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方法文章

结合三维磁力驱动装置与多功能荧光成像技术研究细胞核力学生物学

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DOI：

10.3791/64098

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2022年7月5日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Mechanical and Aerospace Engineering, Herbert Wertheim College of Engineering, University of Florida, 2Department of Materials Science and Engineering, University of Florida, 3Department of Biostatistics, University of Florida, 4Department of Biomedical Engineering, College of Engineering (COE), University of Delaware (UD), 5UF Health Cancer Center, University of Florida, 6Department of Physics, College of Liberal Arts and Sciences, University of Florida, 7Department of Anatomy and Cell Biology, College of Medicine, University of Florida, 8J. Crayton Pruitt Family Department of Biomedical Engineering, University of Florida, 9Department of Physiology and Functional Genomics, University of Florida

本文内容

摘要

本研究提出了一种新方案，通过将磁性微珠递送至细胞质，直接对细胞核施加机械力，同时进行活细胞荧光成像。

摘要

机械生物学中的一个基本问题是，在细胞生理学和病理学背景下，活细胞如何感知细胞外的机械刺激。人们认为，细胞对外部机械刺激的机械感知是通过膜受体、相关蛋白复合物以及细胞骨架实现的。机械生物学的最新进展表明，位于细胞质中的细胞核本身也能够独立地同时感知机械刺激。然而，目前对于细胞核如何感知、转导并响应机械刺激的机制仍缺乏深入理解，这主要归因于传统工具在获取和量化细胞核力学特性方面面临的技术挑战。本文介绍了一种新型磁力驱动装置的设计、制备与应用，该装置可施加精确且非侵入性的三维机械刺激，直接形变细胞核。通过使用CRISPR/Cas9基因编辑细胞，本研究证明，该工具结合高分辨率共聚焦荧光成像技术，能够揭示单个细胞中机械敏感性YAP蛋白（yes-associated protein）随细胞核形变而变化的实时动态过程。这一简单方法有望填补当前机械生物学领域中的技术空白，并为解决细胞核力信号转导与细胞功能之间关系的知识缺口提供答案。

引言

本研究旨在通过结合直接对细胞核施加机械力的磁性驱动装置与可同时成像细胞亚微结构及功能变化的共聚焦荧光显微技术，开发并应用一种新方法以阐明细胞核的力学生物学机制。细胞可感知包括组织硬度在内的胞外生物物理信号1,2,3,4，组织液压力和剪切应力5,6,7表面拓扑/几何结构8,9,10,11,12，以及拉伸/压缩应力13,14,15,16生物物理信号被转化为生化信号，并触发基因表达和细胞行为潜在的下游变化，这一过程称为机械转导。17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27为了研究机械转导过程，已开发出多种技术用于对细胞施加机械力，例如原子力显微镜28细胞拉伸装置29生物微机电系统（micro-electromechanical systems）力传感器15,30,31，剪切流变学32，以及立体视觉系统33最近的一篇综述总结了施加细胞外机械信号并干扰机械感知的多种方法。34迄今为止，大多数这些方法都是将力施加于细胞质膜，使细胞直接接收这些细胞外的生物物理信号 通过 膜受体如整合素、钙黏蛋白、离子通道和G蛋白偶联受体。随后，它们将信号传递至细胞内细胞骨架和细胞核。例如，以YAP（yes相关蛋白）的转位作为机械感知的指标，研究表明细胞能够感知来自细胞膜的基底刚度和细胞外张力等机械信号，并通过细胞骨架将这些信号传递至细胞核，从而诱导YAP从细胞质向细胞核的转位28,35.

最近的证据表明，细胞核本身是一个独立的机械感受器8,36,37。这一结论由对从细胞中分离出的细胞核所进行的实验证实，研究发现，当直接对细胞核施加机械力时，细胞核会自适应地改变其刚度36。在多种生理条件下，肿瘤细胞和正常细胞中的细胞核均可感知细胞外的生物物理信号，并改变其力学特性与结构组装38,39,40。例如，在细胞外渗过程中，肿瘤细胞的核刚度降低，并在24小时以上维持较软状态38。在穿越受限的间质空间迁移过程中，肿瘤细胞的细胞核常出现结构完整性的丧失与恢复39。然而，细胞核感知生物物理信号的具体机制尚不清楚，尽管已有研究发现若干核膜蛋白及蛋白家族参与其中，如Lamin A/C以及连接核骨架与细胞骨架的LINC复合物（linker of nucleoskeleton and cytoskeleton, LINC）38,41。因此，开发新型的非侵入性方法，能够直接对细胞核施加力学作用，将有助于分离细胞质膜和细胞骨架在力传导中的影响，从而揭示此前难以触及的细胞核机械感知分子机制。

