利用MRI、组织透明化和光片显微镜对完整新生小鼠脑进行全脑单细胞成像与分析

摘要

本方案描述了使用iDISCO+对完整小鼠脑组织进行磁共振成像、透明化处理和免疫标记的方法，随后详细介绍了利用光片显微镜进行成像，以及使用NuMorph进行后续分析的步骤。

摘要

组织透明化结合光片显微镜（LSFM）可实现对完整脑结构的细胞分辨率成像，从而对基因或环境扰动引起的结构变化进行定量分析。全脑成像能够更准确地量化细胞，并研究在常规使用的物理切片组织显微成像中可能被遗漏的特定区域差异。利用光片显微镜对透明化脑组织进行成像，相较于共聚焦显微镜，显著提高了图像采集速度。尽管这些成像方法会产生大量脑结构数据，但目前大多数用于透明化组织图像特征定量的计算工具仅限于稀疏细胞群体的计数，而无法对所有细胞核进行分析。

本文展示了 NuMorph（基于细胞核的形态计量学），这是一组用于量化出生后第4天（P4）小鼠脑组织在透明化并经光片显微镜成像后，其标注脑区中所有细胞核及细胞核标记物的分析工具。我们描述了在组织透明化脱水步骤导致组织收缩前，采用磁共振成像（MRI）测量脑体积的方法；随后使用 iDISCO+ 方法进行组织透明化处理（包括免疫标记），再利用商用光片显微镜平台对小鼠脑组织进行细胞分辨率水平的成像。接着，我们展示了使用 NuMorph 进行图像分析的流程，该流程可用于校正荧光强度差异、拼接图像瓦片、多通道图像对齐、细胞核计数，并通过与公开可用图谱配准来标注脑区。

我们采用公开可用的方案和软件设计了这一方法，使得任何具备必要显微镜和计算资源的研究人员均可实施这些技术。这些组织透明化、成像及计算工具可实现对大脑皮层中细胞类型三维（3D）空间结构的测量与定量分析，应可广泛适用于各类野生型或基因敲除小鼠的研究设计。

引言

以单细胞分辨率进行全脑成像，是神经科学领域的一项重要挑战。单细胞分辨率的脑成像技术能够实现对脑环路的详细分析和系统层面的图谱绘制，有助于研究神经精神疾病相关的遗传或环境风险因素如何破坏脑环路，以及胚胎发育过程中的细胞行为和成年大脑中的神经环路^1,2,3。目前已有多种组织学方法可获得重建后三维脑组织的高分辨率图像；然而，这些技术往往需要昂贵且专用的设备，可能与免疫标记不兼容，且某些方法的二维（2D）特性在切片过程中可能导致组织损伤和剪切^4,5。

最近的技术进步提供了一种无需组织切片即可对整个大脑进行成像的替代方法，该方法通过组织透明化技术使大脑变得透明。在大多数组织透明化方法中，透明性的实现主要依赖于去除脂质（因为脂质是光散射的主要来源）以及在成像过程中将样品的折射率（RI）与其浸没溶液的折射率相匹配。这样，光线便能够穿过材料之间的界面而不发生散射^6,7,8,

方案

所有小鼠的使用均符合北卡罗来纳大学教堂山分校机构动物护理和使用委员会（IACUC）的规定，并经其批准。

1. 小鼠解剖与灌注

注意：以下解剖操作使用注射器在 P4 和 P14 小鼠上进行。灌注液体的体积将根据动物的年龄而有所不同。

1. 灌注
   警告：多聚甲醛（PFA）为有害化学品。所有灌注步骤均须在化学通风橱中进行。
   1. 手术前给予戊巴比妥 通过 腹腔注射（100 mg/kg），待麻醉起效。
   2. 当动物达到手术麻醉水平时，使用夹捏脚趾法确认其无反应性。
   3. 在肋骨下方做一个侧向切口，以暴露动物的胸腔。
   4. 使用弯头手术剪，在动物一侧沿肋骨剪至锁骨处，对另一侧进行相同的剪切，使胸骨可被抬起，从而暴露心脏。
   5. 在不损伤降主动脉的前提下，仔细修剪与心脏相连的任何组织，然后在右心房做一小切口，以使血液从血管系统中流出。
   6. 采用基于注射器的方法，通过系统以1.5 mL/min的灌注速率，分别对P14和P4小鼠经左心室灌注10 mL和7 mL磷酸盐缓冲液（PBS）。
   7. 待血液完全清除后，分别对P14和P4小鼠以1.5 mL/min的灌注速率，在4 °C条件下，依次用10 mL PBS + 4% PFA和7 mL PBS....

