行100倍稀释。对于表达水平较低的基因，例如 lbp-8建议进行20倍稀释。
    6. 按照制造商说明书使用qRT-PCR试剂进行qRT-PCR反应，程序如下：95 °C预变性10 min，然后重复40个循环（95 °C变性15 s，60 °C退火延伸1 min），接着运行仪器默认的熔解曲线程序，最后在8 °C无限期保存。
  2. 从少量线虫或线虫组织中进行逆转录及定量逆转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）。
    1. 转移25 µL RT缓冲液和2.5 µL 20x RT酶混合液（来自qPCR两步法试剂盒，参见 材料表) 加入到含有来自步骤 4.2.6 或步骤 4.3.6 的线虫裂解液的各管中。
      注意：对于少量线虫进行qRT-PCR时，设置无逆转录酶对照（RT阴性对照）至关重要。每次实验均需包含一份来自步骤4.2.6的线虫裂解液样本，加入逆转录（RT）缓冲液但不加RT酶，以检测样本中是否存在DNA污染。若存在DNA污染问题，可考虑在裂解缓冲液中增加DNase用量，或在线虫裂解后向样本中额外添加更多DNase。 Alternatively，也可对每个样本分别进行RT阴性对照：取一半裂解液进行正常的逆转录反应，另一半在相同反应体系中不加入逆转录酶。
    2. 轻轻敲击混匀。使用小型离心机离心10秒。
    3. 按照制造商的说明将样品加入热循环仪：37 °C 反应 60 分钟，95 °C 反应 5 分钟，8 °C 保存至后续处理。
      注意：此处为暂停点。样品可在PCR仪中过夜，或于-20 °C保存数月。
    4. 将所有试剂和样品置于冰上，并避免qRT-PCR试剂接触光。
    5. 准备一个96孔qPCR板，在每个孔中加入6 µL无核酸酶水、10 µL qRT-PCR试剂、2 µL 5 µM引物混合液（正向和反向引物）以及2 µL cDNA。用保护性光学膜覆盖96孔qPCR板表面，并压紧密封。
    6. 在热循环仪上按照制造商说明运行qRT-PCR程序，步骤如下：50 °C 2分钟，95 °C 2分钟，重复40个循环（95 °C 3秒，60 °C 30秒），随后在8 °C无限期保持。

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结果

通过补充脂质后使用少量完整线虫验证转录水平变化
为了探究从少量完整线虫中提取 RNA 并将其逆转录为 cDNA 的实验方案是否具有可重复性，并且能否与大量线虫样本的数据进行比较，采用了一种过表达溶酶体酸性脂肪酶的长寿线虫品系 lipl-4 在肠道中被采用7,8,33,35神经肽加工基因的转录诱导 egl-3 和 egl-21 既往研究中已有报道7,8,33 已验证（图2A，B这一诱导结果表明，从少量动物中提取RN...

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讨论

脂质补充已被用于衰老研究，以阐明特定脂质种类对健康衰老的直接影响6,7,23,26,27,31。然而，脂质补充实验操作具有挑战性，任何实验间的不一致都可能导致结果不可重复。本文首次记录了详细的分步操作流程，以指导新研究人员避免因技术不精确而产生的潜在问题。本方案中的关键步骤将在下文详细讨论。此外，通过在脂质补充后仅从少量线虫或特定线虫组织中提取RNA，进一步拓展了脂质研究工具箱。在考虑检测转录水平的方法时，针对少量线虫或显微解剖组织进行的qRT-PCR在分析少数转录本或特定组织的转录变化方面表现突出。此外，使用这些方法可省去线虫扩增步骤，从而节省约5至6天的时间。同时，当需要分析大量目标基因时，脂质喂养后进行总RNA提取则是一种更具成本效益且可靠...

