方法文章

利用MRI、组织透明化和光片显微镜对完整新生小鼠脑进行全脑单细胞成像与分析

3.6K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/64096

⸱

2022年8月1日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1UNC Neuroscience Center, University of North Carolina, Chapel Hill, 2Department of Genetics, University of North Carolina, Chapel Hill, 3Department of Psychiatry, University of North Carolina, Chapel Hill, 4Center for Animal Magnetic Resonance Imaging, The University of North Carolina at Chapel Hill, 5Biomedical Research Imaging Center, The University of North Carolina at Chapel Hill, 6Department of Neurology, The University of North Carolina at Chapel Hill, 7Department of Computer Science, The University of North Carolina at Greensboro

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案描述了使用iDISCO+对完整小鼠脑组织进行磁共振成像、透明化处理和免疫标记的方法，随后详细介绍了利用光片显微镜进行成像，以及使用NuMorph进行后续分析的步骤。

摘要

组织透明化结合光片显微镜（LSFM）可实现对完整脑结构的细胞分辨率成像，从而对基因或环境扰动引起的结构变化进行定量分析。全脑成像能够更准确地量化细胞，并研究在常规使用的物理切片组织显微成像中可能被遗漏的特定区域差异。利用光片显微镜对透明化脑组织进行成像，相较于共聚焦显微镜，显著提高了图像采集速度。尽管这些成像方法会产生大量脑结构数据，但目前大多数用于透明化组织图像特征定量的计算工具仅限于稀疏细胞群体的计数，而无法对所有细胞核进行分析。

本文展示了 NuMorph（基于细胞核的形态计量学），这是一组用于量化出生后第4天（P4）小鼠脑组织在透明化并经光片显微镜成像后，其标注脑区中所有细胞核及细胞核标记物的分析工具。我们描述了在组织透明化脱水步骤导致组织收缩前，采用磁共振成像（MRI）测量脑体积的方法；随后使用 iDISCO+ 方法进行组织透明化处理（包括免疫标记），再利用商用光片显微镜平台对小鼠脑组织进行细胞分辨率水平的成像。接着，我们展示了使用 NuMorph 进行图像分析的流程，该流程可用于校正荧光强度差异、拼接图像瓦片、多通道图像对齐、细胞核计数，并通过与公开可用图谱配准来标注脑区。

我们采用公开可用的方案和软件设计了这一方法，使得任何具备必要显微镜和计算资源的研究人员均可实施这些技术。这些组织透明化、成像及计算工具可实现对大脑皮层中细胞类型三维（3D）空间结构的测量与定量分析，应可广泛适用于各类野生型或基因敲除小鼠的研究设计。

引言

以单细胞分辨率进行全脑成像，是神经科学领域的一项重要挑战。单细胞分辨率的脑成像技术能够实现对脑环路的详细分析和系统层面的图谱绘制，有助于研究神经精神疾病相关的遗传或环境风险因素如何破坏脑环路，以及胚胎发育过程中的细胞行为和成年大脑中的神经环路1,2,3。目前已有多种组织学方法可获得重建后三维脑组织的高分辨率图像；然而，这些技术往往需要昂贵且专用的设备，可能与免疫标记不兼容，且某些方法的二维（2D）特性在切片过程中可能导致组织损伤和剪切4,5。

最近的技术进步提供了一种无需组织切片即可对整个大脑进行成像的替代方法，该方法通过组织透明化技术使大脑变得透明。在大多数组织透明化方法中，透明性的实现主要依赖于去除脂质（因为脂质是光散射的主要来源）以及在成像过程中将样品的折射率（RI）与其浸没溶液的折射率相匹配。这样，光线便能够穿过材料之间的界面而不发生散射6,7,8,9。

组织透明化方法（如iDISCO+）通常与基于单光子激发显微镜的快速三维成像技术（如光片荧光显微镜，LSFM6,7,10）联合使用。在用荧光染料标记的透明组织中，光片荧光显微镜通过一束薄层光对样本进行激发，从而实现对光学切片的成像11。LSFM的主要优势在于每次仅照亮一个光学切片，使该切片内所有荧光分子同时被激发，从而最大限度地减少光漂白。此外，对整个光学切片进行成像可实现基于相机的信号检测，显著提高成像速度，优于点扫描方式12。LSFM能够无损地生成配准良好的光学切片，适用于三维重建。

尽管iDISCO+方法可在约3周内实现低成本的组织透明化，但该方案中的脱水步骤可能导致组织收缩以及样本形态的潜在改变，从而影响体积测量结果6,10。在组织透明化处理前增加一种辅助成像方法（如磁共振成像，MRI），可用于测量整个样本因透明化处理所引起的收缩程度。在脱水过程中，灰质与白质之间机械特性的差异可能导致脑组织发生不均匀形变，进而造成野生型与突变型样本之间因透明化处理引起的体积形变不一致，这可能干扰对这些样本间体积差异的解释10,13。MRI操作首先需对动物灌注对比剂（例如钆），随后将目标组织浸泡于浸没液（例如氟化油，fomblin）中，再进行成像14。MRI与组织透明化及在同一样本上进行光片显微镜（LSFM）成像相兼容。

