我们报道了一种可在胶质母细胞瘤（GBM）细胞侵袭脊椎动物脑组织过程中实现微管动态活体成像的技术。通过将荧光标记的GBM细胞正位注射至透明的斑马鱼脑中，并结合高分辨率的活体成像，可实现对细胞骨架动态变化的观测 原位 癌症侵袭
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摘要
摘要
在真实人群中，胶质母细胞瘤（GBM）的中位生存时间极低，仅为6至15个月，是破坏性最强的恶性脑肿瘤。治疗失败主要归因于GBM细胞的侵袭性，这凸显了深入理解GBM运动特性的迫切需求。为了研究支持GBM侵袭的分子机制，亟需建立新的生理模型，以实现对侵袭过程中蛋白质动态的深入表征。这些观察结果将为发现阻断肿瘤浸润、改善患者预后的新型治疗靶点铺平道路。本文介绍了将GBM细胞原位移植至斑马鱼脑内，从而实现亚细胞水平的活体实时成像的方法。聚焦于微管（MTs），我们描述了一套实验流程：包括在GBM细胞中标记微管、将GBM细胞显微注射至受精后3天（dpf）斑马鱼幼鱼的透明脑组织中、对播散性异种移植瘤中的微管进行活体成像、调控微管动态以评估其在GBM侵袭过程中的作用，以及对获取的数据进行分析。
引言
细胞运动是一个程序化的过程，需要建立极性轴以及产生驱动力的细胞骨架重排。肌动蛋白的聚合及其与肌球蛋白的相互作用被认为是细胞运动所需突出力和收缩力的主要来源1。微管被认为在细胞极化和迁移过程中的方向持久性中起主要作用2。近年来的研究还表明，微管能够在三维环境中形成并稳定细胞突起，以支持细胞侵袭过程中的力学压缩力3。更近的研究发现，微管还直接参与了黏着斑处的力传导以及力学敏感性迁移4。微管正端动态所表现出的动态不稳定性，表现为反复发生的聚合（生长）和解聚（缩短）阶段，这一过程受到多种微管结合蛋白和细胞内信号通路（如由RHO-GTP酶调控的信号通路）的共同调控5,6,7。微管网络在细胞迁移与侵袭中的重要作用，使得对微管动态的研究成为深入理解免疫细胞归巢、伤口愈合以及癌症侵袭机制的关键环节。
癌细胞逃离原发性肿瘤核心、在组织中扩散并形成继发性肿瘤的能力，是阻碍50年前宣布的抗癌战争取得全球性成功的关键步骤8,9。其中最大的挑战之一在于理解癌细胞如何主动侵袭组织。关键的侵袭机制依赖于与非肿瘤细胞迁移相同的原理10。然而，癌细胞迁移具有其特异性11，这促使人们需要更深入地表征此类迁移行为。特别是由于肿瘤微环境在癌症进展中起着关键作用12，因此在相关的生理背景下观察和分析癌细胞的侵袭过程，对于揭示癌细胞扩散的机制至关重要。
微管在癌症进展中起核心作用，可同时维持细胞增殖和侵袭。对微管动态进行精确分析 原位 有助于识别两种过程中微管改变剂（MTA）。微管动力学会在环境变化时发生显著改变。 体外，当细胞在三维凝胶中嵌入时，使用诺考达唑等微管去稳定剂处理可抑制细胞突起的形成，而在二维细胞迁移中则影响甚微13,14尽管技术上具有挑战性，但活体成像技术的进步使得 体内 分析癌细胞侵袭过程中微管动力学的变化。例如，在小鼠皮下异种移植的纤维肉瘤细胞中观察微管发现，肿瘤相关巨噬细胞会影响肿瘤细胞中的微管动力学15然而，这些小鼠模型需要复杂的手术操作，对于较难接近的癌症（如高度侵袭性的脑肿瘤胶质母细胞瘤，GBM）而言，仍不尽如人意。
尽管平均生存期仅为15个月16，关于胶质母细胞瘤（GBM）在脑实质内的播散模式，以及维持GBM细胞在脑组织中侵袭的关键分子机制，目前仍知之甚少。小鼠原位异种移植（PDX）模型的改进以及颅窗技术的建立，为研究GBM细胞侵袭提供了新的前景17,18然而，由于成像质量欠佳，该模型目前主要仅能用于浅表异种移植瘤的纵向成像，尚无法成功应用于细胞骨架蛋白的亚细胞成像研究。此外，在后续的 "3Rs" 为减少啮齿类动物的使用并以低等脊椎动物替代，已建立了多种替代模型。
