用于肿瘤类球体半高通量分析的快速光学透明化

摘要

肿瘤类球体正越来越多地被用于评估肿瘤细胞与微环境之间的相互作用以及治疗反应。本方案描述了一种利用快速光学透明化技术对三维肿瘤类球体进行半高通量成像的稳健且简便的方法。

摘要

肿瘤类球体在基础癌症研究和药物开发中正迅速变得普遍。获取类球体在细胞水平上的蛋白表达数据对于分析至关重要，但现有技术往往成本高昂、操作繁琐、使用非标准设备、导致显著的尺寸变形，或仅限于相对较小的类球体。本实验方案介绍了一种新的类球体包埋与透明化方法，可解决上述问题，同时允许对类球体内部结构进行共聚焦分析。与现有方法相比，该方案利用标准设备和实验室耗材，能够快速完成大量类球体的包埋和透明化处理。在引入折射率匹配的透明化溶液之前，先将类球体包埋于pH中性的琼脂糖-PBS凝胶溶液中，可最大限度减少其他类似技术中常见的尺寸变形。这使得在尺寸测量精度至关重要的情况下，仍可进行详细的定量与统计分析。此外，与液体透明化方法相比，琼脂糖凝胶技术能将类球体固定在原位，便于采集三维（3D）共聚焦图像。本文详细阐述了该方法如何获得高质量的二维和三维图像，从而提供有关细胞间异质性及类球体内部结构的信息。

引言

三维（3D）细胞培养模型（如球状体）可提供生物学上更真实且可重复的细胞聚集生长模型^1,2。这类模型在基础研究和药物开发中正迅速普及，通过比较不同处理条件下球状体的大小和结构差异，以评估药物疗效^3,4。在这些研究中，能够从大量球状体中获取详细信息具有显著优势，不仅可提高统计效力，还能快速评估多种处理条件下细胞的行为变化。

获取类球体结构的详细显微图像的常用技术，要么耗时较长，要么成本高昂，要么生成的图像质量较差，无法保留类球体大小等关键定量特征^4,5。例如，基于冷冻切片的组织学技术虽可提供高质量图像，但通常耗时较长，需要熟练的技术人员操作，且常产生切片伪影^6,7；而诸如单平面照明显微镜（SPIM）⁸和多光子显微镜⁹等精密技术则需要专用显微镜设备，难以普及。近年来，现代显微技术实现了所谓的光学切片，即将类球体置于折射率匹配的透明溶液中，利用共聚焦显微镜获取图像^4,5。尽管这些技术具有高产出的潜力，但仍存在常见问题，包括成像过程中类球体移动、透明处理时的尺寸畸变，以及专用透明溶液成本高昂等。此外，许多现有方案仅适用于直径或深度小于300 µm或100 µm的较小类球体，限制了该技术在肿瘤生长早期阶段之外的应用^5,10,11。

本实验方案采用一种低成本、基于全器官透明化技术衍生而来的折射率匹配透明溶液，可实现类球体结构的半高通量、高产率、高细节成像^12,13。为防止成像过程中类球体移动，并提供结构支撑以减少尺寸形变，将类球体固定于含琼脂糖-PBS凝胶的24孔#1.5玻璃底板中。由于该技术允许在24孔板的每个孔内固定多个类球体，因此可在不同实验条件下快速固定并成像多达360个类球体（每孔15个）。使用由常规耗材配制的折射率匹配透明溶液，对固定后的类球体及其周围凝胶进行光学透明化处理。经过24小时沉降后，本方案可获得高质量的类球体二维和三维结构图像，即使对于直径约700 µm的较大类球体，其尺寸形变也小于2%。

方案

该方案描述了制备足够数量肿瘤类球体的步骤，用于铺制一块24孔板（每孔200 µL琼脂糖凝胶，共约240-360个类球体，即每孔10-15个类球体），每孔还需加入500 µL透明溶液。完整操作流程见图1。