光片显微镜（LSFM）通常用于生成大尺度的显微图像，以定性观察目标脑组织，而非对脑结构进行定量评估（图1）。缺乏定量评估时，难以展示由遗传或环境损伤所导致的结构差异。随着组织透明化和成像技术的进步，以及存储和计算成本的降低，对目标组织内细胞类型定位进行定量分析正变得越来越可行，使更多研究人员能够在研究中纳入此类数据。

小鼠大脑包含超过一亿个细胞15，全脑成像实验可能产生TB级的数据，因此对先进图像分析工具的需求日益增长，以实现对图像中诸如细胞等特征的精确量化。目前已有多种用于组织透明化图像的分割方法，这些方法通过细胞核染色强度的阈值设定，并结合预定义的形状、大小或密度对目标进行筛选10,16,17,18。然而，由于细胞大小、图像对比度和标记强度等参数存在差异，可能导致结果解读不准确。本文介绍了我们已建立的小鼠脑内细胞核定量技术方案。首先，我们详细描述了P4阶段小鼠脑组织的采集步骤，随后介绍了基于公开可用的iDISCO+方法优化的组织透明化与免疫标记流程10。其次，我们阐述了使用MRI和光片显微镜进行图像采集的过程，包括图像采集所用的具体参数。最后，我们介绍并演示了NuMorph19——这是我们课题组开发的一套图像分析工具，可在完成组织透明化、核标记免疫标记以及特定脑区光片成像后，实现细胞类型特异性的定量分析。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

所有小鼠的使用均符合北卡罗来纳大学教堂山分校机构动物护理和使用委员会（IACUC）的规定，并经其批准。

1. 小鼠解剖与灌注

注意：以下解剖操作使用注射器在 P4 和 P14 小鼠上进行。灌注液体的体积将根据动物的年龄而有所不同。

  1. 灌注
    警告：多聚甲醛（PFA）为有害化学品。所有灌注步骤均须在化学通风橱中进行。
    1. 手术前给予戊巴比妥 通过 腹腔注射（100 mg/kg），待麻醉起效。
    2. 当动物达到手术麻醉水平时，使用夹捏脚趾法确认其无反应性。
    3. 在肋骨下方做一个侧向切口，以暴露动物的胸腔。
    4. 使用弯头手术剪，在动物一侧沿肋骨剪至锁骨处，对另一侧进行相同的剪切，使胸骨可被抬起，从而暴露心脏。
    5. 在不损伤降主动脉的前提下，仔细修剪与心脏相连的任何组织，然后在右心房做一小切口，以使血液从血管系统中流出。
    6. 采用基于注射器的方法，通过系统以1.5 mL/min的灌注速率，分别对P14和P4小鼠经左心室灌注10 mL和7 mL磷酸盐缓冲液（PBS）。
    7. 待血液完全清除后，分别对P14和P4小鼠以1.5 mL/min的灌注速率，在4 °C条件下，依次用10 mL PBS + 4% PFA和7 mL PBS + 4% PFA进行再次灌注，以固定动物组织。
      注意：将观察到固定性震颤，动物在固定完成后会变得僵硬。若对样本进行磁共振成像（MRI），需在每个时间点使用与PBS和PFA相似体积的溶液灌注，并在PFA溶液中加入20%基于钆的MRI对比剂。
    8. 使用手术剪去除头部，并用含4%多聚甲醛的PBS在4 °C下浸泡固定24小时，以确保完全固定。
      ​注意：在此阶段，脑组织仍与颅骨保持完整（参见第2节）。 暂停点： 在此阶段，脑组织可在含0.1%叠氮化钠的PBS中于4 °C保存数月。

2. 基于磁共振的完整颅骨脑部大体结构成像与分析

注意：必须在不将脑组织从颅骨中取出的情况下，按照上述方法进行灌注并用钆进行孵育。所有磁共振成像均需在脑组织离体前完成，以避免解剖过程中发生意外的组织丢失。在样本制备和成像过程中，保持颅骨完整也能为样本 holder（即注射器）中的脑组织提供支撑。