利用斑马鱼（Danio rerio）幼鱼中观察到的原始免疫特性，已建立将胶质母细胞瘤（GBM）细胞原位注射至鱼脑的方法19,20,21。在发育中的中脑脑室附近注射，可重现大多数人类GBM的病理生理特征21，并观察到与人类相同的GBM侵袭模式——血管共选项22。得益于鱼体幼体的透明特性，该模型可实现对GBM细胞从脑室周围区域（即大多数GBM被认为起源的部位）向脑组织侵袭过程的可视化观察23。
因为微管（MTs）对胶质母细胞瘤（GBM）细胞的侵袭至关重要 体外24,25，需要更深入地表征微管动力学，并鉴定细胞侵袭过程中的关键调控因子。然而，迄今为止，利用斑马鱼原位模型产生的数据尚未包含对侵袭过程中微管动力学的亚细胞水平分析。本文提供了一种研究微管动力学的实验方案 体内 并确定其在脑癌侵袭过程中的作用。在对微管进行稳定标记后，将胶质母细胞瘤（GBM）细胞在受精后3天（3 dpf）显微注射至斑马鱼幼鱼脑内，并在细胞于脑组织中迁移过程中以高时空分辨率进行实时成像。活体荧光微管成像可实现对微管正端动态的定性与定量分析。此外，该模型还可用于实时评估微管靶向药物（MTAs）对微管动态性及GBM细胞侵袭特性的影响。该方法具有较低侵入性，可同时处理大量幼鱼，且药物可通过鱼水直接施加，操作简便，因此在临床前药物测试中具有重要应用价值。
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方案
动物实验按照欧盟关于实验动物护理的指南进行。所有实验方案均经巴斯德研究所动物实验伦理委员会（CEEA 89）以及法国研究与教育部门批准（许可号 #01265.03）。在注射或活体成像过程中，动物使用Tricaine进行麻醉。实验程序结束后，通过麻醉过量实施安乐死。有关本实验方案所用材料、设备和软件的详细信息，请参见材料表。本方案的整体工作流程见图1。
1. 生成稳定表达 α-tubulin-mKate2 的胶质母细胞瘤细胞
注意：以下步骤均在生物安全二级以上（BSL2+）生物安全柜中进行。
- 使用磷酸钙法转染 7 × 10⁶ 个细胞，制备表达 mKate2-微管蛋白的慢病毒颗粒6 HEK-293T 细胞
- 在1.5 mL 微量离心管中，加入10 µg 的2nd psPAX2 包装质粒 5 µg、病毒包膜质粒 pMD2.G 5 µg，以及目的质粒 pGK-mKate2-人微管蛋白 α1a 10 µg，与 50 µL CaCl₂2 （2.5 M 母液）。用无菌无DNA酶的H₂O定容至500 µL。2O.
注意：必须加入 CaCl2 最后。 - 上下颠倒混匀数次，室温（RT）孵育20分钟。
- 孵育期间，另取一个1.5 mL微量离心管，加入500 µL HEPES缓冲盐溶液（HBS，pH 7.0）（2倍浓度）。
- 20分钟后，加入CaCl2将DNA混合液逐滴加入HBS（2x）溶液中，轻轻翻转离心管数次混匀，室温孵育12分钟。
- 12 分钟后，轻轻加入 CaCl2将DNA与HBS混合后，逐滴直接加入至10 cm培养皿中汇合度为70%的HEK-293T细胞。
- 将细胞置于37 °C、5% CO₂的加湿培养箱中孵育2 36–48 小时。
- 收集上清液，于3,000 × g 5分钟以去除细胞碎片。
- 为浓缩病毒颗粒，将上清液加入超速离心管中，在47,508 × g 4 °C下孵育90分钟。
- 弃去上清液，将离心管倒置在纸巾上，以干燥管内壁。
- 加入30 µL PBS至病毒沉淀中。不要重悬沉淀。4 °C放置2 h。
- 轻轻吹打重悬病毒颗粒，避免产生气泡。于 -80 °C 保存。
注意：通过转染多块 HEK-2-93T 细胞培养板可产生更大量的病毒颗粒。
- 在1.5 mL 微量离心管中，加入10 µg 的2nd psPAX2 包装质粒 5 µg、病毒包膜质粒 pMD2.G 5 µg，以及目的质粒 pGK-mKate2-人微管蛋白 α1a 10 µg，与 50 µL CaCl₂2 （2.5 M 母液）。用无菌无DNA酶的H₂O定容至500 µL。2O.