利用光镊操控细胞器42以及向细胞内注射的微珠43的研究表明，该技术具备直接对细胞核施加作用力的能力。然而，光镊技术存在若干局限性：（1）通量较低——光镊通常一次只能操控一个细胞或一个微珠；（2）潜在的光损伤和温度伪影——使细胞核发生形变需要数十皮牛（pN）的力36，而相应的所需激光功率约为每皮牛10毫瓦（mW）44,45。如此高强度的激光足以在实验过程中引发细胞的光损伤，并干扰细胞的正常功能46。

通过将微珠引入活细胞内部施加磁力，可直接对细胞核施加作用力，克服了光镊技术的局限性。一旦微珠被递送至细胞质中，磁场便能以高通量的方式同时对多个微珠施加磁力。磁场不会影响细胞功能47 ，但可产生从皮牛顿（pN）到纳牛顿（nN）范围的力，足以诱导细胞核形变36,48,49 。迄今为止，磁性微珠的操作已应用于细胞质膜48、细胞质内部50、F-肌动蛋白51、细胞核内部47以及分离的细胞核36。然而，尚未有研究利用磁性操控微珠对核膜施加直接的机械力，以研究细胞核内的力传导机制。

本文开发了一种简单的方法，可无创地将磁性微珠递送至细胞质中，并利用这些微珠对细胞核施加机械力（图1）。此处使用经CRISPR/Cas9基因编辑的人源正常B2B细胞系，该细胞系内源性表达mNeonGreen21-10/11标记的YAP蛋白，用于验证该方法。YAP是一种机械敏感性蛋白，其转位受细胞核机械感知的调控14,28。本研究采用CRISPR/Cas9介导的基因敲入策略，将荧光蛋白（FP）mNeonGreen21-10/11标记于内源性YAP蛋白上。尽管已知CRISPR编辑存在效率不完全及脱靶效应的问题，但先前发表的方案中整合了荧光分选步骤，以筛选正确开放阅读框插入的细胞52,53,54。通过这一额外筛选层，在此前构建的20多个细胞系中均未观察到脱靶标记事件52,53,54,55。该系统采用分裂型荧光蛋白构建，但原则上任何可表达的荧光标签均可适用。这种标记方法优于转基因或抗体检测方法。首先，与转基因表达不同，标记蛋白保持单拷贝基因剂量，并在天然基因调控网络的生理背景下表达，从而限制了蛋白浓度、定位和相互作用的偏差。本研究所用的标记方法在通量和效率上比完整荧光蛋白标记高出一个数量级以上。同时，该方法避免了免疫荧光技术中存在的固定假象以及高质量、高特异性抗体资源有限的问题。其次，本文所采用的方法对细胞生理状态干扰最小，能够真实、实时地揭示所有内源性YAP蛋白的动态行为。相比之下，其他常见的转基因方法常导致YAP蛋白过表达，由此产生的非生理性分布可能引发细胞毒性，并影响细胞的机械感知能力56,57,58。

本研究介绍了一种通过将磁性微珠递送至细胞质并直接对细胞核施加力学力，同时进行活细胞荧光成像的实验方案。简而言之，本文所述方案展示了如何（1）将磁性微珠非侵入性地递送至细胞核外的细胞质内，（2）操控微珠以对细胞核施加磁力，（3）在操控过程中进行共聚焦荧光成像，以及（4）在施力全过程定量分析YAP的核/胞质（N/C）比值。结果表明：（1）通过内吞作用，可在7小时内将磁性微珠非侵入性地递送至B2B细胞的细胞质中图2 和 图3）；以及（2）直接作用于细胞核的量化磁力（图4, 图5，以及 图6) 单独即可在CRISPR/Cas9基因编辑的B2B细胞中引发YAP核质比的多种变化图7 和 图8).

