方法文章

结合3D磁力致动器和多功能荧光成像来研究细胞核力学生物学

DOI：

10.3791/64098

⸱

2022年7月5日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Mechanical and Aerospace Engineering, Herbert Wertheim College of Engineering, University of Florida, 2Department of Materials Science and Engineering, University of Florida, 3Department of Biostatistics, University of Florida, 4Department of Biomedical Engineering, College of Engineering (COE), University of Delaware (UD), 5UF Health Cancer Center, University of Florida, 6Department of Physics, College of Liberal Arts and Sciences, University of Florida, 7Department of Anatomy and Cell Biology, College of Medicine, University of Florida, 8J. Crayton Pruitt Family Department of Biomedical Engineering, University of Florida, 9Department of Physiology and Functional Genomics, University of Florida

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究提出了一种新的方案，通过传递到细胞质中的磁性微珠直接对细胞核施加机械力，并同时进行活细胞荧光成像。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

机械生物学的一个基本问题是活细胞如何在细胞生理学和病理学的背景下感知细胞外机械刺激。细胞外机械刺激的细胞机械感觉被认为是通过膜受体、相关的蛋白质复合物和细胞骨架。机械生物学的最新进展表明，细胞质本身的细胞核可以同时独立地感知机械刺激。然而，缺乏对细胞核如何感知、转导和响应机械刺激的机制理解，主要是因为通过传统工具访问和量化细胞核力学的技术挑战。本文描述了一种新型磁力致动器的设计、制造和实现，该致动器应用精确和非侵入性的 3D 机械刺激直接使细胞核变形。使用CRISPR / Cas9工程细胞，这项研究表明，该工具与高分辨率共聚焦荧光成像相结合，能够揭示单细胞中机械敏感yes相关蛋白（YAP）的实时动力学作为细胞核变形的函数。这种简单的方法有可能弥合机械生物学界当前的技术差距，并为细胞核机械转导与细胞功能之间关系中存在的知识差距提供答案。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究旨在通过将直接施加机械力的磁致动器和同时成像结构和功能亚细胞变化的共聚焦荧光显微镜相结合，开发和应用一种新技术来阐明细胞核力学生物学。细胞感知细胞外生物物理信号，包括组织硬度1，2，3，4、间质流体压力和剪切应力5、6、7、表面拓扑/几何形状8、9、10、11、12 和拉伸/压缩应力 13，14，15，16.生物物理信号被转化为生化信号，并触发基因表达和细胞行为的潜在下游变化 - 这一过程称为机械转导17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27.为了研究机械转导过程，已经开发了无数技术来对细胞施加机械力，例如原子力显微镜28，细胞拉伸装置29，bio-MEMS（微机电系统）力传感器15，30，31，剪切流变学32和立体视觉系统33.最近的一篇综述总结了应用细胞外机械线索和干扰机械传感的方法34。迄今为止，这些方法中的大多数都对细胞质膜施加力，细胞通过膜受体（如整合素、钙粘蛋白、离子通道和 G 蛋白偶联受体）直接接收这些细胞外生物物理信号。随后，它们将信号传输到细胞内细胞骨架和细胞核。例如，使用yes相关蛋白（YAP）易位作为机械传感的指标，显示细胞从细胞膜感知底物刚度和细胞外张力的机械信号，并通过细胞骨架将它们传递到细胞核中以诱导YAP细胞质到细胞核易位28，35。

最近的证据表明，细胞核本身是一个独立的机械传感器8，36，37。对从细胞中收获的分离细胞核进行的实验证明了这一点，其中发现细胞核响应直接施加在它们上的机械力而自适应地改变其刚度36。在许多生理条件下，肿瘤和健康细胞中的细胞核都能感知细胞外生物物理信号并改变其机械性能和组装38，39，40。例如，在外渗时，肿瘤细胞的核硬度降低并保持柔软度超过24小时38。在通过密闭间质空间迁移的过程中，肿瘤细胞的细胞核经常失去并恢复其结构完整性39。然而，细胞核感知生物物理信号的方式尚不清楚，尽管已发现涉及几种核包膜蛋白和蛋白质家族，例如核粘连蛋白A / C和核骨架和细胞骨架（LINC）复合物38，41的接头。因此，可以直接向细胞核施加力的新型非侵入性方法将使力传递的效果与细胞 - 质膜和细胞骨架解耦，并将有助于阐明以前无法进入的核机械传感分子机制。

