固定胚胎小鼠组织以进行细胞内膜分析

胚胎发育是通过形态原信号通路的协调激活来协调的。形态原是小的分泌蛋白质，分为声波刺猬（SHH），转化生长因子β（TGF-β）/骨形态发生蛋白（BMP），无翅相关整合位点（WNT）以及成纤维细胞和表皮生长因子（FGF / EGF）家族。形态原在组织发育过程中从细胞组织中心产生和释放，并在细胞的组织场之间建立信号梯度，以告知组织形态发生^1，2，^3，4，5。形态原梯度的一种表征存在于发育中的神经系统中，其中假定的中枢神经系统通过形态原途径激活来模式化。这种组织称为神经管，由腹侧最切口和底板分泌的SHH的相反梯度以及从背屋顶板分泌的WNTs / BMP组成，以形成不同的神经祖细胞区域⁶。神经管通常用于在发育研究中询问形态原梯度的完整性。

形态原梯度的形成依赖于信号色散的严格调节⁷.发生这种情况的一种细胞机制是通过形成称为细胞介素的长信号丝状体，其促进形态原从信号产生细胞直接传递到特定的靶细胞群。已经观察到细胞介子延伸数百微米以在信号接收细胞膜上沉积形态原^8，9。细胞介导的形态原转运的破坏导致苍蝇和脊椎动物的发育异常，突出了它们在组织模式化过程中的重要性^{10，11，12，13，14}。

迄今为止，细胞内膜已被记录在 果蝇，雏鸡和斑马鱼模型中，但发育中的哺乳动物胚胎结构的成像仍然具有挑战性^8，9，15。在复杂的哺乳动物组织中原位有效成像细胞neme 的一 个障碍是它们的薄而脆弱的性质，这使得它们容易受到常规固定方法的损害⁸。我们之前已经开发和优化了改良的电子显微镜固定剂（MEM-fix）的方案，以保留培养细胞中的细胞因子，并使用共聚焦显微镜^{进行研究16，17}。

使用MEM固定技术已经允许鉴定参与SHH诱导的细胞介基因形成和功能的一些分子^11，16，17。然而，在神经管模式的生理学相关背景下对这些发现的证实需要开发新的技术来固定和成像小鼠胚胎组织。这里概述了以维持细胞基线完整性并允许免疫染色和随后切片胚胎组织以进行共聚焦分析的方式固定小鼠胚胎的方案。该协议是使用膜系留的绿色荧光蛋白（GFP）来标记来自发育中的神经管中产生SHH的细胞的膜延伸而开发的。该协议的实施将解决与发育中的哺乳动物系统中细胞介素的流行率和重要性有关的未解答问题。