1. 2% 琼脂糖-PBS 凝胶的制备

1. 称取0.5 g低熔点琼脂糖（见材料表）于玻璃瓶中，加入25 mL磷酸盐缓冲液（PBS）。
2. 将溶液在微波炉中加热煮沸30–60秒以溶解琼脂糖，瓶盖需关闭但不要密封，并持续旋转混匀。确保琼脂糖完全溶解，且溶液不发生暴沸。
   注意：凝胶可在室温下保存；使用前检查体积是否因蒸发而减少。使用前需重新加热至液态（微波加热20–60秒，期间持续旋转）。

2. 透明化溶液的制备

1. 称取 9 g N,N,N′,N′-四(2-羟丙基)乙二胺、22 g 尿素、44 g 蔗糖、0.1 g Triton X-100 以及 24.9 g 去离子水（见材料表）。
   注意：可先粗略称量 N,N,N′,N′-四(2-羟丙基)乙二胺的质量，再调整其他组分的质量以获得所需浓度，操作更为简便。
2. 将溶液置于 56 °C 水浴中持续搅拌加热，直至所有晶体完全溶解。
3. 将溶液在室温下静置，使混合过程中产生的气泡上升至液面。该溶液在室温下可稳定保存长达 2 个月。

3. 类球体的制备

1. 采用之前所述的琼脂糖覆盖法生成球状体^1,3,14。
   注意：采用其他方法生成的球状体也适用于本成像方案。
2. 使用手术刀切割1 mL移液器吸头的尖端，以扩大其孔径。
   注意：所有球状体均使用剪切过尖端的1 mL或200 µL移液器进行操作。
3. 使用移液器将球状体从孔中吸出，并转移至一个透明的1.5 mL锥形管中。相同条件下的多个球状体可合并置于同一管中。
   注意：每次吸取培养基前，均应让球状体充分沉降至管底。
4. 用1 mL PBS洗涤球状体两次，加入中性预热的4%多聚甲醛（PFA）溶液，在37 °C孵育20分钟。
5. 去除PFA溶液，用1 mL PBS洗涤球状体两次。

4. 类球体染色

1. 使用移液器将最多15个类球体转移至一个200 µL的PCR管中。
   注意：对于较脆弱的类球体，建议在进行后续步骤前先将其包埋于凝胶中（步骤5.1–5.4）。
2. 使用含0.5% Triton X-100的PBS溶液200 µL对细胞进行通透处理。将PCR管放入50 mL螺口离心管中，在室温下轻轻振荡孵育2小时。
   注意：除非另有说明，所有孵育步骤均需在旋转仪、滚轴混合器或摇床上进行振荡（参见材料表），这对于实现均匀染色至关重要。固定后的类球体在PBS中有时会粘附在移液器吸头壁上。用0.5% Triton X-100冲洗吸头可减少类球体的粘附。
3. 弃去上一步溶液（步骤4.2），加入200 µL抗体稀释缓冲液（ABDIL）¹⁵，在室温下孵育过夜。
4. 移除ABDIL，加入75 µL用ABDIL稀释的一抗，于4 °C孵育2.5天。
5. 移除上清液，用含0.1% Tween和0.1% Triton X-100的PBS（PBS-TT）200 µL洗涤两次 ，再加入200 µL PBS-TT，在室温下孵育4小时。
6. 移除PBS-TT，加入100 µL用ABDIL稀释的二抗，于4 °C孵育2.5天。
   注意：此步骤可加入DAPI或其他细胞核染料。大多数染料所需的孵育时间比抗体短。
7. 移除上清液，用200 µL PBS-TT洗涤两次，再加入200 µL PBS-TT在室温下孵育4小时。此时类球体已可进行封片。