使用光镊操纵细胞器42 和注射到细胞43 中的微珠的研究表明，直接对细胞核施加力的技术能力。然而，光学镊子技术有几个局限性:（1）低通量光学镊子通常一次只能操作一个细胞或微珠;（2）核的潜在光损伤和温度伪影变形需要数十pN36，相应的必要激光功率约为每pN10 mW 44，45。这样的激光强度足以在实验过程中触发细胞中的光损伤并扰乱细胞功能46。

通过活细胞内的微珠施加的磁力显示出直接对细胞核施加力的潜力，并克服了光镊的局限性。一旦微珠被输送到细胞质中，磁场就可以以高通量的方式同时对多个微珠施加磁力。磁场不影响细胞功能47，但产生从pN到nN的力，足以诱发核变形36，48，49。迄今为止，磁性微珠的操作已应用于细胞质膜48，细胞质50内部，F-肌动蛋白51，细胞核内47和分离的细胞核36。然而，微珠的磁操作从未被用于在核包膜上施加直接的机械力来研究原子核中的机械转导。

在本文中，开发了一种简单的技术，将磁性微珠无创地递送到细胞质中，并使用这些微珠在细胞核上施加机械力（图1）。在这里，使用CRISPR / Cas9工程的内源性表达mNeonGreen21-10/11标记的YAP的人正常B2B细胞系来验证该方法。YAP是一种机械敏感蛋白，YAP的易位受核机械传感14，28的调节。选择CRISPR / Cas9调控的敲入方法用荧光蛋白（FP）mNeonGreen21-10/11标记内源性YAP。尽管已知CRISPR编辑具有不完全效率和脱靶效应，但先前出版物中的协议集成了荧光分选以选择正确的开放阅读框插入52，53，54。通过这种额外的选择层，在先前产生的20+细胞系中未观察到脱靶标记事件52，53，54，55。这是一种分裂的荧光蛋白构建体，但原则上，任何可表达的荧光标签都可以使用。这种标记方法优于转基因或抗体方法。首先，与转基因表达不同，标记蛋白保持单拷贝基因剂量并在天然基因调控网络的生理背景下表达，从而限制了蛋白质浓度、定位和相互作用的偏差。本研究中使用的标记方法比全FP标记实现了超过数量级的吞吐量和效率。它还避免了由于固定伪影和高质量、高特异性抗体的可用性有限而导致的与免疫荧光相关的挑战。其次，本文中使用的方法对细胞生理学的干扰最小，并且能够真实地实时揭示所有内源性YAPs。相比之下，其他常见的转基因方法通常会导致YAP的过表达。由此产生的人工分布可能引起细胞毒性并影响细胞的机械传感56，57，58。

本研究提出了一种方案，通过传递到细胞质中的磁性微珠直接对细胞核施加力，并同时进行活细胞荧光成像。总之，这里介绍的方案演示了如何（1）在细胞核外将磁性微珠递送到细胞中，（2）操纵微珠以在细胞核上施加磁力，（3）在操作过程中对细胞进行共聚焦荧光成像，以及（4）在整个力施加过程中定量分析YAP核/细胞质（N / C）比率。结果表明:（1）通过内吞作用，磁性微珠可以在7 h内无创递送到B2B细胞的细胞质中（图2和图3）;（2）直接施加在细胞核上的量化磁力（图4，图5和图6）可以触发CRISPR / Cas9工程B2B细胞中YAP N / C比率的各种变化（图7和图8）。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 维持 CRISPR/Cas9 工程化的 B2B 细胞

  1. 在补充有10%胎牛血清和1%青霉素链霉素的RPMI-1640的T25烧瓶中培养B2B细胞。
  2. 将B2B细胞保持在37°C的加湿培养箱中，并含有5%CO2。
  3. 当汇合度达到70%至80%时传代培养B2B细胞。
  4. 将B2B细胞系储存在RPMI-1640培养基中，在-80°C冰箱中含有10%（v / v）DMSO。
  5. 在实验中使用传代数小于10的B2B细胞。