该协议遵循机构动物护理和使用委员会（IACUC）和圣裘德儿童研究医院批准的动物护理指南。所有菌株都与C57BL / 6J菌株进行了五代的交叉。

1. 胚胎分离和整个安装染色

1. 饲养6周龄的雌性并监测阴道塞的存在。
2. 根据 AVMA 指南¹⁸，在 CO₂ 腔室中吸入 CO₂，然后进行宫颈脱位，对妊娠大坝实施安乐死。使用解剖剪刀和镊子在腹膜腔做一个Y形切口。根据批准的机构指南切除含有E9.5胚胎的子宫。
3. 在完全生长培养基中解剖胚胎（Dulbecco的改性鹰培养基，补充非必需氨基酸，丙酮酸钠，L-谷氨酰胺和10%胎牛血清）。使用镊子去除卵黄囊、胎盘和周围膜。
   注意:需要时，保存每个卵黄囊用于胚胎基因分型。
4. 在汉克的平衡盐溶液（HBSS）中冲洗分离的胚胎，以去除任何残留的羊膜组织和血液。
5. 准备固定剂。在 HBSS 中添加多聚甲醛 （PFA），最终工作浓度为 4%PFA。
   注意:PFA是一种有毒化学物质，因此必须避免吸入或直接接触皮肤。固定溶液的制备在通风橱下进行，并配有适当的个人防护设备，如手套和实验室外套。
6. 向24孔板的每个孔中加入1 mL固定剂，并将每个胚胎放入单个孔中。将胚胎在固定剂中孵育45分钟，并在摇杆上轻轻搅拌。
   注意:关键:所有洗涤和孵育必须在摇臂或圆形摇 床上轻轻搅拌 （最大20 RPM），因为胚胎的突然处理或移动会破坏固定的细胞因。使用移液器轻轻地取出所有溶液。
7. 取出固定剂，并在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中用Ca^{2 +} 和Mg 2⁺ 加入0.1%曲拉子洗涤胚胎3×30分钟。
8. 洗涤后，将胚胎在封闭溶液（PBS与Ca^{2 +} 和Mg^{2 +}，0.1%曲里通和5%山羊血清）中孵育，轻轻搅拌。块2 x 1小时。在第二次封闭孵育后，使用新鲜的封闭溶液对胚胎进行一次快速冲洗。
9. 在第二个封闭步骤中，制备一抗溶液¹¹。用Ca^{2+和Mg 2+} ，0.1%吐温-²⁰和5%山羊血清将抗体稀释至PBS中的优化浓度。
   注意:为了增强膜GFP的可视化，可以使用鸡肉抗GFP（1:250）。
10. 除去封闭溶液并向每个孔中加入1 mL一抗溶液。在4°C下温和旋转孵育3天。
11. 一抗孵育后，在PBS的摇杆上用Ca^{2 +} 和Mg 2⁺，0.1%吐温-20和5%山羊血清以20 RPM的速度洗涤胚胎5×1小时。
12. 使用F（ab'）₂ 片段次级试剂在PBS中以1:1，000稀释度与Ca^{2 +} 和Mg^{2 +}，0.1%吐温-20和5%山羊血清制备二抗溶液。
    注意:使用F（ab'）₂ 片段可大大增强抗体在样品中的渗透性。
13. 向每个孔中加入1 mL二抗溶液。在黑暗中在4°C下轻轻摇动孵育3天。
    注意:重要提示:从此时起，尽量减少胚胎暴露在直射光下。可选:为防止细菌生长，在二抗溶液中加入0.2%叠氮化钠。
14. 取出二抗溶液，用Ca^{2 +和Mg 2 +} ，0.1%吐温-²⁰和5%山羊血清在PBS中洗涤胚胎3×30分钟。如果不用鬼灭英或其他肌动蛋白染料进行肌动蛋白染色，在第一次洗涤后，将4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）加入PBS中，加入Ca^{2 +} 和Mg^{2 +}，0.1%吐温-20和5%山羊血清并孵育1小时，然后如上所述洗涤3×30分钟。
    注意:此时，胚胎可以在4°C的PBS或HBSS中在黑暗中储存过夜，直到第二天进行包埋步骤。但是，建议立即嵌入胚胎并切片。