- 用慢病毒颗粒感染胶质母细胞瘤细胞。
注意：本实验方案适用于U-87 MG、U-373 MG或T98等商业化的胶质母细胞瘤细胞系。若使用患者来源的原代胶质母细胞瘤细胞，需采用特定包被的培养板及无血清培养基。26.- 准备一皿生长至70%汇合度的U-87 MG胶质母细胞瘤细胞，细胞培养于添加了10%胎牛血清、青霉素-链霉素（青霉素终浓度为100单位/毫升，链霉素为100微克/毫升）和非必需氨基酸（1倍浓度）的Eagle最小必需培养基（MEM）中。
- 以1:5,000的稀释比例将病毒颗粒直接加入细胞中，轻轻摇晃混匀。病毒感染细胞时间不超过20小时。
- 移除含有病毒的培养基，更换为新鲜的培养基。继续培养48–72小时以表达带标签的微管蛋白。
注意：以下步骤需在生物安全柜 BSL2 中进行。 - FACS 分选细胞，选择 mKate2 荧光最强的 15% 细胞+ 细胞。在通过前向散射和侧向散射（FCS vs SSC）设门去除碎片和双联体细胞后，对mKate2荧光信号最强的30%细胞进行进一步设门+ 细胞以保留前15%。
- 扩增MT标记的细胞。
注意：也可在落射荧光显微镜下根据高水平表达tubulin-mKate2进行克隆筛选。
2. 准备斑马鱼幼鱼用于显微注射
- 获取斑马鱼卵。
- 在异种移植前4天的傍晚，将3条雄鱼和4条所需品系的雌鱼放入配有玻璃珠的交配缸中。
注：Tg(fli1a:gfp)、Tg(gfap:gfp) 或 Tg(Huc:gfp) 品系分别用于标记内源性血管、神经干细胞/星形胶质细胞和神经元。 - 于次日早晨收集玻璃珠诱导排卵所产生的鱼卵。
- 将鱼卵转移至含有矿物源水27的50 mL离心管中，加入漂白剂（终浓度0.004%），轻轻倒置混匀5分钟。随后仅用矿物水清洗两次。
- 将鱼卵转移至含有添加了0.28 mg/mL亚甲蓝的矿物水的培养皿中。
- 剔除未受精及发育停滞的鱼卵，将胚胎在28 °C条件下孵育。
- 在异种移植前4天的傍晚，将3条雄鱼和4条所需品系的雌鱼放入配有玻璃珠的交配缸中。
- 制备透明幼鱼。
- 在孵育8小时后向培养基中加入N-苯基硫脲（PTU）（终浓度0.003%），以抑制黑色素沉积，确保光学透明性。此后整个实验过程中均需维持培养基中的PTU浓度。
注：由于PTU处理可能导致发育异常，应仅选择正常发育的幼鱼用于异种移植。作为化学处理的替代方案，可使用无色素突变斑马鱼品系casper（nacre与roy orbison双突变体），该品系天然缺乏色素28。 - 将孵育温度升至29 °C。
- 每日升高温度1 °C，使注射当天的3日龄幼鱼（3 dpf）达到32 °C。
- 在孵育8小时后向培养基中加入N-苯基硫脲（PTU）（终浓度0.003%），以抑制黑色素沉积，确保光学透明性。此后整个实验过程中均需维持培养基中的PTU浓度。
- 制备显微注射用琼脂糖板。
- 用矿物水配制20 mL含1%琼脂糖和0.28 mg/mL亚甲蓝的溶液。
- 将琼脂糖溶液倒入直径10 cm的培养皿中，迅速将显微注射用塑料模具倒扣压入，形成宽2.5 mm的V形凹槽（图2B）。
注：该塑料模具可商业购买，也可根据《斑马鱼手册》中描述的设计自行制作29。 - 待琼脂糖完全凝固后小心移除塑料模具。
注：制备好的显微注射用琼脂糖板可在4 °C保存最多2个月。
- 准备用于异种移植的幼鱼。
- 在注射当天，筛选3日龄幼鱼中具有目标荧光转基因表达的个体，剔除无荧光或形态异常的幼鱼。
- 使用尖头钟表镊手动去除幼鱼的卵膜。在3日龄时，用两对尖头镊子轻轻刺破或撕开卵膜，使幼鱼从中释放出来。
注：也可选择使用蛋白酶A进行酶解法去膜，通常在24 hpf阶段进行。 - 将去膜后的幼鱼维持在含有亚甲蓝（0.28 mg/mL）和PTU（终浓度0.003%）的矿物水培养基中。
3. 异种移植操作步骤
- 制备显微注射针。
- 取一支无中心丝的硼硅酸盐玻璃毛细管，放入垂直拉针仪中。
- 使用以下参数设置——拉力增加至8.5，加热器设为3——拉伸毛细管，使其形成显微注射针。
- 设置显微注射仪。
