本实验方案描述了在线虫 Caenorhabditis elegans 的液体培养和平板培养中添加脂质的方法，并结合对大量或少量线虫及其组织的纵向研究和基因转录分析。
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方法文章
脂质补充对寿命延长及基因转录分析的影响 秀丽隐杆线虫
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
衰老是一个复杂的过程，其特征是由于环境和遗传因素共同作用而导致的渐进性生理变化。脂质在构成细胞膜的结构组分、能量储存以及作为信号分子方面具有关键作用。调控脂质代谢和信号传导对于激活不同的长寿通路至关重要。线虫Caenorhabditis elegans是解析脂质代谢和信号传导在长寿调控中作用的理想且强大的模式生物。已有大量研究报道，通过饮食补充特定的脂质分子可延长C. elegans的寿命；然而，补充条件的微小差异可能导致不同实验室之间实验结果的重复性问题。本文报道了两种针对C. elegans的详细脂质补充方法，分别采用在培养板上接种含脂质的细菌或在液体培养中使用细菌悬液进行补充。同时，本文还提供了在整个生命周期中进行脂质补充的寿命测定实验以及利用少量线虫的全虫裂解物或显微解剖组织进行qRT-PCR分析的具体操作步骤。结合长期观察与脂质补充后的转录水平研究，这些饲喂实验为解析脂质如何影响寿命和健康衰老提供了可靠的技术手段。该方法还可适用于多种营养筛选策略，用于评估少量显微解剖组织或少数个体中特定转录本的变化情况。
引言
脂质
脂质是可溶于有机溶剂但不溶于水的小型疏水性或两亲性分子1,2。不同的脂质分子根据其碳链中的碳原子数目、双键的位置与数量以及所连接的结构（包括甘油或磷酸基团）而相互区分。脂质在不同细胞内及细胞间发挥关键作用，调控机体功能，例如构成膜双层结构、提供能量储存以及作为信号分子发挥作用3,4。
首先，脂质是生物膜的结构成分，包括质膜以及将细胞内区室与细胞外环境分隔开的细胞内亚细胞膜。其次，脂质是脊椎动物和无脊椎动物体内主要的能量储存形式。中性脂质（包括三酰甘油）可在多种组织中长期储存，例如脂肪组织。在线虫中 秀丽隐杆线虫 肠道是主要的代谢性脂肪储存器官，其功能不仅涉及营养物质的消化与吸收，还参与解毒过程，这一功能类似于哺乳动物肝细胞的活动。其他脂肪储存组织包括生殖系，其中脂质对卵母细胞的发育至关重要，以及由类似皮肤的表皮细胞构成的下皮组织3,5第三，近年来越来越多的证据表明，脂质是重要的信号分子，可通过直接作用于多种受体（包括G蛋白偶联受体和核受体）或间接方式参与细胞内....
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方案
图1展示了在不同实验条件下进行脂质喂养的示意图。
1. 脂质处理细菌的制备
- 通过将 5.85 g NaCl、1.0 g K2HPO4 和 6.0 g KH2PO4（见材料表）溶解于 999 mL 去离子水中，配制细菌稀释饮食限制（BDR）基础溶液。用 0.5 M KOH 将 pH 调至 6.0，然后经 0.22 µm 滤膜过滤。
注意：BDR 溶液可在室温下长期保存。 - 向每 10 mL BDR 基础溶液中加入 10 µL 浓度为 5 mg/mL 的胆固醇溶液（溶于无水乙醇），配制 BDR 培养基。
- 从 -80 °C 保存的菌种中挑取 OP50 细菌（见材料表）划线接种至 LB 琼脂平板，于 37 °C 培养过夜。
注意：在 37 °C 培养过夜后，OP50 平板可在 4 °C 保存最多 1 周，以保证稳定的喂养效果。 - 从 OP50 LB 琼脂平板中挑取菌落接种至 LB 液体培养基中，于 37 °C 摇床培养过夜（16 小时）。
注意：所需 LB 培养基体积取决于实验设置。建议在每个 6 cm 培养皿上接种 ....