5. 封片

1. 使用 200 µL 移液器，将固定并染色后的类球体转移至 500 µL PCR 管中，每种条件一管（约 10–15 个类球体）。
2. 用 200 µL 的 2% (w/v) 液态琼脂糖凝胶替换原有溶液，并在室温下以快速离心（固定最大转速，参见 材料表）离心 30 秒。
   注意：除非立即进行封片，否则应将样品置于 50 °C 加热块中，以防凝胶硬化。
3. 用移液器吸取约 50 µL 含类球体的液态琼脂糖凝胶，滴加至 24 孔玻璃底培养板的孔中。
4. 在凝胶未凝固前，使用移液器吸头在周围凝胶中将类球体彼此分离，并确保类球体完全被凝胶覆盖。可选操作：将培养板置于冰上以加速凝胶凝固。
   注意：每孔中类球体的数量取决于类球体的大小。类球体之间应保持足够距离，以确保成像时每次仅有一个类球体进入视野。这对自动图像处理至关重要。
5. 每孔加入 500 µL 透明化溶液（步骤 2），确保凝胶完全浸没。在室温下孵育至少 24 小时，随后在透明化溶液中对类球体进行成像。类球体在此溶液中于室温下可稳定保存长达一个月，前提是避免蒸发。

6. 成像

1. 选择一个工作距离足够长的物镜，以涵盖整个球状体，包括球状体在容器中的安装高度。
   注意：需要工作距离为3 mm或更长的物镜才能对球状体的赤道平面进行成像。更高放大倍数且数值孔径（NA）更高的物镜可提供更好的分辨率，但会限制可成像球状体的最大深度。
2. 为确定赤道平面，调节焦距直至在XY平面上达到最大表面积，并使用所需的激光功率百分比、检测器电压、增益和偏移设置进行成像。
   注意：激光功率百分比、检测器电压、增益和偏移设置会因荧光染料、染色强度、激光强度、检测器灵敏度等因素而有显著差异。
3. 对于三维图像，在成像前设置球状体的起始和终止位置，并利用z轴强度校正设置，在不同z深度选择适当的信号强度。
   注意：为获得最佳图像分辨率，x、y和z方向应采用奈奎斯特采样率（详见参考文献¹⁶）。

结果

为了展示该透明化方法获取高质量二维和三维图像的能力，使用转导了荧光泛素化细胞周期指示剂（Fluorescent Ubiquitination-based Cell Cycle Indicator, FUCCI）的黑色素瘤细胞系 FUCCI-WM164 和 FUCCI-WM983b^9,17 培养直径为 300–600 µm 的球状体。根据步骤3中提供的方案^1,3,14，这些细胞在细胞周期的Gap1期表达单体Kusabira Orange2（mKO2）蛋白，在S期早期/Gap2期/有丝分裂期表达单体Azami Green（mAG）蛋白。随后将球状体在37 °C下用4%甲醛溶液固定，进行通透处理，并使用抗p27^kip1/抗兔Alexa Fluor 647、抗匹莫硝唑/抗鼠Alexa Fluor 647、DAPI或DRAQ7染色（见材料表）（图2）。所有显微镜图像文件均已上传至GitHub代码仓库（https://github.com/ap-browning/SpheroidMounting）。与PBS封片的球状体相比，透明化溶液提供了高清晰度图像，且尺寸畸变极小（图2A）。本方案可在无需组织学切片的情况下，实现对球状体内部更深层细胞水平细节的高分辨率成像；横截面图像由20倍空气物镜（0.7 NA）以4096 × 4096像素分辨率获取，无需拼接（图2B）。使用较低放大倍数、较低数值孔径但工作距离更长的物镜，可获得深度至少达200 µm、具备细胞水平细节的三维共聚焦图像（图2C）。此外，还按照Spoerri等人的方案⁴对球状体进行冷冻切片并染色，并与完整球状体染色结果进行比较（图2D,E）。图2D显示了由匹莫硝唑标记的球状体缺氧区域，图2E显示标记细胞周期阻滞的p27^kip1染色（黄色）以及DAPI核染色（灰色）。冷冻切片与透明化处理后的蛋白定位及染色模式相似，表明该透明化方法未对结果产生影响。