  1. 样品制备
    注意：以下步骤针对 P4 和 P14 小鼠脑组织样本进行了优化。所需注射器的尺寸取决于样本的实际大小。
    1. 若对样本进行 MRI 检测，需去除颅骨上的皮肤，并在含 3% 钆的 PBS 中于 4 °C 下孵育 23 天后再进行成像14。孵育 23 天后，用 PBS 快速冲洗样本。
    2. 使用 5 mL 注射器制作用于 MRI 的样本支架，利用注射器活塞封闭由注射器筒身构成的支架两端20。使用塑料部件将颅骨牢固固定在支架内（图 2A）。用乙醇去除注射器上的刻度标记，以避免成像时产生伪影。
    3. 将颅骨牢固地放入样本支架中，并加入与 MRI 兼容的浸没液（参见材料表）。封闭支架，并用注射器去除所有气泡。
      注意：暂停点：颅骨可在浸没液中保存数月后再进行成像。
  2. 大体脑结构成像（MRI）
    1. 使用 9.4T/30 cm 水平孔径动物 MRI 系统，配备 15 mm 体积线圈，采用基于自旋回波的序列对样本进行成像，参数如下：空间分辨率：60 µm × 60 µm × 60 µm；总扫描时间：7 小时 12 分钟；回波时间（TE）：6.83 ms；重复时间（TR）：40 ms；激发/重聚焦翻转角度：90/180 度；图像尺寸：166 × 168 × 209 体素；视野（FOV）：9.9 mm × 10.1 mm × 12.4 mm；带宽：100,000 kHz。
  3. 大体脑结构的计算分析
    1. 使用分割软件手动勾画小鼠脑组织，从原始 MRI 图像中去除周围的颅骨。随后，在掩膜图像与原始 MRI 图像之间执行体素级乘法运算，生成去颅骨后的脑部 MRI 图像。
      注意：输出结果为二值掩膜图像，其中脑组织体素的强度值设为 1，其余区域为 0。
    2. 使用 FSL 软件包中的 'flirt' 工具进行刚性图像配准（仅估计平移和旋转），将去颅骨后的 MRI 图像（移动图像）与相应的光片显微镜图像（参考图像）对齐21,22。
    3. 使用 ANTS 软件中的 'SyN' 方法进行非刚性配准23，建立步骤 2.3.2 中刚性配准后的 MRI 图像与光片图像（同步骤 2.3.2 中的参考图像）之间的点对点对应关系。
      注意：输出结果包括形变后的 MRI 图像以及与从 MRI 到光片图像体积变化相关的形变场。
    4. 在步骤 2.3.3 生成的形变场上计算雅可比行列式（Jacobian determinant），用于量化 3 × 3 × 3 体素局部邻域内的体积变化。
    5. 使用可变形图像配准方法将去颅骨后的图像与 Allen 发育小鼠脑图谱对齐。
      ​注意：已建立的空间点对点对应关系可实现对新小鼠图像中感兴趣脑区的自动标注（图 2C-H）。

3. 从颅骨中解剖脑组织

  1. 从颈部到鼻部沿颅骨顶部正中线做切口，暴露颅骨。
  2. 修剪残留的颈部肌肉及其他所有残余肌肉，暴露颅底。
  3. 使用锋利的手术剪，在颅骨内表面小心剪开，操作时应保持轻微向上的压力，避免锋利的手术器械损伤脑组织。
  4. 用镊子将剪开的两半颅骨从脑组织上剥离，并小心清除附着在脑组织上的多余脂肪。
  5. 用手术剪剪除连接脑组织与颅骨的硬脑膜，然后用刮匙轻轻将脑组织从颅腔中取出。
  6. 取出脑组织后，用PBS冲洗，随后转移至含0.1%叠氮化钠的PBS中，于4 °C保存以用于长期储存。

4. 组织透明化

注意：本方案改编自适用于 P4 小鼠的 iDISCO+ 方案6，并进行了少量修改。对于不同的时间点、物种或实验，部分细节可能需要调整。警告：甲醇、二氯甲烷（DCM）和二苄基醚（DBE）为危险化学品。组织透明化步骤必须在化学通风橱中进行。