2. 胚胎包埋、切片和安装

1. 准备溶解在HBSS或PBS中的4%w / v低熔点（LMP）琼脂糖溶液，其中Ca^{2 +} 和Mg^{2 +} 至每个胚胎的最终体积〜3 mL。将适当重量的 LMP 琼脂糖加入含钙²⁺ 和 Mg 2⁺ 的 HBSS 或 PBS 中，微波加热，直到 LMP 琼脂糖溶解。
   注意:一旦LMP琼脂糖溶解，将溶液储存在珠浴，培养箱或设置为55°C的水浴中，以防止LMP琼脂糖溶液凝固。
2. 使用12孔板作为胚胎的包埋模具。将12孔板置于55°C珠浴中。向每个将容纳胚胎的孔中加入2.5-3 mL 4%LMP琼脂糖。
   注意:虽然可以使用其他模具，但12孔板体积是后期制备琼脂糖块以进行切片的最佳选择。
3. 使用穿孔勺子将胚胎转移到含有4%LMP琼脂糖溶液的单个孔中（图1A）。
   1. 将12孔板从珠浴转移到台面上。使用移液器吸头轻轻嵌入和定向胚胎，使其在溶液中居中。一旦胚胎取向，将板置于-20°C下10分钟，以使块快速凝固。
      关键:确保胚胎位于块的中心。下沉到底部或太靠近模具边缘的胚胎可能会在切片时从琼脂糖块中脱落。
4. 使用手术刀从孔中取出整个琼脂糖块，并在胚胎周围切割一个矩形块，每侧留下约0.3厘米的块。沿着胚胎的尾端允许额外的长度。当安装在振动组上时，将胚胎定向到块上部的直立位置（图1B）。
5. 将一条胶带贴在振动组的标本支架上，并将琼脂糖块超胶合到胶带上，定向使叶片在后序列的前（颅骨）中产生胚胎的轴向切片。
6. 用冷的HBSS填充振动室以确保样品完全浸入，然后用冰包围室。
7. 将振动切片机 速度 设置为 0.2 mm/s ， 频率 在 5 到 7 （50-70 Hz） 之间， 切割厚度 设置为 100 μm。对胚胎进行连续的轴向切片。
   注意:使用较慢的速度进行切片。如果切割速度增加到0.25 mm / s以上，切片可能会撕裂胚胎或将胚胎从块中移走。
   1. 在切片系列中，使用镊子将各个切片轻轻地转移到装满HBSS的单独的60毫米培养皿中。使用镊子抓住块，而不是组织，以避免组织损伤和细胞介素的破坏。
      注意:组织切片应保留在琼脂糖块内。如果组织从块中落入振动室，则通过抬起切片轻轻转移。不要抓住或捏住纸巾。严重:任何组织切片的折叠或突然的处理都会破坏组织切片中的固定细胞因子。
8. 如果不进行F-肌动蛋白染色，请继续执行步骤2.10。
   1. 为了进行F-肌动蛋白染色，除去HBSS并用在室温下^在PBS 中稀释的肌动蛋白红和DAPI溶液孵育切片40^分钟，0.1%吐温-20和5%山羊血清。
9. 在PBS中用Ca 2 +和Mg^{2 +} 以及0.1%吐温-²⁰ 洗涤切片3 x 20分钟。
10. 使用疏水性记号笔，在带电显微镜载玻片的边缘周围绘制疏水屏障，并添加少量HBSS以填充该区域。
11. 使用镊子或穿孔勺将切片转移到载玻片上。
    注意:任何未被琼脂糖包裹的组织切片都可以 通过 转移移液器转移。
12. 使用镊子去除多余的琼脂糖块。
13. 一旦所有部分都转移到载玻片上， 通过 移液和吸收性纸巾的角落除去多余的液体，然后将几滴安装介质添加到载玻片中。固化后，使用足够的安装介质覆盖整个盖玻片区域。轻轻地将盖玻片放在滑轨上，以安装盖玻片。
    注:在安装介质固化之前，避免施加压力或干扰盖玻片。

3. 成像

1. 在任何共聚焦或更高分辨率的显微镜¹¹上对组织切片进行成像。每个基因型至少分析三个胚胎。
   注意:使用TCS SP8 STED 3x共聚焦显微镜获取组织切片的图像，然后进行闪电反卷积。

使用每孔2.5-3 mL琼脂糖溶液的12孔板的较大模具是在短时间内包埋和悬浮多个胚胎的理想选择（图1A）。多余的面积允许在切割琼脂糖块进行切割时正确定位。切割琼脂糖块时，重要的是要保持多余的琼脂糖沿着块的底部，在那里它将粘在物体支架上的胶带上。胚胎应位于块的上半部分（图1B）。但是，底部截面不应太大，因为当刀片在切口时推入块时，多余的块会增加改变切割角度的机会。图中显示了正确方向的部分的示例（图1C，D）。