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方案

1. CRISPR/Cas9 基因编辑 B2B 细胞的维持

  1. 将B2B细胞接种于T25培养瓶中，使用含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的RPMI-1640培养基进行培养。
  2. 将B2B细胞置于37 °C、含5% CO2的湿润化培养箱中维持培养。
  3. 当细胞融合度达到70%至80%时，对B2B细胞进行传代培养。
  4. 将B2B细胞系保存于含有10% (v/v) DMSO的RPMI-1640培养基中，并置于-80 °C冰箱中储存。
  5. 实验中使用的B2B细胞传代次数应少于10代。

2. 细胞培养

  1. 将细胞接种到玻璃底培养皿中。
    1. 将装有 B2B 细胞的培养瓶从培养箱转移至生物安全柜中。
    2. 使用连接真空泵的吸液枪吸除培养瓶中的培养基。
    3. 用 2 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）清洗培养瓶。 
    4. 使用吸液枪吸除 PBS。
    5. 加入 0.5 mL 0.05% 胰蛋白酶溶液，使细胞从培养瓶底部脱离。
    6. 将培养瓶放入培养箱中孵育 5 分钟。
    7. 将培养瓶移回生物安全柜，向瓶中加入 5 mL 新鲜培养基，并用移液器反复吹打混匀。
    8. 取 50 µL 含细胞的培养基（300 个细胞/µL）加入玻璃底培养皿中，再向培养皿中加入 2 mL 培养基。
    9. 将培养皿放入培养箱中，静置 12 小时，使细胞贴壁。
  2. 用磁性微珠培养细胞。
    1. 称取 0.2 g 平均直径为 7 µm 的羰基铁微珠（以下简称 7 µm 微珠，参见材料表）。
    2. 用移液器将微珠悬浮于 1 mL RPMI-1640 培养基中。
    3. 将含有 B2B 细胞的培养皿移至生物安全柜中。
    4. 向培养皿中加入 200 µL 含微珠的培养基。
      注意：应快速加入培养基，以避免微珠沉淀。
    5. 将培养皿放回培养箱，直至细胞完全内吞微珠。每 6 小时检查一次内吞情况，以确定不同细胞系的最佳内吞时间。
    6. 为检测内吞情况，进行共聚焦荧光成像，以观察微珠、细胞核及细胞边界。若微珠被细胞内吞，则其将位于细胞边界之内。

3. 细胞核的可视化

  1. 将 1.5 mL 培养基置于培养箱中预热 15 分钟。
  2. 关闭生物安全柜的照明灯。将含有细胞、预热的培养基、核染料和盐酸维拉帕米的培养皿放入生物安全柜中。
    注意：核染料组分对光敏感。操作过程中应避免光照。
  3. 用 DMSO 将 1000 倍浓缩的核染料稀释至 100 倍。
  4. 用 DMSO 将 100 mM 盐酸维拉帕米稀释至 10 mM。
  5. 向 1.5 mL 培养基中加入 15 µL 100 倍核染料和 15 µL 10 mM 盐酸维拉帕米。通过反复吹打充分混匀。
  6. 从培养皿中移除原有培养基。加入含有核染料的培养基至培养皿中。
  7. 将细胞放回培养箱中孵育超过 2 小时。

4. 磁力施加装置的准备

  1. 使用丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物（ABS）3D打印所有部件，并根据CAD设计进行组装图1A）。CAD设计包含在其中 材料表.
  2. 使用双面胶带将磁铁固定在磁铁移动装置上（图1A).
  3. 将磁铁移动装置放置在显微镜载物台旁边。使用三个旋钮调节磁铁的空间位置，直至其可在培养皿上方13 mm至120 mm范围内移动。
    注意：确保磁铁与培养皿之间的距离上限尽可能大，以避免对磁性微珠施加不必要的作用力。在此实验装置中，最大距离为120 mm。需确保磁铁不会干扰显微镜部件，包括物镜和电动载物台。
  4. 将磁体设置到最高的 z 位置（120 mm 处）。