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致谢

感谢 P. Svay 提供的维护支持。本研究由以下基金资助：NIH 基金 R01AG045183（MCW）、R01AT009050（MCW）、R01AG062257（MCW）、DP1DK113644（MCW）、March of Dimes 基金会（MCW）、Welch 基金会（MCW）、HHMI 研究员项目（M.C.W.）以及 NIH T32 ES027801 博士前学生奖学金（M.S.）。部分菌株由线虫遗传中心（CGC）提供，CGC 由 NIH 研究基础设施项目办公室（P40 OD010440）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.5 mL 研磨杵Genesee Scientific93-165P15用于使用 Trizol 研磨线虫
琼脂糖SigmaA9639-500G
AmfiRivert cDNA 合成铂金预混液GenDEPOTR5600用于从大量线虫样本进行逆转录
Applied Biosystems QuanStudio 3 实时荧光定量 PCR 仪ThermoFisherA28567用于 qRT-PCR
Benchmark Scientific StripSpin 12 微型离心机Benchmark ScientificC1248用于离心 PCR 管
Branson 450 数字超声破碎仪，配备 1/8" 探头Branson Ultrasonic Corporation100-132-888R
氯仿Fisher ScientificC298-500
胆固醇SigmaC8503-25G
二甲基亚砜 (DMSO)SigmaD8418-100ML
Eppendorf 5424 R 离心机Eppendorf22620444R用于 RNA 提取
Eppendorf vapo protect mastercycler proEppendorf950030010用于逆转录
无水乙醇 (200 Proof)Fisher ScientificBP2818-500
Greiner Bio-One CELLSTAR 12 孔板Neta Scientific665180用于液体饲喂的 12 孔板
Greiner Bio-One 培养皿，聚苯乙烯，100 × 20 mmNeta Scientific664161用于细菌 LB 平板和线虫 10 cm NGM 平板
Greiner Bio-One 培养皿，聚苯乙烯，60 × 15 mmNeta Scientific628161用于线虫 6 cm NGM 平板
Invitrogen 无核酸酶水ThermoFisherAM9937
异丙醇SigmaPX1835-2
盐酸左旋咪唑VWRSPCML1054
lipl-4TgMCW 实验室N/A转基因 C. elegans
lipl-4Tg;fat-3(wa22)MCW 实验室N/A转基因 C. elegans
LB 培养基干粉ThermoFisher12795-084
硫酸镁 (MgSO4)SigmaM2643-500G
MicroAmp EnduraPlate 光学 96 孔快速透明反应板（带条形码）ThermoFisher448335496 孔 qPCR 板
MicroAmp 光学密封膜Applied BioSystem4311971用于密封 96 孔 qPCR 板
Milli-Q Advantage A10 超纯水系统SigmaZ00Q0V0WW用于配制所有试剂（包括缓冲液和培养基）的去离子水，除非实验方案中特别注明使用无核酸酶水
N2秀丽隐杆线虫遗传中心N/AC. elegans 野生型分离株
NanoDrop ND-1000 分光光度计ThermoFisherN/A用于测定 RNA 浓度
OP50秀丽隐杆线虫遗传中心N/A用作 C. elegans 食物的细菌
磷酸氢二钾三水合物 (K2HPO4·3H2O)SigmaP5504-1KG
磷酸二氢钾 (KH2PO4)SigmaP0662-2.5KG
Power SYBR Green cells-to-Ct 试剂盒ThermoFisher4402953用于从少量线虫或线虫组织进行逆转录和 qPCR
Power SYBR Green 预混液ThermoFisher4367659用于从大量线虫样本进行 qPCR
Pure Bright 杀菌型超浓漂白剂 KIK International LLC.596472101436% 家用漂白剂，用于线虫卵的制备
Pyrex 九孔凹面培养皿SigmaCLS722085-18EA用作解剖线虫的观察皿
RNaseZap RNase 去污染溶液ThermoFisherAM9780
氯化钠 (NaCl)SigmaS7653-1KG
氢氧化钠 (NaOH)SigmaSX0590-3
磷酸氢二钠七水合物 (Na2HPO4·7H2O)SigmaS9390-1KG
Thermo Sorvall Legend Mach 1.6R 离心机Thermo7500-4337用于收集细菌
Thermo Sorvall ST 8 离心机Thermo7500-7200用于线虫卵的制备
TRIzol 试剂TheroFisher15596018RNA 提取试剂
Turbo DNA-free 试剂盒ThermoFisherAM1907用于去除 RNA 提取中的 DNA 污染
Vortexer 59 涡旋振荡器Denville Scientific INVS7030
VWR 一次性研磨棒及无线电机VWR47747-370用于使用 Trizol 研磨线虫
VWR 动能 26 焦耳迷你离心机 C1413 V-115VWRN/A用于收集线虫。已停产型号，VWR 提供类似型号，货号 76269-064
线虫挑取针WormStuff59-AWP

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RNA PCR
脂质补充对寿命延长及基因转录分析的影响 秀丽隐杆线虫
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