- 向手动显微注射仪中加入矿物油，并去除气泡。
- 将通用毛细管夹持器连接至显微注射仪，并牢固地固定在机械微操纵器上（图2A）。
- 收获胶质母细胞瘤细胞。
注意：以下步骤均在生物安全柜BSL2中进行。- 准备一个直径10 cm的胶质母细胞瘤细胞培养皿，使其在移植当天达到80%汇合度。
- （可选）通过向细胞中加入Hoechst 35480（200 ng/mL）对细胞核进行瞬时标记。在37 °C湿润细胞培养箱中孵育20分钟，随后用PBS洗涤两次。
- 将细胞培养皿从培养箱中取出，用PBS洗涤一次。加入1 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA，于细胞培养箱中37 °C孵育5–10分钟，直至所有细胞完全脱落。
注意：此步骤至关重要，因胰蛋白酶消化不充分会导致细胞团块残留，从而堵塞注射针。 - 将细胞重悬于50 mL离心管中的5 mL完全胶质母细胞瘤细胞培养基中。加入45 mL冰浴PBS，于134 × g离心5分钟。
- 弃去上清液，用移液器反复吹打，将细胞充分重悬于1 mL冰浴PBS中。
注意：此机械解离步骤可显著降低显微注射过程中毛细管堵塞的风险。 - 加入49 mL冰浴PBS，于134 × g离心5分钟。弃去上清液，将细胞重悬于200 µL冰浴PBS中。在移植操作期间保持冰上保存。
- 将胶质母细胞瘤细胞显微注射至斑马鱼幼鱼中脑。
- 在显微注射模具板中加入6 mL含160 mg/L三卡因的E3培养基30。
- 将约一打去壳幼鱼转移至显微注射板中。待其对触碰无反应后，使用00号画笔将其侧向排列于凹槽中，头部朝上，卵黄囊紧贴凹槽壁（图2B、C）。
- 重悬胶质母细胞瘤细胞。使用微量加样吸头将5 µL细胞悬液装入微毛细管中，并将毛细管插入通用毛细管夹持器。
- 将含有无反应幼鱼的显微注射板置于体视显微镜下。使用微操纵器旋钮将微毛细管尖端移至显微注射板边缘，用手术刀切断尖端，形成一个锐利的穿刺点，其直径约为一个细胞大小。
- 通过手动微量推动显微注射仪中的油，使液体缓慢流出，并将针尖浸入培养基中，以确认细胞可顺利流出。将细胞集中于毛细管尖端，以最大化每次注射体积内的细胞数量，并避免将PBS注入脑组织中（图2C）。
- 在手动向注射器中注入油液时，仔细观察从微毛细管流出的细胞。通过经验确定手动旋钮旋转多少角度可注射20至50个细胞。通常情况下，若细胞浓度足够，轻轻旋转一圈即可推出约10个细胞。
注意：若液体无法顺利从微毛细管流出，可尝试略微松动毛细管在夹持器中的固定。但需注意，这可能导致油液沿毛细管泄漏滴落。 - 将毛细管尖端靠近左侧视顶盖（OT），位置略高于中脑静脉（MCeV，图2F）。
- 轻柔地将毛细管压向幼鱼，直至皮肤膜破裂（图2D、E）。
注意：切勿用力过猛，否则会导致细胞注射过深，影响脑组织光学清晰度，从而妨碍对微管结构（MTs）的详细观察。成像技术适用于深度达250–300 µm的区域，但建议注射深度不超过鱼体表面以下100 µm。 - 当毛细管到达视顶盖合适位置后，推出细胞。仔细观察毛细管尖端，确认细胞流进入动物体内，以确保注射成功。
注意：注意避免将细胞注入脑室（图2E）。一旦进入脑室，细胞倾向于聚集并滞留，而非浸润周围组织（图2I）。脑室注射的特征是脑部明显肿胀，并可观察到注射细胞向端脑和后脑扩散（图2J）。 - 根据需要，重复步骤3.4.9–3.4.11，完成所有目标动物的注射。操作应迅速，以防止细胞在毛细管内聚集。
注意：根据实验人员注射速度的不同，每注射10至20条幼鱼可能需要更换一次注射针。 - 异种移植完成后，将幼鱼从显微注射板中取出，并转移至含有矿物源水 + PTU + 亚甲蓝培养基的24孔板中，每孔一条。
- 在荧光体视显微镜下观察幼鱼，验证注射是否成功（图2G）。仅选择那些在视顶盖顶部200 µm（z轴方向）内形成单个肿瘤团块（由20–50个细胞组成）的异种移植物（图2H），排除注射失败的个体（图2I–K）。