2. 细胞培养

  1. 将细胞接种到玻璃底培养皿上。
    1. 将包含B2B细胞的烧瓶从培养箱移动到生物安全柜。
    2. 使用连接真空泵的吸气移液管除去烧瓶中的培养基。
    3. 用 2 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 洗涤烧瓶。
    4. 使用吸液移液器取出PBS。
    5. 加入 0.5 mL 的 0.05% 胰蛋白酶溶液，使细胞从烧瓶底物底部分离。
    6. 将烧瓶放入培养箱中5分钟。
    7. 将烧瓶移至生物安全柜。将 5 mL 新培养基加入烧瓶中，上下移液。
    8. 将 50 μL 培养基与细胞（300 个细胞/μL）沉积到玻璃底培养皿上。将 2 mL 培养基加入培养皿中。
    9. 将培养皿放入培养箱中。等待12小时让细胞附着。
  2. 用磁性微珠培养细胞。
    1. 称取0.2克平均直径为7μm的羰基铁微珠（以下称为7μm微珠，参见 材料表）。
    2. 使用移液器将微珠悬浮在 1 mL RPMI-1640 培养基中。
    3. 将带有B2B细胞的培养皿带到生物安全柜。
    4. 将 200 μL 含有微珠的培养基加入培养皿中。
      注意:快速添加培养基以避免微珠沉淀。
    5. 将培养皿放回培养箱中，直到微珠被细胞内化。每6小时检查一次内化，以确定不同细胞系内化的最佳时间。
    6. 要检查内化，请执行共聚焦荧光成像以可视化微珠，细胞核和细胞边界。如果微珠被细胞内化，它将在细胞边界内。

3. 细胞核的可视化

  1. 在培养箱中加热1.5mL培养基15分钟。
  2. 关闭生物安全柜的灯。将含有细胞，加热培养基，核染色剂和盐酸维拉帕米的培养皿放入生物安全柜中。
    注意:核染色成分对光敏感。操作过程中避免暴露在光线下。
  3. 用DMSO将1000倍核染色稀释至100倍。
  4. 用DMSO稀释100mM盐酸维拉帕米至10mM。
  5. 将 15 μL 100x 核染色剂和 15 μL 10 mM 盐酸维拉帕米加入 1.5 mL 培养基中。通过上下移液充分混合。
  6. 从培养皿中取出培养基。将含有核染色的培养基加入培养皿中。
  7. 将细胞放回培养箱中超过2小时。

4.磁力应用硬件的准备

  1. 使用丙烯腈丁二烯苯乙烯（ABS）3D打印所有零件，并按照CAD设计进行组装（图1A）。CAD 设计包含在 材料表中。
  2. 使用双面胶带将磁铁连接到磁铁移动设备（图1A）。
  3. 将磁铁移动装置放在显微镜载物台旁边。使用三个旋钮调整磁铁的空间位置，直到它可以在 13 毫米到 120 毫米之间移动到培养皿上方。
    注意:确保磁铁和培养皿之间的距离上限尽可能大，以避免对磁性微珠施加不必要的力。120 mm是该实验设置中的最大值。确保磁体不会干扰显微镜部件，包括物镜和电动载物台。
  4. 将磁铁设置为最高 z 位置（120 毫米处）。