结果

由于iDISCO+方案会引起明显的组织收缩，肉眼即可观察到（图2B），我们在组织透明化之前增加了MRI步骤，以量化透明化过程所导致的收缩程度。该工作流程首先从MR图像中去除脑外组织（图2C）。接着，应用刚性变换（3个平移和3个旋转角度）将MR图像与光片成像对齐（图2D）。通过该方法，我们观察到组织透明化过程导致总体积减少了60%（图2E），这与肉眼估计的体积变化一致（图2B）。该结果与先前一项研究报告的5%–10%的收缩率存在显著差异^10,32。收缩程度的差异可能源于两项研究中动物年龄的不同（P4 vs. 成年脑组织），或iDISCO+方案透明步骤中甲醇洗涤时间的差异（16小时 vs. 2小时）。为了描绘大脑不同区域的组织收缩.......

讨论

组织透明化方法是用于测量大脑三维细胞结构的有用技术。文献中已描述了多种组织透明化方法，每种方法都有其优势和局限性^6,7,8,9。目前可用于分析透明化组织图像中细胞类型的计算工具相对有限。其他现有工具主要针对稀疏分布的细胞群体设计，这类样本的分割难度较低^10,35，或利用了组织扩增技术¹⁶。本文介绍了利用iDISCO+组织透明化方法制备小鼠脑组织用于成像，并展示了NuMorph——一种用于处理和量化光片显微镜（LSFM）捕获的小鼠皮层结构内细胞核的计算流程。该流程旨在在成像时间长度、细胞核检测准确性与计算资源消耗之间实现恰当平衡。与其他现有工具不同，NuMorph能够可靠地分割所有细胞核，而不仅限于稀疏标记的细胞群体

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Bruker 9.4T/30 cm 磁共振成像仪	Bruker Biospec		水平孔径动物磁共振成像系统
二苄基醚	Sigma-Aldrich	108014-1KG
二氯甲烷（DCM）	Sigma-Aldrich	270997-1L
二甲基亚砜（DMSO）	Fisher-Scientific	ICN19605590
驴血清	Sigma-Aldrich	S30-100ML
EVO 860 4TB 外置固态硬盘
Fomblin Y	特种流体公司	YL-VAC-25-6	全氟聚醚润滑剂
钆对比剂（ProHance）	Bracco 诊断公司	A9576
钆对比剂（ProHance）	Bracco 诊断公司	0270-1111-03
GeForce GTX 1080 Ti 11GB GPU	EVGA	08G-P4-6286-KR
甘氨酸	Sigma-Aldrich	G7126-500G
肝素钠盐	Sigma-Aldrich	H3393-10KU	溶于 H20 至 10 mg/mL
过氧化氢溶液，30%	Sigma-Aldrich	H1009-100ML
ImSpector Pro	LaVision BioTec		显微镜图像采集软件
ITK Snap			分割软件
甲醇	Fisher-Scientific	A412SK-4
MVPLAPO 2x/0.5 NA 物镜	奥林巴斯
多聚甲醛，粉末，95%（PFA）	Sigma-Aldrich	30525-89-4	用1×PBS溶解至4%
10倍磷酸盐缓冲液（PBS）	康宁	46-013-CM	稀释至 H 中的 1 倍浓度2O
叠氮化钠	Sigma-Aldrich	S2002-100G	溶于 H20 到 10%
脱氧胆酸钠	Sigma-Aldrich	D6750-10G
Tergitol NP-40型	Sigma-Aldrich	NP40S-100ML
TritonX-100	Sigma-Aldrich	T8787-50ML
Tween-20	Fisher-Scientific	BP337 500
Ultramicroscope II 光片显微镜	LaVision BioTec
Xeon 处理器 E5-2690 v4	英特尔	E5-2690
Zyla sCMOS 相机	Andor		互补金属氧化物半导体相机
<强>抗体			<强>工作浓度
Alexa Fluor 山羊 790 抗兔	赛默飞世尔科技	A11369	(1:50)
Alexa Fluor 568 山羊抗大鼠	赛默飞世尔科技	A11077	(1:200)
抗Ctip2大鼠单克隆抗体	Abcam	ab18465	(1:400)
兔抗 Brn2 抗体	细胞信号技术公司	12137	(1:100)
To-Pro 3 (TP3)	赛默飞世尔科技	T3605	(1:400)