注意：成功定位的异种移植物比例随操作熟练程度从初期的10%提升至接近100%。 - 注射后在32 °C条件下让幼鱼恢复至少4小时再进行成像。
注意：在培养基中添加抗生素并不能提高幼鱼存活率。若显微注射操作正确，此阶段几乎100%的鱼类可存活。
4. 胶质母细胞瘤异种移植瘤的活体成像
- 进行活体成像时固定幼鱼。
注意：注射后 4 小时（hpi）即可开始对幼鱼进行成像。通常在 20 hpi 开始进行微管（MT）的活体成像，此时侵袭性胶质母细胞瘤（GBM）细胞已开始延伸突起并从肿瘤团块迁移出去。- 配制 1% 低熔点琼脂糖溶液。将 500 µL 煮沸的 1% 低熔点琼脂糖溶液转移至 1.5 mL 离心管中，在 37 °C 的加热块上冷却。向琼脂糖中加入三卡因（tricaine，112 µg/mL），充分混匀。
- 将 1 至 4 条移植了肿瘤的幼鱼转移至盛有矿物源水 + PTU + 亚甲基蓝培养基并补充 tricaine（112 µg/mL）的 3.5 cm 培养皿中。待幼鱼对触碰无反应后，使用细尖移液器小心将其转移至含有琼脂糖和 tricaine 的离心管中。
注意：应尽量减少培养基体积，以避免稀释琼脂糖。 - 轻柔混匀幼鱼与琼脂糖。使用普通（大球型）移液器将混有幼鱼的琼脂糖滴加至玻璃底 3.5 cm 视频成像培养皿中央。在体视显微镜下，使用微加样头轻轻调整幼鱼位置，使其仰卧。
注意：由于本实验方案使用倒置转盘共聚焦显微镜进行活体脑部成像，因此需将幼鱼背侧朝下固定。若使用正置共聚焦显微镜，则应相应调整幼鱼的放置方向。 - 去除多余琼脂糖，以保持最薄的琼脂糖层。待琼脂糖凝固后，加入 2.5 mL 矿物源水 + PTU + 0.2× tricaine（成像培养基），然后进入下一步。
- 体内活体成像观察侵袭性胶质母细胞瘤细胞中微管动态
注意：图像的光学质量极大依赖于所用显微镜的性能。本方案基于配备 sCMOS 相机（像素大小 6.5 µm，2048 × 2044 像素）、长工作距离物镜和温控环境舱的倒置转盘共聚焦显微镜编写。- 将含有嵌入琼脂糖的移植幼鱼的视频成像培养皿放入倒置共聚焦显微镜的环境舱中，温度设定为 32 °C。使用电动 XY 载物台和 10× 物镜在培养皿中找到幼鱼。
- 按下 ESC 键降低物镜转盘，向 60× 油镜（数值孔径 1.4，工作距离：0.13 mm）上滴加矿物油，再按 ESC 键返回初始焦平面位置。
- 在红色通道（561 nm 激光源，20% 激光功率，曝光时间：200 ms）下观察侵袭性胶质母细胞瘤细胞，选择一个具有展开的微管网络且微管纤维清晰可辨的细胞（图 3B）。
- 设置 z 序列参数。使用 200 µm 行程的压电 z 载物台，选定微管网络的顶部和底部位置：深度为 10–30 µm 的 z 层叠即可充分显示迁移细胞突起中的微管网络，z 切片步进为 0.3 µm。
- 设置延时成像采集参数，以在采集速度、z 层叠深度和荧光信号之间取得最佳平衡，避免快速光漂白。每隔 5–10 秒采集一次微管图像，持续数分钟。采集并保存 5D（x, y, z, t, c）超堆栈图像。
注意：为避免采集过程中 z 轴漂移，建议使用配备完美聚焦系统（Perfect Focus System）的显微镜作为硬件焦距稳定装置。
- （可选） 确定微管调节剂（MTA）对微管的影响。
注意：以下步骤可用于实时检测 MTAs 对迁移性胶质母细胞瘤细胞中微管网络的作用。- 轻柔地从视频成像培养皿中移除成像培养基。切勿触碰培养皿底部，以免丢失 xyz 位置信息。
- 配制含不同浓度 MTA 的新成像培养基。将含 MTA 的培养基逐滴轻柔加入视频成像培养皿中。
- 采集长期录像（2–16 小时，每 10–20 分钟采集一张图像），以观察各浓度 MTA 对微管网络及细胞迁移的影响（图 4A）。
- （可选）通过轻柔移除培养基并加入 2.5 mL 不含 MTA 的新鲜成像培养基来洗脱 MTA。重复洗脱步骤 3 次，以彻底清除培养基中残留的 MTA。
- （可选）重复步骤 4.3.3 的长期录像采集（图 4B）。