在 z 轴上进行信号强度校正，可实现整个类球体的成像。然而，由于坏死核心引起的光散射，限制了对类球体远端区域的成像能力。使用近红外荧光染料（如 DRAQ7 核染料）可实现更深的穿透和更少的光散射，从而进一步改善三维类球体结构的呈现（图 3）。视频 1 展示了经 DRAQ7 染色的 FUCCI 类球体的三维重建图像。虽然更薄的 z 轴切片可能提高 z 轴分辨率，但这会显著延长成像时间并加剧荧光染料的光漂白。

为了确定透明化溶液是否引起尺寸畸变，将12个包埋于2%琼脂糖-PBS凝胶中的类球体在加入透明化溶液后的6 h、12 h、24 h、72 h和168 h进行成像。通过测定类球体的直径来汇总图像数据，该直径定义为与类球体具有相同横截面积的球体的直径（图4A）。尽管在最初6 h内观察到类球体尺寸略有增大，表现为直径倍数变化在2%至6%之间（图4B），但在24 h至72 h后，类球体的尺寸恢复至与PFA固定后在PBS中相应的尺寸大致相等的水平（图4C）。

图1：类球体包埋与透明化流程示意图。 固定并染色后的类球体被转移至500 µL离心管中；弃去多余液体，加入200 µL琼脂糖-PBS凝胶，并进行离心。随后将类球体转移至24孔板中的玻底孔内。待凝胶完全凝固后，加入500 µL透明化溶液，使类球体充分平衡。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：透明化与未透明化 FUCCI 人黑色素瘤类球体的比较。 着色表示 mKO2 阳性的细胞核（红色），代表处于 G1 期的细胞；以及 mAG 阳性的细胞核（绿色），代表处于 G2 期的细胞。(A) 由 5000 个 FUCCI-WM983b 细胞培养生成的类球体，在第 10 天收获，并在琼脂糖-PBS 凝胶中成像，以及在加入透明化溶液 24 小时后成像。比较透明化处理前后明场与共聚焦图像，显示尺寸畸变极小，且清晰度显著提高。图像使用 10 倍物镜获取。(B) 由 FUCCI-WM164 细胞培养生成的类球体，使用 Triton X-100 进行通透处理，并用 DRAQ7 染色以标记所有细胞核。图像使用 20 倍物镜（0.75 NA）获取，表明透明化溶液可实现细胞水平细节的高分辨率成像。(C) 对 FUCCI-WM164 类球体在 PBS 中及加入透明化溶液 24 小时后获取三维图像（10 倍，0.4 NA）。通过在不同 z 平面调节激光功率、电压和偏移量，可实现对类球体内部更深层的成像。(D,E) 冰冻切片与经透明化处理的完整类球体在 pimonidazole 和 p27^kip1 染色后的比较。(D) 紫红色的 pimonidazole 染色显示类球体中的缺氧区域，红色和绿色代表 FUCCI 信号。(E) 冰冻切片与透明化类球体显示 DAPI（灰色）和 p27^kip1（黄色）。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：透明化处理可实现对类球体更深层的成像，同时光损失最小。 在10倍放大倍数和较低数值孔径（0.4）下，对FUCCI人黑色素瘤类球体进行共聚焦显微镜成像，可在较高z轴深度下成像且信号损失极小。（A）使用DRAQ7染色的类球体细胞核的3.88 µm切片图像。（B-D）分别为488 nm（mAG）、568 nm（mKO2）和647 nm（DRAQ7）通道的y/z分辨率图像。请点击此处查看该图的放大版本。

图 4：透明化溶液对类球体大小的影响极小。（A）类球体在PBS凝胶中的初始大小分布（等效直径）（n = 12 个类球体）。 （B）加入透明化溶液后随时间变化的直径倍数变化。在0 h时，类球体仅处于PBS凝胶中。 （C）12 h、24 h和72 h时直径倍数变化的分布情况。请点击此处查看该图的放大版本。