5. 力的施加与活细胞成像

  1. 长期成像用环境培养箱的设置
    1. 使用75%乙醇溶液彻底灭菌并清洁环境培养箱。
    2. 将环境培养箱放置于倒置显微镜的电动载物台上。
    3. 打开CO2气罐，将CO2流入速率设定为160 mL/min。
    4. 调节培养箱温度至44 °C（顶部）、42 °C（浴槽）和40 °C（载物台）。
    5. 向环境培养箱的浴槽中加入20 mL纯化水，以维持90%的湿度。
    6. 从组织培养孵育箱中取出含有目标细胞的玻璃底培养皿，并将其放入培养箱中。
    7. 使用环境培养箱的金属夹固定培养皿位置。
      注意：必须将培养皿在培养箱内夹紧，因为若未夹紧，磁力可能导致培养皿移动。
    8. 关闭培养箱盖。 
  2. 成像参数的优化
    1. 优化针孔尺寸：针孔可阻挡离焦光子。较大的针孔尺寸会引入更多离焦光子，但图像更亮；较小的针孔尺寸则产生更聚焦但更暗的图像。需优化针孔尺寸，以获得具有适当信噪比的聚焦共聚焦图像。
    2. 优化激光强度：激光强度决定激发光的强度，从而影响发射光强度。激光强度过低会导致信噪比降低；过高则会引起光漂白。应相应调整激光强度。
    3. 优化步长和步数：步数和步长决定Z轴堆栈中采集图像的数量。较小的步长和更多的步数可提高Z轴分辨率，但也会增加光漂白。本实验中，对于高度约为15 µm的细胞，采用1 µm的步长。
    4. 优化曝光时间：曝光时间决定细胞暴露于激发激光的时间长度。曝光时间过短会降低信噪比；过长则会引起光漂白。本实验中采用每4秒1帧的曝光时间。
    5. 成像参数优化：迭代改变四个参数中的一个，同时保持其他参数不变。每次测量每幅图像的YAP核质比（N/C ratio），并比较YAP核质比的变化以确定光漂白程度。重复优化过程，直至在信噪比、成像速度和光漂白之间达到平衡。
    6. 使用优化后的成像参数定义成像配置，以便在实验中实现更快的成像设置。
      注意：本研究中使用的配置详见第5.3节成像参数部分。为优化第5.3节中配置的成像参数，请使用与步骤5.2.5相同的方法。
  3. 施加小力及共聚焦成像
    注意：本研究使用Nikon Ti2-E显微镜进行成像，图像采集的详细步骤如下。
    1. 打开倒置显微镜，启动软件应用Elements。
    2. 定义配置magnetic_find。仅勾选FITC通道，设置PMT HV = 70，Offset = 0，Laser intensity = 10。通过点击1/2按钮将扫描速度设为每2秒1帧。通过点击1.2 A.U.按钮将针孔尺寸设为1.2 AU。该配置将在步骤5.3.5中使用。
    3. 定义配置magnetic_YAP_Nucleus。勾选FITC通道，设置PMT HV = 70，Offset = 0，Laser intensity = 10。通过点击1/2按钮将扫描速度设为每4秒1帧。通过点击1.2 A.U.按钮将针孔尺寸设为1.2 AU。为成像细胞核边界和核染色强度，勾选Cy5通道，设置PMT HV = 70，Offset = 0，Laser intensity = 10。针孔尺寸已针对3D YAP成像优化。勾选Cy5通道后请勿再次点击1.2 A.U.按钮。该配置将在步骤5.3.7中使用。
    4. 如有需要，通过Elements开启DIA。打开SpinView，使用明场模式并调节焦距，以获得清晰的细胞聚焦图像。使用10倍物镜寻找三种条件下的合适多个单细胞：细胞内含单个微珠、多个微珠或无微珠。切换至40倍物镜，并以适当的位置编号命名该位置。
    5. 打开Elements，点击magnetic_find，然后点击Remove Interlock按钮。
    6. 点击Scan并调节焦平面的Z轴位置。点击Top和Bottom按钮，为所选细胞设定Z轴堆栈的上下限。再次点击Scan以停止扫描。
    7. 切换至magnetic_YAP_Nucleus配置。将文件名设为before_small_force.nd2，使用已记录的Z轴堆栈点击Run按钮。
    8. 切换至正确的光路并开启DIA。打开SpinView并点击Recording按钮。同时旋转磁铁移动装置的旋钮，将磁铁下移至距培养皿底部46 mm处。保存明场图像序列或视频。检查视频以确认微珠显示出由磁力引起的位移。
    9. 重复步骤5.3.5–5.3.7，将文件名设为after_small_force.nd2。
    10. 切换至正确的光路并开启DIA。接着打开SpinView并点击Recording按钮。同时旋转磁铁移动装置的旋钮，将磁铁上移至距培养皿底部120 mm处。保存明场图像序列或视频。
    11. 重复步骤5.3.5–5.3.7，将文件名设为before_large_force.nd2。
  4. 施加大力及共聚焦成像
    1. 移除环境培养箱的盖子，以便磁铁可下移至距培养皿底部13 mm处。
    2. 切换至正确的光路并开启DIA。打开SpinView并点击Recording按钮。同时旋转磁铁移动装置的旋钮，将磁铁下移至距培养皿底部13 mm处。保存明场图像序列或视频。检查视频以确认微珠显示出由磁力引起的位移。
    3. 重复步骤5.3.5–5.3.7，将文件名设为after_large_force.nd2。
    4. 切换至正确的光路并开启DIA。接着打开SpinView并点击Recording按钮。同时旋转磁铁移动装置的旋钮，将磁铁上移至距培养皿底部120 mm处。保存明场图像序列或视频。
    5. 重复步骤5.3.5–5.3.7，将文件名设为retract_large_force.nd2。
    6. 关闭环境培养箱的盖子。
  5. 如有需要，对多个视野重复步骤5.2和5.3，以获取更多数据。