  1. 抗体验证
    注意：未经测试的抗体与甲醇的兼容性需要进行检查，因为iDISCO+方案中所需的剧烈甲醇洗涤可能对其产生不利影响。有关已在iDISCO+中验证有效的抗体列表，请参见网站24。
    1. 将PFA固定的感兴趣组织的10 µm冷冻切片收集到体视学载玻片上。
    2. 在室温下用100%甲醇孵育切片3小时。
    3. 在继续标准免疫组织化学流程前，用PBS重新水化切片，以确定抗体在甲醇洗涤后是否仍显示预期的荧光模式。作为阳性对照，使用未经甲醇处理的切片。
  2. 缓冲液配制
    1. 根据官方iDISCO方案配制缓冲液。本方案所用缓冲液及其他溶液的组成详见材料表。
  3. 预处理
    1. 使用甲醇/PBS梯度进行样品脱水：20%、40%、60%、80%、100%；每个浓度在室温下处理1小时。
      注意：在脱水过程中使用PBS有助于防止样品在甲醇洗涤中发生开裂。
    2. 在100%甲醇中洗涤样品1小时，然后在4 °C下冷却1小时，再于室温下在66%二氯甲烷（DCM）/33%甲醇中振荡孵育过夜。
    3. 在室温下用100%甲醇洗涤样品两次，每次1小时，然后在4 °C下冷却。
    4. 使用新鲜配制的5% H2O2甲醇溶液在4 °C下对样品漂白过夜。
    5. 使用甲醇/PBS梯度重新水化样品：80%、60%、40%、20%、PBS；每个步骤在室温下处理1小时，并在PTx.2中洗涤两次，每次1小时。
    6. 在1x PBS/0.2% TritonX-100/20% DMSO中于37 °C孵育过夜。
    7. 在1x PBS/0.1% Tween-20/0.1% TritonX-100/0.1% 脱氧胆酸钠/0.1% NP40/20% DMSO中于37 °C孵育过夜。
    8. 在室温下用PTx.2洗涤两次，每次1小时。
  4. 免疫标记
    1. 在37 °C下用通透化溶液孵育样品2天（约48小时）。
    2. 在37 °C下用封闭液封闭样品2天（约48小时）。
    3. 在37 °C下用PTwH / 5% DMSO / 3% 血清稀释的一抗孵育样品4天（约96小时）（例如，兔源Brn2/POU3F2单克隆抗体（1:100）和抗Ctip2大鼠抗体（1:400））（材料表）。
    4. 在PTwH中洗涤3次，每次1小时；再在PTwH中洗涤2小时；最后在洗涤液中于室温下过夜放置。
    5. 在37 °C下用二抗和核染料（如TO-PRO-3）在PTwH / 3% 血清中孵育样品4天（约96小时）（例如，山羊抗兔抗体（1:50）和山羊抗大鼠抗体（1:200））（材料表）。
    6. 在PTwH中洗涤3次，每次1小时；再在PTwH中洗涤2小时；最后在洗涤液中于室温下过夜放置。
  5. 透明化处理
    1. 使用甲醇/PBS梯度脱水：20%、40%、60%、80%、100%；每个浓度在室温下处理1小时。然后在室温下于66% DCM / 33% 甲醇中振荡孵育3小时。
      注意：样品可在100%甲醇脱水后直接于室温下过夜放置。
    2. 在室温下用100% DCM洗涤两次，每次15分钟（振荡）以去除甲醇。
    3. 在二苄基醚（DBE）中于室温下孵育，不振荡。确保管内几乎完全充满DBE以防止样品氧化。成像前通过轻轻倒置数次完成混合。

5. 光片成像

注意：iDISCO 透明化处理的脑组织使用配备有 2X/0.5 NA 物镜、互补金属氧化物半导体相机以及显微镜操作和图像采集软件的光片显微镜进行成像，P4 时间点的成像分辨率设置为 0.75 x 0.75 x 4 µm/体素，该分辨率可在皮层内实现单细胞水平的分辨（图 3A，B）。

  1. 样品安装
    1. 小心地将样品安装到合适尺寸的样品 holder 中，确保样品的 z 轴方向深度不超过 5.2 mm，以适应光片显微镜的额定工作距离（5.7 mm 减去 0.5 mm 安全余量）25。
    2. 将 holder 放入样品托架中，使 holder 上的螺丝与托架支撑成 45° 角（图 1B）。调整托架位置，使光路与样品垂直（图 1C）。
  2. 成像参数
    1. 将显微镜的变倍体设置为 4x 或更高倍率，以获得 0.75 µm/像素的分辨率。
      注：P4 阶段光片图像的单细胞计算分析可使用任何商业化的光片显微镜完成，只要其分辨率可达 0.75 × 0.75 × 4 µm/体素或更高即可。对于后期时间点的大脑样本，由于细胞核分布更稀疏，较低分辨率亦可满足要求。
    2. 在图像采集软件中，选择 单光片 模式，数值孔径 NA = ~0.08（光片厚度 9 µm，z 轴步进 4 µm）。
      注：该设置结合水平动态聚焦功能，可在合理时间内实现小鼠全脑的单细胞分辨率成像。对于出生后第 4 天（P4）的大脑，根据脑组织大小，三通道图像采集时间预计为 11–15 小时。
    3. 为确保在图像宽度方向上保持轴向分辨率，请选择 水平动态聚焦，并根据激光波长选择推荐的步数。对于完整的 P4 小鼠大脑，将水平动态聚焦设置为 11 步。针对每个通道相对于参考通道调整 精细聚焦。
      注：此处使用 TO-PRO-3 通道（647 nm） 与艾伦发育小鼠脑图谱（Allen Developmental Mouse Brain Atlas）进行配准，因其可标记所有细胞核。
    4. 根据各通道的特性调整 激光功率。
      注：较长波长所需的激光功率高于较短波长。例如，780 nm 通道需以 高激光功率（70%–75%） 和 低曝光时间（50 ms） 进行成像，而 647 nm 通道 则需使用 中等激光功率（40%–45%） 和 低曝光时间（50 ms）。
    5. 将 光片宽度 调整至 ~50%，以确保在此样品尺寸下，光片功率在 y 维度上分布最优。
      注：结合水平动态聚焦功能，50% 的光片宽度可在图像上实现较均匀的功率分布，并降低光漂白风险25。
    6. 根据样品大小设置 拼接图像数量，建议相邻图像间具有 15% 的 重叠率，并在每个拼接位置依次对各通道进行逐层成像。