注意：上述步骤用于确定不影响幼鱼存活的前提下改变微管网络的最低药物浓度。洗脱步骤可判断药物效应是否可逆。
- 通过连续成像评估 MTA 对胶质母细胞瘤侵袭的影响。
- 在显微注射后 4 小时，执行步骤 4.1 至 4.2.1。
注意：本部分实验也可使用其他荧光标记的胶质母细胞瘤细胞系完成。理想情况下，应对 GBM 同时进行细胞质标记和细胞核标记，以确保能够检测细胞的整体形态。 - 切换至长工作距离 40× 水镜（数值孔径：1.15，工作距离：0.6 mm）。
- 设置 z 序列范围以采集视顶区（OT）区域。使用高灵敏度 sCMOS 相机（像素大小 11 µm，1,200 × 1,200 像素，量子效率 95%）采集 z 层叠图像。
注意：z 层叠通常从 OT 最背侧部分（靠近表面）开始，深入脑组织直至包含整个肿瘤细胞团块。 - 将视频成像培养皿从显微镜上取下。使用微加样头轻柔戳动幼鱼周围的琼脂糖，使幼鱼从琼脂糖中释放出来。
注意：由于 3 dpf 幼鱼仍非常脆弱，在将其从琼脂糖中取出时需格外小心。 - 幼鱼脱离琼脂糖后，轻柔地将其转移至盛有矿物源水 + 亚甲基蓝 + PTU 培养基的 24 孔板中的单个孔内。标记该孔，以便后续成像时识别对应幼鱼。
- 在培养基中加入先前确定浓度的目标 MTA（见步骤 4.3.3）。每天更换含药物的新鲜培养基。连续 3–4 天，每天重复执行步骤 4.4.1 至 4.4.5 的成像流程。
- 在显微注射后 4 小时，执行步骤 4.1 至 4.2.1。
5. 图像分析
- 使用免费的 FIJI 插件分析微管动力学。
注意：许多综述和实验方案描述了细胞中微管动力学分析的方法31,32,33,34 并且可以在这一阶段应用。本方案将简要介绍两种测量微管基本动态特性的方法。- 打开5D超堆栈，生成一个4D堆栈，其中将z轴切片投影到单一平面，以创建z轴方向的最大强度投影（MIP）图像 | 图像序列 | Z 轴投影 | 最大强度投影) (图3B).
- 打开4D MIP图像序列，使用FIJI中的手动追踪功能，手动追踪基于突起的微管末端插件 | 追踪 | 手动追踪). (图 3D）。提取微管动力学参数，如生长速度、缩短速度、恢复频率和转换频率。
- 或者，沿待分析的微管绘制一条宽度为10像素的分段线图3B）。使用 多线扫描图 功能（分析 | 多重线扫图) (图 3C在 FIJI 中观察并测量微管（MT）的生长期（G）、暂停期长度（P）以及微管灾变的频率。
- 长期胶质母细胞瘤侵袭性分析
注意：本分析需要使用生物成像软件进行四维可视化与分析。- 使用文件转换软件（File Converter），将步骤 4.4.3（4 hpi）中获得的原始 4D z-stack 数据转换为适当的软件格式。
- 打开软件并导入转换后的z-stack文件 超越 查看（图 5A).
- 为了分割肿瘤细胞并去除红色通道中的无关自发荧光，请点击 添加新表面 并遵循五步流程。
- 通过点击来验证默认设置 下一步 窗口弹出后点击箭头。进入第2/5步。
注意：如果在561通道中获取荧光信号，眼睛中残留色素产生的自发荧光可能较强，从而影响自动分割过程。当异种移植灶位于眼睛附近时，这一问题尤为显著。在此情况下，必须通过手动裁剪和删除非胶质母细胞瘤细胞信号来完成分割。 - 导航至 561 通道 | 源通道. 通过添加高斯滤波器平滑图像 1.50 µm 在 表面细节 并通过添加 2.5 µm 球体直径 在 扣除背景. 点击 下一步 箭头并进入第 3/5 步。
- 根据信号强度，手动调节 阈值 （背景减除）以包含每个细胞过程。继续进行第4/5步。
- 通过去除不代表细胞部分的事件（如碎片、自发荧光）来过滤已分割的信号。单击 滤器类型 | 体积 手动调整阈值，以排除代表细胞部分的最小体积以下的所有事件。进入第5步（共5步）。
注意：如果自发荧光信号的体积大于最小细胞组分，仍继续操作，并通过手动方式去除不需要的信号 左键单击 和 删除 它们。 - 弃去 分类步骤 并单击完成分割向导 双绿色 箭头以完成创建一个 表面 肿瘤细胞的视野（图5B).