5. 力施加和活细胞成像

  1. 设置用于长期成像的环境室
    1. 应用75%乙醇溶液彻底消毒并清洁环境室。
    2. 将环境室放在倒置显微镜的电动载物台上。
    3. 打开 CO 2 罐并将CO 2 流入速率设置为 160 mL/min。
    4. 将腔室的温度调节到44°C（顶部），42°C（浴）和40°C（阶段）。
    5. 将 20 mL 纯净水加入环境室的浴中，以保持 90% 的湿度。
    6. 从组织培养箱中取出含有靶细胞的玻璃底培养皿并将其放入腔室中。
    7. 应用环境室的金属夹固定培养皿位置。
      注意:培养皿必须紧紧夹在腔室中，因为如果不夹紧，磁力可能会移动培养皿。
    8. 合上腔室的盖子。
  2. 优化成像参数
    1. 优化针孔尺寸:针孔阻挡失焦光子。较大的针孔尺寸会产生更多的失焦光子，但图像更亮。针孔尺寸越小，图像越集中、越暗。确保优化针孔尺寸，以获得具有适当信噪比的对焦共聚焦图像。
    2. 优化激光强度:激光强度决定了激发的强度，从而决定了发射光。低激光强度产生低信噪比。激光强度过高会导致光漂白。相应地调整激光强度。
    3. 优化步长和步长:步长和步长决定了 Z 堆栈中将拍摄的图像数量。更小的步长和更多的步长将提高Z-stack分辨率，但也会增加光漂白。在该实验中，对于具有~15μm细胞高度的细胞使用1μm步长。
    4. 优化曝光时间:曝光时间决定了细胞将暴露在激发激光下的时间。低曝光时间会降低信噪比。高曝光时间会导致光漂白。本实验使用每4秒1帧的曝光时间。
    5. 优化成像参数:迭代更改四个参数之一，保持其他参数一致。每次，测量每个图像的YAPN / C比率并比较YAPN / C比率变化以确定光漂白水平。重复优化过程，直到在信噪比、成像速度和光漂白之间取得平衡。
    6. 使用优化的成像参数定义成像配置，以便在实验过程中更快地进行成像设置。
      注意:本研究中使用的配置在成像参数的第5.3节中描述。要优化第 5.3 节中配置的成像参数，请使用与步骤 5.2.5 中相同的方法。
  3. 小力施加和共聚焦成像
    注意:本研究使用尼康Ti2-E显微镜进行成像，图像采集的详细步骤如下。
    1. 打开倒置显微镜。打开软件应用程序 元素。
    2. 定义配置 magnetic_find。仅检查 FITC 频道。设置 PMT HV = 70，偏移 = 0，激光强度 = 10。通过单击 1/2 按钮将扫描速度设置为每 2 秒 1 帧。通过单击 1.2 A.U . 按钮将针孔大小设置为 1.2 AU。此配置将在步骤 5.3.5 中使用。
    3. 定义配置 magnetic_YAP_Nucleus。检查 FITC 频道。设置 PMT HV = 70，偏移 = 0，激光强度 = 10。通过单击1 /2 按钮将扫描速度设置为每4秒1帧。通过单击 1.2 A.U . 按钮将针孔大小设置为 1.2 AU。要对细胞核边界和核染色强度进行成像，请检查 Cy5 通道。设置 PMT HV = 70，偏移 = 0，激光强度 = 10。针孔尺寸针对 3D YAP 成像进行了优化。检查 Cy5 通道后，请勿再次单击 1.2 A.U. 按钮。此配置将在步骤 5.3.7 中使用。
    4. 如有必要，通过元素打开 DIA。打开 SpinView，使用明场，并调整对象的焦点以获得清晰的细胞聚焦图像。使用10倍物镜在三种条件下找到合适的多个单细胞:内部单个微珠，内部有多个微珠，内部没有任何微珠。切换到 40 倍物镜。使用适当的职位编号命名此职位。
    5. 打开 元素。单击 magnetic_find。单击 移除联锁 按钮。
    6. 单击扫描并调整焦平面的 Z 位置。单击顶部和底部按钮以设置所选单元格的 Z 堆栈的下限和上限。再次单击扫描停止扫描。
    7. 切换到 magnetic_YAP_Nucleus 配置。将文件名设置为 before_small_force.nd2。单击带有记录的 Z 堆栈的 运行 按钮。
    8. 切换到正确的光路并打开 DIA。打开 旋转视图 ，然后单击 录制 按钮。同时，旋转磁铁移动装置的旋钮，将磁铁向下移动到培养皿底部上方 46 毫米。保存明场图像序列或视频。检查视频以确认微珠显示由磁力引起的位移。
    9. 重复步骤5.3.5-5.3.7;将文件名设置为 after_small_force.nd2。
    10. 切换到正确的光路并打开 DIA。接下来，打开 旋转视图 然后点击 记录 按钮。同时，旋转磁铁移动装置的旋钮，将磁铁移动到培养皿底部上方 120 毫米处。保存明场图像序列或视频。
    11. 重复步骤 5.3.5-5.3.7，并将文件名设置为 before_large_force.nd2。
  4. 大力施加和共聚焦成像
    1. 取下环境室的盖子，使磁铁到达培养皿底部上方13毫米。
    2. 切换到正确的光路并打开 DIA。打开 旋转视图 ，然后单击 录制 按钮。同时，旋转磁铁移动装置的旋钮，将磁铁向下移动到培养皿底部上方 13 毫米。保存明场图像序列或视频。检查视频以确认微珠显示由磁力引起的位移。
    3. 重复步骤 5.3.5-5.3.7，并将文件名设置为 after_large_force.nd2。
    4. 切换到正确的光路并打开 DIA。接下来，打开 旋转视图 然后点击 记录 按钮。同时，旋转磁铁移动装置的旋钮，将磁铁移动到培养皿底部上方 120 毫米处。保存明场图像序列或视频。
    5. 重复步骤5.3.5-5.3.7;将文件名设置为 retract_large_force.nd2。
    6. 关闭环境室的盖子。
  5. 对多个视图区域重复步骤 5.2 和 5.3，以在需要时获取更多数据。

