活体成像斑马鱼脑内侵袭性胶质母细胞瘤细胞中微管的动态变化

摘要

我们报道了一种可在胶质母细胞瘤（GBM）细胞侵袭脊椎动物脑组织过程中实现微管动态活体成像的技术。通过将荧光标记的GBM细胞正位注射至透明的斑马鱼脑中，并结合高分辨率的活体成像，可实现对细胞骨架动态变化的观测 原位 癌症侵袭

摘要

在真实人群中，胶质母细胞瘤（GBM）的中位生存时间极低，仅为6至15个月，是破坏性最强的恶性脑肿瘤。治疗失败主要归因于GBM细胞的侵袭性，这凸显了深入理解GBM运动特性的迫切需求。为了研究支持GBM侵袭的分子机制，亟需建立新的生理模型，以实现对侵袭过程中蛋白质动态的深入表征。这些观察结果将为发现阻断肿瘤浸润、改善患者预后的新型治疗靶点铺平道路。本文介绍了将GBM细胞原位移植至斑马鱼脑内，从而实现亚细胞水平的活体实时成像的方法。聚焦于微管（MTs），我们描述了一套实验流程：包括在GBM细胞中标记微管、将GBM细胞显微注射至受精后3天（dpf）斑马鱼幼鱼的透明脑组织中、对播散性异种移植瘤中的微管进行活体成像、调控微管动态以评估其在GBM侵袭过程中的作用，以及对获取的数据进行分析。

引言

细胞运动是一个程序化的过程，需要建立极性轴以及产生驱动力的细胞骨架重排。肌动蛋白的聚合及其与肌球蛋白的相互作用被认为是细胞运动所需突出力和收缩力的主要来源¹。微管被认为在细胞极化和迁移过程中的方向持久性中起主要作用²。近年来的研究还表明，微管能够在三维环境中形成并稳定细胞突起，以支持细胞侵袭过程中的力学压缩力³。更近的研究发现，微管还直接参与了黏着斑处的力传导以及力学敏感性迁移⁴。微管正端动态所表现出的动态不稳定性，表现为反复发生的聚合（生长）和解聚（缩短）阶段，这一过程受到多种微管结合蛋白和细胞内信号通路（如由RHO-GTP酶调控的信号通路）的共同调控^5,6,7。微管网络在细胞迁移与侵袭中的重要作用，使得对微管动态的研究成为深入理解免疫细胞归巢、伤口愈合以及癌症侵袭机制的关键环节。

癌细胞逃离原发性肿瘤核心、在组织中扩散并形成继发性肿瘤的能力，是阻碍50年前宣布的抗癌战争取得全球性成功的关键步骤^8,

方案

动物实验按照欧盟关于实验动物护理的指南进行。所有实验方案均经巴斯德研究所动物实验伦理委员会（CEEA 89）以及法国研究与教育部门批准（许可号 #01265.03）。在注射或活体成像过程中，动物使用Tricaine进行麻醉。实验程序结束后，通过麻醉过量实施安乐死。有关本实验方案所用材料、设备和软件的详细信息，请参见材料表。本方案的整体工作流程见图1。

1. 生成稳定表达 α-tubulin-mKate2 的胶质母细胞瘤细胞

注意：以下步骤均在生物安全二级以上（BSL2+）生物安全柜中进行。

1. 使用磷酸钙法转染 7 × 10⁶ 个细胞，制备表达 mKate2-微管蛋白的慢病毒颗粒⁶ HEK-293T 细胞
   1. 在1.5 mL 微量离心管中，加入10 µg 的2^nd psPAX2 包装质粒 5 µg、病毒包膜质粒 pMD2.G 5 µg，以及目的质粒 pGK-mKate2-人微管蛋白 α1a 10 µg，与 50 µL CaCl₂₂ （2.5 M 母液）。用无菌无DNA酶的H₂O定容至500 µL。₂O.
      注意：必须加入 CaCl₂ ....

结果

分析微管在过程中所起的作用 在体 GBM侵袭，本文介绍了通过慢病毒感染在GBM细胞中实现稳定微管标记的主要步骤、将GBM细胞原位异种移植至3 dpf斑马鱼幼鱼、微管动态的高分辨率活体成像、微管靶向药物（MTA）处理及其对GBM侵袭的影响，以及微管动态的图像分析 体内 侵袭（图1). 通过沿生长和缩短的微管构建明场图像来测量微管动力学（图3C）或通过随时间手动追踪单个微管末端图3D）。在幼虫培养基中施加药物处理及其对微管网络结构可逆影响的示例见于 图4低剂量诺考达唑（200 nM）处理4小时后，微管网络逐渐收缩，胶质母细胞瘤细胞突起消失图4A）。洗脱药物后，胶质母细胞瘤细胞形成突起的能力得以恢复。洗脱12小时后，细胞重新沿血管迁移。图.......