- 通过点击来验证默认设置 下一步 窗口弹出后点击箭头。进入第2/5步。
- 如果分割后的细胞互不接触且未形成一个独立的整体，则需人为合并，以创建肿瘤细胞团块对象。简而言之，点击 统计学 | 详细 | 具体数值 | 体积. 选择所有事件 左键单击 在上方一个上，然后握住 移位 并单击最后一个。导航至 编辑 | 选择 | 合并.
- 定义肿瘤细胞团的质心。单击 添加新斑点 | 跳过自动创建 | 添加（光标与目标相交时） | 目标中心. 保持 移位 单击左键创建斑点，该斑点为分割后的肿瘤细胞团的质心。
- 测量每个胶质母细胞瘤（GBM）细胞与肿瘤团块质心之间的三维距离。为此，创建一个 质心距离通道 通过保持在 斑点 查看并选择 工具 图标 | 距离变换. 等待一个新的 质心距离通道 待创建，同时包括 488 和 561 通道（蓝色 图5C).
注意：该通道中每个体素的强度值对应于该体素到肿瘤细胞团中心点的三维距离。 - 通过点击测量每个分割细胞的三维距离至其质心 添加新斑点 | 跳过自动创建 | 添加（光标相交）| 特定通道 561. 保持 移位 并单击细胞核区域。对每个细胞执行此操作（图 5D).
注意：移除 表面 通过调整视野以更清晰地观察细胞的荧光信号。或者，如果存在，可使用细胞核信号（405 nm 或 647 nm 信号）以获得更高的准确性。 - 点击 统计 | 详细 | 特定值 | 强度均值 Ch=到质心的距离.
注意：该强度值表示细胞核区域与质心之间的三维距离，单位为 µm。 - 将这些强度取平均值，以计算4 hpi时肿瘤团块的半径。对分析中的每个时间点（24 hpi、48 hpi和72 hpi）重复该操作。
注意：仅测量扩散最远的10或20个细胞，以避免低估细胞侵袭能力。实际上，注射过程中细胞受到强制压缩，可能阻碍肿瘤团块中心的细胞迁移。 - 将侵袭指数（II）计算为在 t = 24 hpi/48 hpi/72 hpi 时最远播散细胞的平均三维距离与在 t = 4 hpi 时肿瘤团块平均半径的比值图5E).
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结果
分析微管在过程中所起的作用 在体 GBM侵袭，本文介绍了通过慢病毒感染在GBM细胞中实现稳定微管标记的主要步骤、将GBM细胞原位异种移植至3 dpf斑马鱼幼鱼、微管动态的高分辨率活体成像、微管靶向药物（MTA）处理及其对GBM侵袭的影响，以及微管动态的图像分析 体内 侵袭（图1). 通过沿生长和缩短的微管构建明场图像来测量微管动力学（图3C）或通过随时间手动追踪单个微管末端图3D）。在幼虫培养基中施加药物处理及其对微管网络结构可逆影响的示例见于 图4低剂量诺考达唑（200 nM）处理4小时后，微管网络逐渐收缩，胶质母细胞瘤细胞突起消失图4A）。洗脱药物后，胶质母细胞瘤细胞形成突起的能力得以恢复。洗脱12小时后，细胞重新沿血管迁移。图...
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讨论
以单细胞分辨率成像肿瘤异种移植模型有望成为深入理解胶质母细胞瘤（GBM）生物学特性的不可或缺工具。在小鼠PDX模型中进行的活体成像已为揭示GBM细胞集体侵袭脑组织的机制带来了重要发现。18然而，迄今为止，时空分辨率尚不足以揭示调控胶质母细胞瘤（GBM）侵袭的蛋白质动态过程。我们推测，通过将GBM细胞原位移植到透明的斑马鱼幼鱼中，并结合高分辨率的活体成像技术，可对微管（MTs）等细胞骨架蛋白进行足够精细的分析，从而研究其在侵袭过程中的动态变化 原位 胶质母细胞瘤浸润
该方法的关键步骤在于GBM细胞的制备和显微注射操作。不健康或解离不充分的细胞会相互聚集或黏附于毛细管壁，从而阻塞注射液流。此外，细胞在毛细管中需达到足够浓度，以最小化注射体积并实现细胞的大批量植入。若注射体积过大且细胞浓度过低，则可能导致多个有时相互混杂的肿瘤病灶，使其侵袭指数难以测量。在我们操作经验中，手动操控油压式显微注射仪相比此前类似模型中使用的气压驱动电子显微注射仪，能够更精确地控制注射流速19。这对...