6. 图像处理和数据分析

  1. YAP氮/碳比的量化
    1. 打开 斐济图片J.打开在步骤 5 中拍摄的 .nd2 图像。
    2. 单击 分析 > 设置测量值。检查 面积、 积分密度、 平均灰度值和 形状描述符。
    3. 使用 Cy5 通道识别细胞核。单击" 手绘 选择"以使用自由选择工具勾勒出细胞核的轮廓。另外，检查 ImageJ 中的自动核掩模宏（请参阅 材料表）。
    4. 单击 FITC 通道中的分析>度量。平均值的测量值是平均核YAP强度DN。
    5. 使用 Cy5 通道识别细胞核。使用 FITC 通道识别小区。单击 手绘 选择以使用自由选择工具选择细胞质内的感兴趣区域并避开磁性微珠。这个感兴趣的区域不得包括细胞核。
    6. 单击 FITC 通道中的分析>度量。平均值的测量值是平均细胞质YAP强度DC。
    7. 计算 YAP N/C 比率 = D N / DC。
  2. 核形状和归一化核染色强度的量化
    1. 打开 斐济图片J.打开在步骤 5 中拍摄的 .nd2 图像。
    2. 单击 分析 > 设置测量值。检查 面积、 积分密度、 平均灰度值和 形状描述符。
    3. 使用 Cy5 通道识别细胞核。单击" 手绘 选择"以使用自由选择工具勾勒出细胞核的轮廓。
    4. 单击在 Cy5 通道中 分析 > 测量 。 平均值 的测量值是核染色强度。 Circ的测量值。是核循环性。
    5. 为了比较不同力状态下的核染色强度，将所有核染色强度除以"before_small_force.nd2"中的核染色强度，以生成归一化核染色强度。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

磁力移动装置的设计及磁力的应用
为了通过磁微珠对原子核施加力，设计并建造了一个磁铁移动装置来控制磁铁的空间位置。磁铁移动设备包含一个中央框架、三个旋钮和导轨，用于以每个周期 1.59 mm 的空间分辨率在 x、y 和 z 方向上独立移动连接的磁铁（图 1A）。一旦磁体靠近输送到细胞中的7μm微珠（图1B），它就会磁力吸引微珠并在细胞核上施加力（图1C）。力的方向和大小由磁铁和微珠之间的相对位置控制。

在本文中，对微珠施加了两种不同大小的力:（1）当磁铁放置在电池上方46 mm处时，力相对较小;（2）当磁铁放置在电池上方13毫米处时，力相对较大。施加在微珠F上的磁力可以通过公式59计算:

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

磁性微珠的内化（第2.2节）至关重要，因为细胞外微珠不能直接对细胞核施加力。力施加和成像（第5.3节）是本实验中的关键步骤，使细胞核变形并引起有意义的生物学后果所需的力可能取决于样品。该实验中的力大小（0.8 nN和1.4 nN）可以进一步增加，以触发不太敏感的细胞中的核机械传感。

为了以高通量定量方式施加磁力，单个微珠的内化是一种理想的方法。在这项研究中，具有单个微珠内化的细胞百分比在12小时（26%）和24小时（28%）相似，而没有微珠内化的细胞在12小时（53%）高于24小时（20%）（图3B）。认为12 h是施力实验的最佳时间，因为可以包含更多的单个微珠，并且可以控制细胞。对于不同的细胞系和微珠大小，应测试共培养时间和微珠浓度，以确定相应的最佳条件。

在实验中，微珠没有被涂覆以特异性地与细胞核结合。因此，从微珠直接传递到原子核的力可能只是压缩的。结果表明，YAPN / C比率增加和减少细胞群（图8A）...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