讨论

以单细胞分辨率成像肿瘤异种移植模型有望成为深入理解胶质母细胞瘤（GBM）生物学特性的不可或缺工具。在小鼠PDX模型中进行的活体成像已为揭示GBM细胞集体侵袭脑组织的机制带来了重要发现。¹⁸然而，迄今为止，时空分辨率尚不足以揭示调控胶质母细胞瘤（GBM）侵袭的蛋白质动态过程。我们推测，通过将GBM细胞原位移植到透明的斑马鱼幼鱼中，并结合高分辨率的活体成像技术，可对微管（MTs）等细胞骨架蛋白进行足够精细的分析，从而研究其在侵袭过程中的动态变化 原位 胶质母细胞瘤浸润

该方法的关键步骤在于GBM细胞的制备和显微注射操作。不健康或解离不充分的细胞会相互聚集或黏附于毛细管壁，从而阻塞注射液流。此外，细胞在毛细管中需达到足够浓度，以最小化注射体积并实现细胞的大批量植入。若注射体积过大且细胞浓度过低，则可能导致多个有时相互混杂的肿瘤病灶，使其侵袭指数难以测量。在我们操作经验中，手动操控油压式显微注射仪相比此前类似模型中使用的气压驱动电子显微注射仪，能够更精确地控制注射流速¹⁹。这对.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>胶质母细胞瘤细胞培养
胎牛血清	Eurobio	CVFSVF00-01	试剂
MEM NEAA	Gibco	11140-050	试剂
改良型伊格尔培养基	Eurobio	CM1MEM18-01	试剂
青霉素–链霉素	Gibco	15140-122	试剂
U-87 MG	ECACC	89081402-1VL	细胞
<强>慢病毒生产
BD FACSAria III	BD生物科学		仪器
BD FACSDiva 软件 v8.0	BD生物科学		软件
HEK-293T	默克	12022001	细胞
pMD2.G	Addgene	质粒 #12259	试剂
psPAX2	Addgene	质粒 #12260	试剂
超速离心机 Optima XPN-80	贝克曼库尔特		仪器
<强>细胞传代与染色
dPBS	Gibco	14190-094	化学
Hoechst 34580	Sigma-Aldrich	63493	化学
胰蛋白酶-EDTA（0.05%）	Gibco	25300-054	试剂
<强>斑马鱼养殖
荧光体视显微镜 LEICA M165FC	LEICA	https://www.leica-microsystems.com/fr/produits/stereomicroscopes-et-macroscopes/informations-detaillees/leica-m165-fc/	仪器
亚甲蓝水合物	Sigma-Aldrich	M4159	化学
N-苯基硫脲（PTU）	Sigma-Aldrich	P7629-25G	化学
细尖移液管	萨姆科科学公司	232	仪器设备
大球泡移液管 3 mL	萨姆科科学公司	225	仪器设备
三卡因（氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐）	Sigma-Aldrich	货号：A5040	化学
Volvic 水源水	DUTSCHER DOMINIQUE SAS	999556	试剂
<强>异种移植
24孔板	TPP	92024	仪器设备
硼硅酸盐玻璃毛细管（1.0 OD×0.58 ID×150 L mm）	哈佛仪器	#30-0017 GC100-15	仪器设备
CellTram oil vario 显微注射仪	Eppendorf	5176000.025	仪器
微量上样移液器吸头（Microloader）20µL	Eppendorf	5242956003	仪器设备
显微操作仪	NARISHIGE	https://products.narishige-group.com/group1/injection/chinese.html	仪器设备
矿物油	Sigma	M8410-100ml	仪器设备
体视显微镜	奥林巴斯	KL 2500 LCD	仪器
通用毛细管架	Eppendorf	5176190002	仪器设备
垂直式移液器拉制仪	KOPF (Roucaire)	Model 720	仪器
<强>活体成像
3.5 cm 玻璃底视频成像培养皿	MatTek Life Sciences，马萨诸塞州，美国	P35G-1,5-14-C	仪器设备
采集软件：NIS-Elements-AR 版本 5.21	尼康		软件
加热块	特尼	DRI-BLOCK DB-2D	仪器设备
显微镜主机 Nikon Ti2E	尼康		仪器
sCMOS 相机 Prime 95B	光度测量		仪器
sCMOS相机Orca Flash 4	Hammatsu		仪器
超纯低熔点琼脂糖	Invitrogen	16520-050	化学
Yokagawa CSU-W1 转盘装置	滨松		仪器
<强>药物处理
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650-100ML	化学
诺考达唑	Sigma-Aldrich	M1404-2MG	化学
<强>图像分析
Imaris 9.5.1 软件	Oxford Instruments		软件
ImarisFileConverter 9.5.1	Oxford Instruments		软件