使用 NuMorph 进行图像处理

注意：NuMorph 分析流程包含三个用于三维图像分析的主要部分：预处理、分析和评估。这些部分分别被组织在 NMp_template.m、NMa_template.m 和 NMe_template.m 文件中，下文将对此进行讨论。此外，NM_setup.m 用于下载并安装 NuMorph 正常运行所需的软件包。NM_samples.m 还提供了输入图像采集信息的模板。

  1. NuMorph 系统设置
    1. 下载并安装 conda 环境管理器 适用于 Linux26下载并安装 NuMorph19 图像处理工具
    2. 在命令行中运行 Matlab。运行 NM_setup.m 从 NuMorph 下载并安装分析所需的图像分析软件包。
      注意：此步骤可确保正确设置 conda 环境，并确保下载和安装 Matlab 运行全部三个流程所需的所有工具和附加组件。其中尤为关键的是用于图像配准的 Elastix 以及用于细胞检测与计数的 3D-Unet。
  2. 通过编辑文件 NM_samples.m 来指定样本名称、输入和输出目录、通道信息以及光片成像参数。
    注意：建议仔细检查以确保正确输入了相关信息，尤其是图像输入目录。通常在执行后续步骤之前，此处不会报错。
  3. 图像预处理
    1. 强度调整
      1. 在 NMp_template 中设置 强度调整 = true.
        注意：如果需要进行强度调整，则设置为 true；否则设置为 false 强度调整 = false也可选择使用“更新”来覆盖先前的调整参数。
      2. 设置 使用处理后的图像 = false 当使用一组新图像时。否则，在输出目录中指明任何先前保存的图像数据集（例如， "对齐", "拼接"）用于后续处理步骤。
        注意：此选项适用于输入图像已完成预处理的情况。在此情况下，预处理后的图像将用作输入图像，该选项将设置为输出目录中子目录的名称。
      3. 设置 保存图像 = true.
        注意：使用此选项可确保处理后的图像保存在输出目录中；否则，仅计算并保存参数。
      4. 设置 保存样本 = true.
        注意：此选项可确保每个主要步骤的样本结果均被保存。
      5. 设置 调整拼贴着色 = 基本 使用 BaSiC 算法进行明场校正27 或使用特定光片宽度下光片显微镜的测量结果，手动应用瓦片明暗校正。
        注意：此选项可校正由光片腰形形状导致的 y 维度照明不均。
    2. 图像通道校准
      1. 在 NMp_template 中设置 通道对齐 = true将此选项设为 true（真）以启用通道对齐；若不需要，则设为 false（假）。将通道对齐方法设置为平移（刚性）或 elastix（非刚性）。
        注意：该配准方法在对齐多个通道时采用刚性二维配准算法，而elastix方法则使用非刚性B样条。28 校正长时间图像采集过程中可能出现的旋转漂移19.
    3. 迭代图像拼接
      1. 在 NMp_template 中设置 拼接图像 = true.
        注意：如果需要进行图像拼接，请将此选项设置为 true。
      2. 设置 筛选优化 = true.
        注意：此选项用于通过尺度不变特征变换（Scale Invariant Feature Transform）进一步优化 xy 方向上的配准29.
      3. 设置 加载对齐参数 = true.
        注意：此选项在拼接过程中利用通道对齐平移参数。建议在多通道成像时使用此选项，否则应设为 false。
      4. 设置 重叠率 = 0.15 成像过程中匹配图块重叠区域。
    4. 要在 NMp_template 环境外的 Matlab 中运行上述任一预处理步骤，请执行以下命令：
      1. 指定样本名称。设置 config = NM_config(过程, 样品).
      2. 通过指定 NM_process(config,stage) 来运行任意预处理步骤，并使用 intensity、align 或 stitch 来指定任一处理阶段。检查每个阶段输出目录中的输出文件图3 和 图4).
  4. 图像分析
    1. 在 NuMorph 之前
      1. 从一幅三维图谱图像和一幅相应的标注图像开始，后者将每个体素分配给特定的结构。
        注意：该P4艾伦发育小鼠脑图谱由MagellanMapper生成30 此处使用。
      2. 将图谱图像和标注文件对齐，以确保它们在正确的方向上准确匹配。
    2. 在 NuMorph 内
      注意：现在图谱及其标注已正确对齐，这些文件必须 "已损坏" 或在 NuMorph 中进行处理，以便保存供后续使用。为此，请使用 munge_atlas 函数指定输入，如下所示。
      1. 指定 图谱文件：（字符串）。提供图谱文件的完整路径。
      2. 指定 注释文件：（字符串）。提供关联注释的完整路径。
      3. 指定 分辨率：（1×3 数值）。指定图谱 y、x、z 方向的分辨率，单位为微米/像素。