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
我们非常感谢法国巴斯德研究所P. Herbomel博士及其实验室，特别是Valérie Briolat和Emma Colucci-Guyon，为我们提供了斑马鱼品系和显微注射板用的塑料模具，并在斑马鱼实验操作方面提供了宝贵的专业指导。我们谨向UtechS光子生物成像平台（C2RT，法国巴斯德研究所，受法国国家科研署France BioImaging及ANR-10-INBS-04项目“未来投资计划”资助）致以诚挚谢意。本研究得到了抗癌联盟（EL2017.LNCC）、法国国家科学研究中心、巴斯德研究所以及Mrs. 的慷慨捐赠支持。 玛格丽特·米歇尔（Marguerite MICHEL）和波奎先生（Mr. Porquet）
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| <强>胶质母细胞瘤细胞培养 | |||
| 胎牛血清 | Eurobio | CVFSVF00-01 | 试剂 |
| MEM NEAA | Gibco | 11140-050 | 试剂 |
| 改良型伊格尔培养基 | Eurobio | CM1MEM18-01 | 试剂 |
| 青霉素–链霉素 | Gibco | 15140-122 | 试剂 |
| U-87 MG | ECACC | 89081402-1VL | 细胞 |
| <强>慢病毒生产 | |||
| BD FACSAria III | BD生物科学 | 仪器 | |
| BD FACSDiva 软件 v8.0 | BD生物科学 | 软件 | |
| HEK-293T | 默克 | 12022001 | 细胞 |
| pMD2.G | Addgene | 质粒 #12259 | 试剂 |
| psPAX2 | Addgene | 质粒 #12260 | 试剂 |
| 超速离心机 Optima XPN-80 | 贝克曼库尔特 | 仪器 | |
| <强>细胞传代与染色 | |||
| dPBS | Gibco | 14190-094 | 化学 |
| Hoechst 34580 | Sigma-Aldrich | 63493 | 化学 |
| 胰蛋白酶-EDTA（0.05%） | Gibco | 25300-054 | 试剂 |
| <强>斑马鱼养殖 | |||
| 荧光体视显微镜 LEICA M165FC | LEICA | https://www.leica-microsystems.com/fr/produits/stereomicroscopes-et-macroscopes/informations-detaillees/leica-m165-fc/ | 仪器 |
| 亚甲蓝水合物 | Sigma-Aldrich | M4159 | 化学 |
| N-苯基硫脲（PTU） | Sigma-Aldrich | P7629-25G | 化学 |
| 细尖移液管 | 萨姆科科学公司 | 232 | 仪器设备 |
| 大球泡移液管 3 mL | 萨姆科科学公司 | 225 | 仪器设备 |
| 三卡因（氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐） | Sigma-Aldrich | 货号：A5040 | 化学 |
| Volvic 水源水 | DUTSCHER DOMINIQUE SAS | 999556 | 试剂 |
| <强>异种移植 | |||
| 24孔板 | TPP | 92024 | 仪器设备 |
| 硼硅酸盐玻璃毛细管（1.0 OD×0.58 ID×150 L mm） | 哈佛仪器 | #30-0017 GC100-15 | 仪器设备 |
| CellTram oil vario 显微注射仪 | Eppendorf | 5176000.025 | 仪器 |
| 微量上样移液器吸头（Microloader）20µL | Eppendorf | 5242956003 | 仪器设备 |
| 显微操作仪 | NARISHIGE | https://products.narishige-group.com/group1/injection/chinese.html | 仪器设备 |
| 矿物油 | Sigma | M8410-100ml | 仪器设备 |
| 体视显微镜 | 奥林巴斯 | KL 2500 LCD | 仪器 |
| 通用毛细管架 | Eppendorf | 5176190002 | 仪器设备 |
| 垂直式移液器拉制仪 | KOPF (Roucaire) | Model 720 | 仪器 |
| <强>活体成像 | |||
| 3.5 cm 玻璃底视频成像培养皿 | MatTek Life Sciences，马萨诸塞州，美国 | P35G-1,5-14-C | 仪器设备 |
| 采集软件：NIS-Elements-AR 版本 5.21 | 尼康 | 软件 | |
| 加热块 | 特尼 | DRI-BLOCK DB-2D | 仪器设备 |
| 显微镜主机 Nikon Ti2E | 尼康 | 仪器 | |
| sCMOS 相机 Prime 95B | 光度测量 | 仪器 | |
| sCMOS相机Orca Flash 4 | Hammatsu | 仪器 | |
| 超纯低熔点琼脂糖 | Invitrogen | 16520-050 | 化学 |
| Yokagawa CSU-W1 转盘装置 | 滨松 | 仪器 | |
| <强>药物处理 | |||
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | 化学 |
| 诺考达唑 | Sigma-Aldrich | M1404-2MG | 化学 |
| <强>图像分析 | |||
| Imaris 9.5.1 软件 | Oxford Instruments | 软件 | |
| ImarisFileConverter 9.5.1 | Oxford Instruments | 软件 |
参考文献
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