6. 图像处理与数据分析

  1. YAP 核质比的定量分析
    1. 打开 Fiji ImageJ。打开步骤 5 中获取的 .nd2 图像。
    2. 点击 分析 > 设置测量值。勾选 面积、积分密度、平均灰度值 和 形态描述符。
    3. 使用 Cy5 通道识别细胞核。点击 自由手选择 ，使用自由选择工具勾勒细胞核轮廓。也可使用 ImageJ 中的自动核掩膜宏（见材料表）。
    4. 在 FITC 通道中点击 分析 > 测量 。测得的 平均值 即为核内 YAP 平均强度 DN。
    5. 使用 Cy5 通道识别细胞核，使用 FITC 通道识别整个细胞。点击 自由手选择 ，使用自由选择工具在细胞质内选择一个感兴趣区域，并避开磁性微珠。该感兴趣区域不得包含细胞核。
    6. 在 FITC 通道中点击 分析 > 测量。测得的 平均值 即为细胞质中 YAP 平均强度 DC。
    7. 计算 YAP 核质比 = DN / DC。
  2. 细胞核形态及归一化核染色强度的定量分析
    1. 打开 Fiji ImageJ。打开步骤 5 中获取的 .nd2 图像。
    2. 点击 分析 > 设置测量值。勾选 面积、积分密度、平均灰度值 和 形态描述符。
    3. 使用 Cy5 通道识别细胞核。点击 自由手选择，使用自由选择工具勾勒细胞核轮廓。
    4. 在 Cy5 通道中点击 分析 > 测量 。测得的 平均值 为核染色强度，测得的 Circ. 值为细胞核圆形度。
    5. 为比较不同受力状态下核染色强度的变化，将所有核染色强度除以 "before_small_force.nd2" 中的核染色强度，以获得归一化的核染色强度。

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结果

磁铁移动装置的设计与磁力的应用
为了通过磁性微珠对细胞核施加作用力，设计并构建了一种磁铁移动装置，用于控制磁铁的空间位置。该磁铁移动装置包含一个中央框架、三个旋钮和导轨，可独立调节所连接磁铁在 x、y 和 z 三个方向上的位置，空间分辨率为每转 1.59 mm（图 1A）。当磁铁移动至已导入细胞内的 7 µm 微珠附近时（图 1B），便会通过磁力吸引微珠，并对细胞核施加作用力（图 1C）。作用力的方向和大小由磁铁与微珠之间的相对位置控制。

在本研究中，对微珠施加了两种不同大小的力：（1）当磁铁放置在细胞上方46 mm处时，施加相对较小的力；（2）当磁铁放置在细胞上方13 mm处时，施加相对较大的力。作用于微珠的磁力F可通过以下公式计算59：