没有需要声明的利益冲突。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

该项目由UF佳得乐奖启动包（X.T.），UFHCC飞行员奖（X.T.和Dietmar Siemann博士），UF机会种子基金（X.T.）和UFHCC大学学者计划（H.Y.Wang）资助。我们衷心感谢Jonathan Licht博士（UFHCC），Rolf Renne博士（UFHCC），Christopher Vulpe博士（UFHCC），Blanka Sharma博士（BME），Mark Sheplak博士（MAE和ECE），Daniel Ferris博士（BME），Malisa Sarntinoranont博士（MAE），Ashok Kumar博士（MAE），Benjamin Keselowsky博士（BME），Brent Gila博士（RSC），Philip Feng博士（ECE）的智力讨论和技术支持， Gregory A. Hudalla博士（BME），Steven Ghivizzani博士（OSSM），Yenisel Cruz-Almeida博士（CDBS），Roger Fillingim博士（CD-BS），Robert Caudle博士（OMS），John Neubert博士（DN-OR），Justin Hiliard博士（神经外科），田和博士（哈佛大学），谭友华博士（香港理工大学），Jessie L-S Au博士（定量系统药理学研究所），David Hahn博士（亚利桑那大学）， 尼康支持团队（Jose Serrano-Velez博士、Larry Kordon博士和Jon Ekman博士）。我们非常感谢Tang's，Yamaguchi's，Sharma's，Au's，Siemann's和Guan研究实验室的所有成员以及UF MAE部门的所有工作人员的有效支持。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.05% 胰蛋白酶康宁25-051-CI
25 cm2 培养瓶康宁156340
7-&微量;m 平均直径羰基铁微珠N/AN/A
A1R 共聚焦系统尼康
羰基铁粉 CMBASF30042253磁性微珠
培养基 （RPMI-1640）Gibco11875093
台式电脑Windows 10作系统戴尔
环境室 TIZBTokai HitTIZB
胎牛血清 （FBS）Gibco26140
斐济 ImageJ美国国立卫生研究院和光学与计算仪器
底培养皿MatTekP35G-1.5-14-C
磁铁K&J Magnetics， Inc. 公司D99-N52
单色 相机FLIRBFS-U3-70S7M-C
NIS-Elements 软件平台尼康软件平台
Nucleus 面罩 ImageJ 宏https://github.com/KOLIUG/Nuclear 面罩
NucSpot Live 650Biotium#40082核染色
青霉素-链霉素Gibco15140122
磷酸盐缓冲盐水 （PBS）Gibco10010023
Ti2-E 倒置显微镜尼康
XYZ 移动器（CAD 文件）https://github.com/KOLIUG/XYZ-mover
配备 的实验室玻璃