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结果
通过补充脂质后使用少量完整线虫验证转录水平变化
为了探究从少量完整线虫中提取 RNA 并将其逆转录为 cDNA 的实验方案是否具有可重复性，并且能否与大量线虫样本的数据进行比较，采用了一种过表达溶酶体酸性脂肪酶的长寿线虫品系 lipl-4 在肠道中被采用7,8,33,35神经肽加工基因的转录诱导 egl-3 和 egl-21 既往研究中已有报道7,8,33 已验证（图2A，B这一诱导结果表明，从少量动物中提取RN.......
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讨论
脂质补充已被用于衰老研究，以阐明特定脂质种类对健康衰老的直接影响6,7,23,26,27,31。然而，脂质补充实验操作具有挑战性，任何实验间的不一致都可能导致结果不可重复。本文首次记录了详细的分步操作流程，以指导新研究人员避免因技术不精确而产生的潜在问题。本方案中的关键步骤将在下文详细讨论。此外，通过在脂质补充后仅从少量线虫或特定线虫组织中提取RNA，进一步拓展了脂质研究工具箱。在考虑检测转录水平的方法时，针对少量线虫或显微解剖组织进行的qRT-PCR在分析少数转录本或特定组织的转录变化方面表现突出。此外，使用这些方法可省去线虫扩增步骤，从而节省约5至6天的时间。同时，当需要分析大量目标基因时，脂质喂养后进行总RNA提取则是一种更具成本效益且可靠.......
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致谢
感谢 P. Svay 提供的维护支持。本研究由以下基金资助：NIH 基金 R01AG045183（MCW）、R01AT009050（MCW）、R01AG062257（MCW）、DP1DK113644（MCW）、March of Dimes 基金会（MCW）、Welch 基金会（MCW）、HHMI 研究员项目（M.C.W.）以及 NIH T32 ES027801 博士前学生奖学金（M.S.）。部分菌株由线虫遗传中心（CGC）提供，CGC 由 NIH 研究基础设施项目办公室（P40 OD010440）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL 研磨杵 | Genesee Scientific | 93-165P15 | 用于使用 Trizol 研磨线虫 |
| 琼脂糖 | Sigma | A9639-500G | |
| AmfiRivert cDNA 合成铂金预混液 | GenDEPOT | R5600 | 用于从大量线虫样本进行逆转录 |
| Applied Biosystems QuanStudio 3 实时荧光定量 PCR 仪 | ThermoFisher | A28567 | 用于 qRT-PCR |
| Benchmark Scientific StripSpin 12 微型离心机 | Benchmark Scientific | C1248 | 用于离心 PCR 管 |
| Branson 450 数字超声破碎仪，配备 1/8" 探头 | Branson Ultrasonic Corporation | 100-132-888R | |
| 氯仿 | Fisher Scientific | C298-500 | |
| 胆固醇 | Sigma | C8503-25G | |
| 二甲基亚砜 (DMSO) | Sigma | D8418-100ML | |
| Eppendorf 5424 R 离心机 | Eppendorf | 22620444R | 用于 RNA 提取 |
| Eppendorf vapo protect mastercycler pro | Eppendorf | 950030010 | 用于逆转录 |
| 无水乙醇 (200 Proof) | Fisher Scientific | BP2818-500 | |
| Greiner Bio-One CELLSTAR 12 孔板 | Neta Scientific | 665180 | 用于液体饲喂的 12 孔板 |
| Greiner Bio-One 培养皿，聚苯乙烯，100 × 20 mm | Neta Scientific | 664161 | 用于细菌 LB 平板和线虫 10 cm NGM 平板 |
| Greiner Bio-One 培养皿，聚苯乙烯，60 × 15 mm | Neta Scientific | 628161 | 用于线虫 6 cm NGM 平板 |