      4. 指定 方向：（1 × 3 字符）。提供图谱方向，并确保其与样本在支架中的放置方向一致（前(a)/后(p)、上(s)/下(i)、左(l)/右(r)）。
      5. 指定 半球：注明所成像的脑半球（"左侧", "右侧", "两者", "无").
      6. 指定 输出分辨率:(int)。指定图谱输出的各向同性分辨率，单位为微米。（默认值：25）。
      7. 运行该命令 "munge_atlas(图谱文件, 注释文件, 分辨率, 方向, 半球)" 在 /data/annotation_data 中生成混淆的注释文件，并在 /data/atlas 中保存一份图谱图像的副本。
      8. 读取 Matlab 结构和图谱文件，以验证两个文件均正确合并且方向无误。
        注意：可额外进行细胞分类步骤，通过免疫标记的蛋白标志物共定位来定量分析细胞类型。
    3. 重采样
      1. 在 NMa_template 中设置 重采样图像 = true，如果要对高分辨率数据集进行图像配准以参照图谱或生成降采样体积。
        注意：NMa_template.m 将用于设置重采样、配准、细胞核检测和细胞计数的参数。
      2. 将重采样分辨率设置为与图谱一致。
        注意：此处为 25 µm3使用各向同性体素分辨率，因为参考图谱的分辨率即为此值。
      3. 使用 resample channels = [ ] 指定需重采样的通道编号。
        注意：此处通道编号应设置为与核通道一致。如果该选项为空，则仅对配准通道进行重采样。
    4. 注册
      1. 在 NMa_template 中设置 注册图像 = true如果需要注册，则设为 true；否则，设 registration = false。
      2. 指定与图谱目录中的文件相匹配的图谱文件。
      3. 设置 注册参数 = 默认.
        注意：此选项采用仿射变换后接B样条变换来估计空间对应关系。否则，需定义一组新的配准参数 通过 Elastix 在 /data/elastix_parameter_files/atlas_registration。
      4. 设置 保存已注册的图像 = true.
        注意：配准和重采样生成的输出文件可在 Matlab 或 FIJI 等可视化工具中下载并进行可视化检查31.
    5. 细胞核检测、细胞计数与分类
      注意：此处出现的错误可能是由于未正确指定注释文件，或未将样本的年龄与正确的注释相匹配所致。
      1. 在 NMa_template 中，设置两者 计数细胞核 和 对细胞进行分类 = true.
      2. 设置 计数方法 = 3dunet.
        注意：此选项允许使用训练好的 3D-Unet 模型19否则，选择使用Hessian斑点检测方法的Hessian。
      3. 设置 最小强度 定义检测对象的最小强度阈值。
        注意：适当的阈值需根据细胞核标记的信噪比通过经验确定。
      4. 设置 分类方法 基于质心位置的无监督荧光强度或支持向量机（SVM），后者建模为有监督的线性支持向量机分类器。
        注意：此步骤将利用三通道成像将所有检测到的细胞分为四大类。根据本方案，Ctip2+/Brn2-Ctip2-/Brn2+Ctip2-/Brn2-，同时生成离群值。
    6. 分析步骤
      1. 指定样品名称。设置 config = NM_config(分析, 样本).
      2. 通过指定 NM_analyze(config, stage) 来运行任意分析步骤，并使用 resample、register、count 或 classify 来指定阶段。检查输出目录中每个阶段的输出文件图5).
    7. 细胞类型分类与群体分析
      1. 在 NMe_template 中， 设置更新 = true 并覆盖所有先前计算的统计结果。
        注意：NMe_template.m 提供了在同一脑组织的不同脑区之间进行细胞类型分组分析的选项。
      2. 设置 通过比较结构 可选择索引以根据所有唯一注释进行比较，或选择表格以根据表格比较结构。
      3. 设置 模板文件，该文件指定了所有可能的结构索引，且必须存在于 /annotations 目录中。
      4. 设置 结构表格 并指定需评估的结构。
      5. 按照 NMa_template.m 中所述进行细胞计数和细胞类型分类。
      6. 设置 比较组别 指定要比较的组别。
      7. 将“配对”设置为 true 或 false，以决定是否执行配对 t检验或双样本 t-测试。
    8. 运行分析。
      注意：执行此步骤时，需在 Matlab 中但不在 NMe_template.m 环境下运行以下命令。
      1. 指定样本名称。设置 config = NM_config(评估, 样本).
      2. 指定分析步骤以运行分析 NM_evaluate(config, stage) 并指定阶段。检查输出目录以获取组分析的输出文件。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