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
  2. Janmey, P. A., Fletcher, D. A., Reinhart-King, C. A. Stiffness sensing by cells. Physiological Reviews. 100 (2), 695-724 (2020).
  3. Bajaj, P., Tang, X., Saif, T. A., Bashir, R. Stiffness of the substrate influences the phenotype of embryonic chicken cardiac myocytes. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 95 (4), 1261-1269 (2020).
  4. Tang, X., et al. Mechanical force affects expression of an in vitro metastasis-like phenotype in HCT-8 cells. Biophysical Journal. 99 (8), 2460-2469 (2010).
  5. Hofmann, M., et al. Lowering of tumor interstitial fluid pressure reduces tumor cell proliferation in a xenograft tumor model. Neoplasia. 8 (2), 89-95 (2006).
  6. Yankaskas, C. L., et al. The fluid shear stress sensor TRPM7 regulates tumor cell intravasation. Science Advances. 7 (28), (2021).
  7. Kim, E., et al. A biosynthetic hybrid spidroin-amyloid-mussel foot protein for underwater adhesion on diverse surfaces. ACS Applied Materials and Interfaces. 13 (41), 48457-48468 (2021).
  8. Tajik, A., et al. Transcription upregulation via force-induced direct stretching of chromatin. Nature Materials. 15 (12), 1287-1296 (2016).
  9. Lee, J., Abdeen, A. A., Tang, X., Saif, T. A., Kilian, K. A. Matrix directed adipogenesis and neurogenesis of mesenchymal stem cells derived from adipose tissue and bone marrow. Acta Biomaterialia. 42, 46-55 (2016).
  10. Lee, J., Abdeen, A. A., Tang, X., Saif, T. A., Kilian, K. A. Geometric guidance of integrin mediated traction stress during stem cell differentiation. Biomaterials. 69, 174-183 (2015).
  11. Ren, B., et al. Study of sacrificial ink-assisted embedded printing for 3D perfusable channel creation for biomedical applications. Applied Physics Reviews. 9 (1), 011408(2022).
  12. Coyle, S., et al. Cell alignment modulated by surface nano-topography-Roles of cell-matrix and cell-cell interactions. Acta Biomaterialia. 142, 149-159 (2022).
  13. Sawada, Y., et al. Force sensing by mechanical extension of the Src family kinase substrate p130Cas. Cell. 127 (5), 1015-1026 (2006).
  14. Aragona, M., et al. A mechanical checkpoint controls multicellular growth through YAP/TAZ regulation by actin-processing factors. Cell. 154 (5), 1047-1059 (2013).
  15. Tang, X., et al. Specific and non-specific adhesion in cancer cells with various metastatic potentials. Mechanobiology of Cell-Cell and Cell-Matrix Interactions. , Springer. Boston, MA. 105-122 (2011).
  16. Tang, X., Saif, T. A. Adhesivity of colon cancer cells during in vitro metastasis. International Journal of Applied Mechanics. 5 (03), 1350025(2013).
  17. Chaudhuri, O., et al. Effects of extracellular matrix viscoelasticity on cellular behaviour. Nature. 584 (7822), 535-546 (2020).
  18. Ohashi, K., Fujiwara, S., Mizuno, K. Roles of the cytoskeleton, cell adhesion and rho signalling in mechanosensing and mechanotransduction. The Journal of Biochemistry. 161 (3), 245-254 (2017).
  19. Hamill, O. P., Martinac, B. Molecular basis of mechanotransduction in living cells. Physiological Reviews. 81 (2), 685-740 (2001).
  20. Liang, C., et al. Towards an integrative understanding of cancer mechanobiology: Calcium, YAP, and microRNA under biophysical Forces. Soft Matter. 18, 1112-1148 (2022).
  21. Tan, Y., et al. Matrix softness regulates plasticity of tumour-repopulating cells via H3K9 demethylation and Sox2 expression. Nature Communications. 5 (1), 1-12 (2014).
  22. Poh, Y., et al. Dynamic force-induced direct dissociation of protein complexes in a nuclear body in living cells. Nature Communications. 3 (1), 1-10 (2012).
  23. Tang, X., et al. A mechanically-induced colon cancer cell population shows increased metastatic potential. Molecular Cancer. 13 (1), 1-15 (2014).
  24. Wu, J., et al. Effects of dynein on microtubule mechanics and centrosome positioning. Molecular Biology of the Cell. 22 (24), 4834-4841 (2011).
  25. Tang, X., Ali, M. Y., Saif, M. T. A novel technique for micro-patterning proteins and cells on polyacrylamide gels. Soft Matter. 8 (27), 7197-7206 (2011).
  26. Tang, X., Bajaj, P., Bashir, R., Saif, T. A. How far cardiac cells can see each other mechanically. Soft Matter. 7 (13), 6151-6158 (2011).
  27. Tang, X., et al. Mechanical force affects expression of an in vitro metastasis-like phenotype in HCT-8 cells. Biophysical Journal. 99 (8), 2460-2469 (2010).
  28. Elosegui-Artola, A., et al. Force triggers YAP nuclear entry by regulating transport across nuclear pores. Cell. 171 (6), 1397-1410 (2017).
  29. Gudipaty, S. A., et al. Mechanical stretch triggers rapid epithelial cell division through Piezo1. Nature. 543 (7643), 118-121 (2017).
  30. Tang, X., et al. Attenuation of cell mechanosensitivity in colon cancer cells during in vitro metastasis. PLoS One. 7 (11), 50443(2012).
  31. Cha, C., et al. Top-down synthesis of versatile polyaspartamide linkers for single-step protein conjugation to materials. Bioconjugate Chemistry. 22 (12), 2377-2382 (2012).
  32. Chen, X., et al. Glycosaminoglycans modulate long-range mechanical communication between cells in collagen networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (15), (2022).