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讨论

磁性微珠的内化（第2.2节）至关重要，因为细胞外的微珠无法直接对细胞核施加力。力的施加与成像（第5.3节） 是 本实验中的关键步骤以及使细胞核变形并引发显著生物学效应所需的力可能因样本而异。本实验中施加的力大小（0.8 nN 和 1.4 nN）可进一步提高，以在敏感性较低的细胞中触发细胞核的机械感应。

为了以高通量方式定量施加磁力，单个微珠内化是一种理想的方法。本研究中，细胞内化单个微珠的比例在12小时（26%）和24小时（28%）时相似，而未内化微珠的细胞比例在12小时（53%）高于24小时（20%）（图3B）。考虑到可内化更多微珠并更好地控制细胞，12小时被认为是施力实验的最佳时间点。对于不同的细胞系和微珠尺寸，应测试共培养时间与微珠浓度，以确定相应的最佳条件。

在实验中，微珠未经过特异性结合细胞核的包被处理。因此，从微珠直接传递到细胞核的力可能仅为压缩力。结果显示，YAP的核质比随细胞群体的增加而升高，随细胞群体的减少而降低。

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披露

不存在任何利益冲突需要声明。

致谢

本项目由 UF Gatorade 奖项启动基金（X. T.）、UFHCC 试点奖项（X. T. 和 Dietmar Siemann 博士）、UF 机遇种子基金（X. T.）、UFHCC 大学学者计划（H. Y. Wang）资助。我们衷心感谢 Jonathan Licht 博士（UFHCC）、Rolf Renne 博士（UFHCC）、Christopher Vulpe 博士（UFHCC）、Blanka Sharma 博士（BME）、Mark Sheplak 博士（MAE & ECE）、Daniel Ferris 博士（BME）、Malisa Sarntinoranont 博士（MAE）、Ashok Kumar 博士（MAE）、Benjamin Keselowsky 博士（BME）、Brent Gila 博士（RSC）、Philip Feng 博士（ECE）、Gregory A. Hudalla 博士（BME）、Steven Ghivizzani 博士（OSSM）、Yenisel Cruz-Almeida 博士（CDBS）、Roger Fillingim 博士（CD-BS）、Robert Caudle 博士（OMS）、John Neubert 博士（DN-OR）、Justin Hiliard 博士（神经外科）、Tian He 博士（哈佛大学）、Youhua Tan 博士（香港理工大学）、Jessie L-S Au 博士（定量系统药理学研究所）、David Hahn 博士（亚利桑那大学）以及尼康支持团队（Jose Serrano-Velez 博士、Larry Kordon 博士和 Jon Ekman 博士）提供的学术讨论和技术支持。我们深切感谢 Tang 实验室、Yamaguchi 实验室、Sharma 实验室、Au 实验室、Siemann 实验室和 Guan 实验室全体成员，以及佛罗里达大学 MAE 系所有工作人员给予的有力支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.05 % 胰蛋白酶康宁25-051-CI
25 cm2 烧瓶康宁156340
7-µm 平均直径羰基铁微珠N/AN/A
A1R 共聚焦系统尼康
羰基铁粉 CMBASF30042253磁性微珠
培养基（RPMI-1640）Gibco11875093
台式计算机Dell搭载 Windows 10 操作系统
环境舱 TIZB东海日立TIZB
胎牛血清（FBS）Gibco26140
Fiji ImageJ美国国立卫生研究院与光学与计算仪器实验室
玻璃底培养皿MatTekP35G-1.5-14-C
磁体K&J Magnetics, Inc.D99-N52
单色 相机FLIRBFS-U3-70S7M-C
NIS-Elements 软件平台尼康软件平台
细胞核掩膜 ImageJ 宏https://github.com/KOLIUG/Nuclear mask
NucSpot Live 650Biotium#40082核染色
青霉素-链霉素Gibco15140122
磷酸盐缓冲液（PBS）Gibco10010023
Ti2-E倒置显微镜尼康
XYZ 移动装置（CAD 文件）https://github.com/KOLIUG/XYZ-mover

参考文献

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结合三维磁力驱动装置与多功能荧光成像技术研究细胞核力学生物学
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