由于iDISCO+方案会引起明显的组织收缩，肉眼即可观察到（图2B），我们在组织透明化之前增加了MRI步骤，以量化透明化过程所导致的收缩程度。该工作流程首先从MR图像中去除脑外组织（图2C）。接着，应用刚性变换（3个平移和3个旋转角度）将MR图像与光片成像对齐（图2D）。通过该方法，我们观察到组织透明化过程导致总体积减少了60%（图2E），这与肉眼估计的体积变化一致（图2B）。该结果与先前一项研究报告的5%–10%的收缩率存在显著差异10,32。收缩程度的差异可能源于两项研究中动物年龄的不同（P4 vs. 成年脑组织），或iDISCO+方案透明步骤中甲醇洗涤时间的差异（16小时 vs. 2小时）。为了描绘大脑不同区域的组织收缩...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

组织透明化方法是用于测量大脑三维细胞结构的有用技术。文献中已描述了多种组织透明化方法，每种方法都有其优势和局限性6,7,8,9。目前可用于分析透明化组织图像中细胞类型的计算工具相对有限。其他现有工具主要针对稀疏分布的细胞群体设计，这类样本的分割难度较低10,35，或利用了组织扩增技术16。本文介绍了利用iDISCO+组织透明化方法制备小鼠脑组织用于成像，并展示了NuMorph——一种用于处理和量化光片显微镜（LSFM）捕获的小鼠皮层结构内细胞核的计算流程。该流程旨在在成像时间长度、细胞核检测准确性与计算资源消耗之间实现恰当平衡。与其他现有工具不同，NuMorph能够可靠地分割所有细胞核，而不仅限于稀疏标记的细胞群体

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本研究工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）（JLS 获资助项目 R01MH121433、R01MH118349 和 R01MH120125，GW 获资助项目 R01NS110791）以及 Hope 基金会的支持。我们感谢显微镜服务实验室的 Pablo Ariel 在样本成像方面的协助。病理学与实验室医学系显微镜服务实验室的部分支持来自北卡罗来纳大学（UNC）Lineberger 综合癌症中心的癌症中心核心支持拨款 P30 CA016086。神经科学显微镜核心设施由资助项目 P30 NS045892 支持。 本出版物所报告的研究还部分得到了北卡罗来纳州生物技术中心机构支持拨款 2016-IDG-1016 的支持。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Bruker 9.4T/30 cm 磁共振成像仪Bruker Biospec水平孔径动物磁共振成像系统
二苄基醚Sigma-Aldrich108014-1KG
二氯甲烷（DCM）Sigma-Aldrich270997-1L
二甲基亚砜（DMSO）Fisher-ScientificICN19605590
驴血清Sigma-AldrichS30-100ML
EVO 860 4TB 外置固态硬盘
Fomblin Y特种流体公司YL-VAC-25-6全氟聚醚润滑剂
钆对比剂（ProHance）Bracco 诊断公司A9576
钆对比剂（ProHance）Bracco 诊断公司0270-1111-03
GeForce GTX 1080 Ti 11GB GPUEVGA08G-P4-6286-KR
甘氨酸Sigma-AldrichG7126-500G
肝素钠盐Sigma-AldrichH3393-10KU溶于 H20 至 10 mg/mL
过氧化氢溶液，30%Sigma-AldrichH1009-100ML
ImSpector ProLaVision BioTec显微镜图像采集软件
ITK Snap分割软件
甲醇Fisher-ScientificA412SK-4
MVPLAPO 2x/0.5 NA 物镜奥林巴斯
多聚甲醛，粉末，95%（PFA）Sigma-Aldrich30525-89-4用1×PBS溶解至4%
10倍磷酸盐缓冲液（PBS）康宁46-013-CM稀释至 H 中的 1 倍浓度2O
叠氮化钠Sigma-AldrichS2002-100G溶于 H20 到 10%
脱氧胆酸钠Sigma-AldrichD6750-10G
Tergitol NP-40型Sigma-AldrichNP40S-100ML
TritonX-100Sigma-AldrichT8787-50ML
Tween-20Fisher-ScientificBP337 500
Ultramicroscope II 光片显微镜LaVision BioTec
Xeon 处理器 E5-2690 v4英特尔E5-2690
Zyla sCMOS 相机Andor互补金属氧化物半导体相机
<强>抗体<强>工作浓度
Alexa Fluor 山羊 790 抗兔赛默飞世尔科技A11369(1:50)
Alexa Fluor 568 山羊抗大鼠赛默飞世尔科技A11077(1:200)
抗Ctip2大鼠单克隆抗体Abcamab18465(1:400)
兔抗 Brn2 抗体细胞信号技术公司12137(1:100)
To-Pro 3 (TP3)赛默飞世尔科技T3605(1:400)