  33. Boyle, J. J., Pless, R. B., Thomopoulos, S., Genin, G. M. Direct estimation of surface strain fields from a stereo vision system. Journal of Biomechanical Engineering. 142 (7), 074503(2020).
  34. Kim, S., Uroz, M., Bays, J. L., Chen, C. S. Harnessing mechanobiology for tissue engineering. Developmental Cell. 56 (2), 180-191 (2021).
  35. Driscoll, T. P., et al. Cytoskeletal to nuclear strain transfer regulates YAP signaling in mesenchymal stem cells. Biophysical Journal. 108 (12), 2783-2793 (2015).
  36. Guilluy, C., et al. Isolated nuclei adapt to force and reveal a mechanotransduction pathway in the nucleus. Nature Cell Biology. 16 (4), 376-381 (2014).
  37. Vashisth, M. Scaling concepts in 'omics: Nuclear lamin-B scales with tumor growth and often predicts poor prognosis, unlike fibrosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (48), (2021).
  38. Roberts, A. B., et al. Tumor cell nuclei soften during transendothelial migration. Journal of Biomechanics. 121, 110400(2021).
  39. Denais, C. M., et al. Nuclear envelope rupture and repair during cancer cell migration. Science. 352 (6283), 353-358 (2016).
  40. Raab, M., et al. ESCRT III repairs nuclear envelope ruptures during cell migration to limit DNA damage and cell death. Science. 352 (6283), 359-362 (2016).
  41. Lammerding, J., et al. Lamin A/C deficiency causes defective nuclear mechanics and mechanotransduction. The Journal of Clinical Investigation. 113 (3), 370-378 (2004).
  42. Shelby, J., Patrick, J., Edgar, S., Chiu, D. T. Monitoring cell survival after extraction of a single subcellular organelle using optical trapping and pulsed-nitrogen laser ablation. Photochemistry and Photobiology. 81 (4), 994-1001 (2005).
  43. Caspi, A., Granek, R., Elbaum, M. Diffusion and directed motion in cellular transport. Physical Review E. 66 (1), 011916(2002).
  44. Svoboda, K., Block, S. M. Biological applications of optical forces. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 23 (1), 247-285 (1994).
  45. Rohrbach, A. Stiffness of optical traps: quantitative agreement between experiment and electromagnetic theory. Physical Review Letters. 95 (16), 168102(2005).
  46. Neuman, K. C., et al. Characterization of photodamage to Escherichia coli in optical traps. Biophysical Journal. 77 (5), 2856-2863 (1999).
  47. Kanger, J. S., Subramaniam, V., Driel, R. V. Intracellular manipulation of chromatin using magnetic microbeads. Chromosome Research. 16 (3), 511-522 (2008).
  48. Bausch, A. R., et al. Local measurements of viscoelastic parameters of adherent cell surfaces by magnetic microbead microrheometry. Biophysical Journal. 75 (4), 2038-2049 (1998).
  49. Fisher, J. K., et al. Three-dimensional force microscope: a nanometric optical tracking and magnetic manipulation system for the biomedical sciences. Review of Scientific Instruments. 76 (5), 053711(2005).
  50. Berret, J. -F. Local viscoelasticity of living cells measured by rotational magnetic spectroscopy. Nature Communications. 7, 10134(2016).
  51. Hu, B., Dobson, J., El Haj, A. J. Control of smooth muscle α-actin (SMA) up-regulation in HBMSCs using remote magnetic microbead mechano-activation. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 10 (1), 45-55 (2014).
  52. Kamiyama, D., et al. Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein. Nature Communications. 7, 11046(2016).
  53. Feng, S., et al. Improved split fluorescent proteins for endogenous protein labeling. Nature Communications. 8, 370(2017).
  54. Leonetti, M. D., Sekine, S., Kamiyama, D., Weissman, J. S., Huang, B. A scalable strategy for high-throughput GFP tagging of endogenous human proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (25), 3501-3508 (2016).
  55. Tulpule, A., et al. Kinase-mediated RAS signaling via membraneless cytoplasmic protein granules. Cell. 184 (10), 2649-2664 (2021).
  56. Ansari, A. M., et al. Cellular GFP toxicity and immunogenicity: potential confounders in in vivo cell tracking experiments. Stem Cell Reviews and Reports. 12 (5), 553-559 (2016).
  57. Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. The transience of transient overexpression. Nature Methods. 10 (8), 715-721 (2013).
  58. Ratz, M., et al. CRISPR/Cas9-mediated endogenous protein tagging for RESOLFT super-resolution microscopy of living human cells. Scientific Reports. 5, 9592(2015).
  59. Suzuki, H., Ho, C., Kasagi, N. A chaotic mixer for magnetic microbead-based micro cell sorter. Journal of Microelectromechanical Systems. 13 (5), 779-790 (2004).
  60. Luo, Q., et al. All-optical mechanobiology interrogation of yes-associated protein in human cancer and normal cells using a multi-functional system. Journal of Visualized Experiments. (178), e62934(2021).
  61. Koushki, N., et al. Lamin A redistribution mediated by nuclear deformation determines dynamic localization of YAP. BioRxiv. , (2020).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

Nucleus MechanobiologyMagnetic Force ActuatorFluorescence ImagingConfocal MicroscopyNuclear MechanosensingYAP TranslocationMagnetic MicrobeadsNucleus DeformationCytoskeleton MechanicsLive Cell Imaging

相关文章