| Invitrogen 无核酸酶水 | ThermoFisher | AM9937 | |
| 异丙醇 | Sigma | PX1835-2 | |
| 盐酸左旋咪唑 | VWR | SPCML1054 | |
| lipl-4Tg | MCW 实验室 | N/A | 转基因 C. elegans |
| lipl-4Tg;fat-3(wa22) | MCW 实验室 | N/A | 转基因 C. elegans |
| LB 培养基干粉 | ThermoFisher | 12795-084 | |
| 硫酸镁 (MgSO4) | Sigma | M2643-500G | |
| MicroAmp EnduraPlate 光学 96 孔快速透明反应板（带条形码） | ThermoFisher | 4483354 | 96 孔 qPCR 板 |
| MicroAmp 光学密封膜 | Applied BioSystem | 4311971 | 用于密封 96 孔 qPCR 板 |
| Milli-Q Advantage A10 超纯水系统 | Sigma | Z00Q0V0WW | 用于配制所有试剂（包括缓冲液和培养基）的去离子水，除非实验方案中特别注明使用无核酸酶水 |
| N2 | 秀丽隐杆线虫遗传中心 | N/A | C. elegans 野生型分离株 |
| NanoDrop ND-1000 分光光度计 | ThermoFisher | N/A | 用于测定 RNA 浓度 |
| OP50 | 秀丽隐杆线虫遗传中心 | N/A | 用作 C. elegans 食物的细菌 |
| 磷酸氢二钾三水合物 (K2HPO4·3H2O) | Sigma | P5504-1KG | |
| 磷酸二氢钾 (KH2PO4) | Sigma | P0662-2.5KG | |
| Power SYBR Green cells-to-Ct 试剂盒 | ThermoFisher | 4402953 | 用于从少量线虫或线虫组织进行逆转录和 qPCR |
| Power SYBR Green 预混液 | ThermoFisher | 4367659 | 用于从大量线虫样本进行 qPCR |
| Pure Bright 杀菌型超浓漂白剂 | KIK International LLC. | 59647210143 | 6% 家用漂白剂，用于线虫卵的制备 |
| Pyrex 九孔凹面培养皿 | Sigma | CLS722085-18EA | 用作解剖线虫的观察皿 |
| RNaseZap RNase 去污染溶液 | ThermoFisher | AM9780 | |
| 氯化钠 (NaCl) | Sigma | S7653-1KG | |
| 氢氧化钠 (NaOH) | Sigma | SX0590-3 | |
| 磷酸氢二钠七水合物 (Na2HPO4·7H2O) | Sigma | S9390-1KG | |
| Thermo Sorvall Legend Mach 1.6R 离心机 | Thermo | 7500-4337 | 用于收集细菌 |
| Thermo Sorvall ST 8 离心机 | Thermo | 7500-7200 | 用于线虫卵的制备 |
| TRIzol 试剂 | TheroFisher | 15596018 | RNA 提取试剂 |
| Turbo DNA-free 试剂盒 | ThermoFisher | AM1907 | 用于去除 RNA 提取中的 DNA 污染 |
| Vortexer 59 涡旋振荡器 | Denville Scientific INV | S7030 | |
| VWR 一次性研磨棒及无线电机 | VWR | 47747-370 | 用于使用 Trizol 研磨线虫 |
| VWR 动能 26 焦耳迷你离心机 C1413 V-115 | VWR | N/A | 用于收集线虫。已停产型号，VWR 提供类似型号，货号 76269-064 |
| 线虫挑取针 | WormStuff | 59-AWP |
参考文献
- Fahy, E., et al. Update of the LIPID MAPS comprehensive classification system for lipids 1. Journal of Lipid Research. 50, 9-14 (2009).
- Liebisch, G., et al. Update on LIPID MAPS classificatio....
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