参考文献

  1. Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: Three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
  2. Hägerling, R., et al. A novel multistep mechanism for initial lymphangiogenesis in mouse embryos based on ultramicroscopy. The EMBO Journal. 32 (5), 629-644 (2013).
  3. Tomer, R., Khairy, K., Keller, P. J. Shedding light on the system: studying embryonic development with light sheet microscopy. Current Opinion in Genetics & Development. 21 (5), 558-565 (2011).
  4. Li, A., et al. Micro-optical sectioning tomography to obtain a high-resolution atlas of the mouse brain. Science. 330 (6009), 1404-1408 (2010).
  5. Stoner, R., et al. Patches of disorganization in the neocortex of children with autism. The New England Journal of Medicine. 370 (13), 1209-1219 (2014).
  6. Renier, N., et al. IDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  7. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  8. Richardson, D. S., et al. Tissue clearing. Nature Reviews. Methods Primers. 1 (1), 84(2021).
  9. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  10. Renier, N., et al. Mapping of brain activity by automated volume analysis of immediate early genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
  11. Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 59 (2), 129-138 (2011).
  12. Girkin, J. M., Carvalho, M. T. The light-sheet microscopy revolution. Journal of Optics. 20 (5), 053002(2018).
  13. Budday, S., et al. Mechanical properties of gray and white matter brain tissue by indentation. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 46, 318-330 (2015).
  14. Johnson, G. A., et al. High-throughput morphologic phenotyping of the mouse brain with magnetic resonance histology. NeuroImage. 37 (1), 82-89 (2007).
  15. Herculano-Houzel, S., Mota, B., Lent, R. Cellular scaling rules for rodent brains. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (32), 12138-12143 (2006).
  16. Matsumoto, K., et al. Advanced CUBIC tissue clearing for whole-organ cell profiling. Nature Protocols. 14 (12), 3506-3537 (2019).
  17. Fürth, D., et al. An interactive framework for whole-brain maps at cellular resolution. Nature Neuroscience. 21 (1), 139-149 (2018).
  18. Chandrashekhar, V., et al. CloudReg: automatic terabyte-scale cross-modal brain volume registration. Nature Methods. 18 (8), 845-846 (2021).
  19. Krupa, O., et al. NuMorph: Tools for cortical cellular phenotyping in tissue-cleared whole-brain images. Cell Reports. 37 (2), 109802(2021).
  20. Petiet, A., Delatour, B., Dhenain, M. Models of neurodegenerative disease - Alzheimer's anatomical and amyloid plaque imaging. Methods in Molecular Biology. 771, 293-308 (2011).
  21. Jenkinson, M., Beckmann, C. F., Behrens, T. E. J., Woolrich, M. W., Smith, S. M. FSL. NeuroImage. 62, 782-790 (2012).
  22. Jenkinson, M., Bannister, P., Brady, M., Smith, S. Improved optimization for the robust and accurate linear registration and motion correction of brain images. NeuroImage. 17 (2), 825-841 (2002).
  23. Avants, B. B., Epstein, C. L., Grossman, M., Gee, J. C. Symmetric diffeomorphic image registration with cross-correlation: evaluating automated labeling of elderly and neurodegenerative brain. Medical Image Analysis. 12 (1), 26-41 (2008).
  24. iDISCO method. , Available from: https://idisco.info/ (2022).
  25. Ariel, P. UltraMicroscope II - A User Guide. University of North Carolina at Chapel Hill. , UniversityLibraries. Chapel Hill (NC). (2019).
  26. Anaconda Distribution - Anaconda documentation. , Available from: https://docs.anaconda.com/anaconda/ (2022).
  27. Peng, T., et al. A BaSiC tool for background and shading correction of optical microscopy images. Nature Communications. 8, 14836(2017).
  28. Klein, S., Staring, M., Murphy, K., Viergever, M. A., Pluim, J. P. W. elastix: a toolbox for intensity-based medical image registration. IEEE Transactions on Medical Imaging. 29, 196-205 (2010).
  29. Lowe, G. Sift-the scale invariant feature transform. International Journal. 2 (91-110), 2(2004).
  30. Young, D. M., et al. Whole-brain image analysis and anatomical atlas 3D generation using MagellanMapper. Current Protocols in Neuroscience. 94 (1), Editorial Board, Jacqueline N. Crawley ... [et al] 104(2020).
  31. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  32. Velíšek, L. Under the (Light) sheet after the iDISCO. Epilepsy Currents / American Epilepsy Society. 16 (6), 405-407 (2016).
  33. ITK-SNAP home. , Available from: http://www.itksnap/org/pmwiki/pmwiki.php (2022).
  34. Young, D. M., et al. Constructing and optimizing 3D atlases from 2D data with application to the developing mouse brain. eLife. 10, (2021).
  35. Yun, D. H., et al. Ultrafast immunostaining of organ-scale tissues for scalable proteomic phenotyping. bioRxiv. , (2019).
  36. Silvestri, L., et al. Universal autofocus for quantitative volumetric microscopy of whole mouse brains. Nature Methods. 18 (8), 953-958 (2021).
  37. Frasconi, P., et al. Large-scale automated identification of mouse brain cells in confocal light sheet microscopy images. Bioinformatics. 30 (17), 587(2014).
  38. Kruskal, J. B. On the shortest spanning subtree of a graph and the traveling salesman problem. Proceedings of the American Mathematical Society. American Mathematical Society. 7 (1), 48-50 (1956).
  39. Wang, Q., et al. The allen mouse brain common coordinate framework: A 3D reference atlas. Cell. 181, 936-953 (2020).
  40. Borland, D., et al. Segmentor: a tool for manual refinement of 3D microscopy annotations. BMC Bioinformatics. 22 (1), 260(2021).
  41. Kumar, A., et al. Dual-view plane illumination microscopy for rapid and spatially isotropic imaging. Nature Protocols. 9 (11), 2555-2573 (2014).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

MRI

相关文章