在开发该协议时，将振动切片与低温切片进行比较。冷冻切片组织的冷冻切片很少保留细胞延伸（图2 冷冻恒温器和 图3A，B 振动组）。低温恒温切片允许检测切口和神经管细胞之间的一些GFP阳性膜片段（图2A 箭头）和相邻神经管细胞之间的一些GFP阳性膜碎片（图2B，B' 箭头）。然而，神经管周围高度丝状间充质细胞中细胞延伸的F-肌动蛋白染色在低温恒温切片中受损（图2C，C' 箭头，与 图3C，D）。这些低温恒温器结果表明，只有一些破碎的细胞延伸痕迹仍然遵循这种方法。因此，优选振动切片，以有效地保留这些精细的延伸部分以供后续分析。

对整个胚胎和单个组织切片的最小破坏对于细胞延伸的高质量成像至关重要。经历过任何折叠或屈曲的组织切片将通过没有切口或神经管的切口和腹侧底板之间的大分离（>30μm）来明显（图3B）。这通常伴随着通常围绕神经管的间充质细胞的损失（图3A，箭头）。受损的部分也将导致可见细胞膜延伸的损失在上皮细胞之间迁移（图3B与图3A相比，箭头）。即使对截面的微小扭曲也可能导致基于肌动蛋白的延伸片段化，并在细胞之间形成大间隙（图3D，箭头，与保存完好的图3C相比），强调了在所有步骤中进行精细处理的必要性。

图1:E9.5 嘘-克雷的例子;罗莎26 mTmG 染色，嵌入和切片胚胎。 （A）将单个胚胎浸入12孔板中，包埋在4%LMP琼脂糖中。（B）琼脂糖块内正确取向的胚胎的例子，切成振动筛的尺寸进行振动切片。过量的琼脂糖块沿着底部存在。（C）嵌入LMP琼脂糖中的100μm厚胚胎切片的明场图像。（D）去除琼脂糖后切片的免疫荧光成像。抗GFP染色的mGFP（绿色）代表组织中表达 Shh的细胞，其他细胞谱系表达膜番茄（红色），蓝色DAPI。神经管（支架）和 mGFP 正切口（箭头）清晰可见。比例尺 = 1 厘米 （A）、5 毫米 （B） 和 100 微米 （C，D）。缩写:LMP =低熔点;mGFP = 膜绿色荧光蛋白;嘘=索尼克刺猬;DAPI = 4'，6-二氨基-2-苯基吲哚。 请点击此处查看此图的大图。

图2:低温恒温器切片神经管底板和具有碎片膜延伸的切口的例子。蔷薇 26 mTmG19，20，21 切片染色为 GFP（绿色）、F-肌动蛋白（红色）和 DAPI（蓝色）。mGFP穿刺在切口和底板（箭头）和（B，B'）之间可见，在神经管的相邻细胞之间迁移。（C，C'）F-肌动蛋白染色无法检测到神经管周围间充质细胞上的任何透明细胞内膜（箭头）。比例尺 = 20 μm。简称:mGFP=膜绿色荧光蛋白;嘘=索尼克刺猬;DAPI = 4'，6-二氨基-2-苯基吲哚。请点击此处查看此图的大图。

图3:最佳和次优振动组组织切片的例子以及神经管底板，切口和周围细胞的染色。 精细处理切片（A，C）的例子，与（B）折叠的组织切片和（D） Shh-Cre处理不良的部分相比;罗莎26 mTmG 和一个 嘘GFP / + 胚胎19，20，21。最佳处理切片允许检测相邻定位的底板神经上皮细胞（A，箭头）之间的细胞介素。神经管邻近的切口（A，表达mGFP）和间充质细胞（A，箭头）应该是可见的。（三、四）F-肌动蛋白和DAPI染色切片应具有一致的间充质细胞间距和基于F-肌动蛋白的细胞介子（箭头）围绕神经管和切口（C）。切片的任何轻微折叠或破坏都可能导致间隙和F-肌动蛋白碎片（D，箭头）断裂。比例尺 = 10 μm。简称:mGFP=膜绿色荧光蛋白;嘘=索尼克刺猬;DAPI = 4'，6-二氨基-2-苯基吲哚。 请点击此处查看此图的大图。

作者没有竞争利益需要声明。