视频 1：经 DRAQ7 染色的 FUCCI 类球体的三维重建图像。 请点击此处下载该视频。

讨论

本文介绍了一种获取高质量肿瘤类球体二维和三维图像的实验方案。现有的透明化方法，如CLARITY、See deep brain（SeeDB）和ScaleS，常导致高达30%的尺寸形变；而苯甲醇/苯甲酸苄酯（BABB）和溶剂清除器官三维成像（3DISCO）等技术则可能淬灭荧光蛋白¹⁸。许多此类方法专为具有完整结构的组织透明化设计，应用于类球体时易引起尺寸和结构的形变¹⁸。与使用商业化的昂贵透明试剂的其他方案不同，本方案采用易于获取的耗材，同时保持良好的光学透明性、内源性荧光，并最大限度减少尺寸形变。将类球体包埋于琼脂糖-PBS凝胶中，可为类球体提供结构支撑，并在加入透明溶液时最小化渗透压冲击，这对于药物处理后脆弱类球体的成像尤为关键。由于本方案源自整体组织透明化技术，因此可假设该光学透明方法适用于任何方法形成的类球体。这一假设基于不同类球体形成方法所获得的类球体在结构上的相似性。固定剂的选择可能影响类球体的尺寸及内源性荧光。本透明化方法适用于经中性4%多聚甲醛（PFA）溶液固定的类球体，与其他固定剂的兼容性尚需进一步验证。

由于该技术能够在多孔板中同时固定多个类球体，因此非常适合需要从每块24孔板最多360个类球体获取结构信息的定量分析流程。配备自动载物台和孔板定位功能的显微镜可减少成像过程的手动操作。尽管该方法比切片更快、更简便，但目前尚不适用于完全自动化。然而，通过该方法获得的图像适用于自动化的图像处理^4,19，且按照本方案固定类球体的速度有利于对类球体内部结构进行定量分析^20,21,22。

对于完整类球体的染色，每种抗体的抗体浓度、体积和孵育时间均需优化。作为参考，可使用推荐的二维免疫荧光抗体浓度的2.5倍，并根据每管中类球体的数量，加入100–200 µL抗体溶液。确保在旋转器上孵育时，所有类球体均被染色液完全覆盖。孵育时间取决于多种因素，包括类球体的大小、密度以及所用抗体的特性，通常可在16–72小时之间。尽管该方法能够实现类球体内部更深层信号的检测，但由紫外光激发的荧光染料会引起显著的光散射，导致信噪比较低。因此，在选择用于目标蛋白检测的荧光染料时需格外谨慎。例如，对丰度较低的蛋白或结构蛋白使用长波长荧光染料，而对丰度较高的蛋白或核染料使用短波长荧光染料，可获得最佳成像效果。最后，即使经过透明化处理的类球体，在坏死核心区域仍会因光散射而出现信号衰减，这在600 µm类球体的y/z维度图像中尤为明显（图2C）。

使用本方案进行固定和透明处理的类球体，可实现采用更高数值孔径物镜的高倍成像，但物镜的工作距离限制了成像深度。对于油浸物镜，为获得最佳效果，必须使用折射率为1.51的浸油。

综上所述，使用常见的耗材即可通过琼脂糖-PBS凝胶包埋透明化方法实现对类球体内部深层细胞的可视化观察。采用该方法固定并透明化的类球体经历的尺寸形变极小，且能保持其结构完整性，从而可获取有关类球体内部结构的高质量数据，并实现后续的自动定量分析。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
#1.5 玻底 24 孔板	Celvis	P24-1.5H-N
500 µL 透明 PCR 管	Sigma	HS4422
Alexa Fluor 647 AffiniPure 驴抗小鼠 IgG (H+L)	Jackson Immuno research	715-605-151	使用稀释倍数 1:500
牛血清白蛋白	Sigma	A7906	终浓度 2% w/v
DAPI	Sigma	D9542-10MG	终浓度 5 µg/mL
去离子水	MILLI Q
驴抗兔 IgG (H+L) 高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor 647	Thermofisher	A-31573	使用稀释倍数 1:500
DRAQ7	Thermofisher	D15106	使用稀释倍数 1:250
加热金属块	Ratek	DBH10	或类似设备
Hypoxyprobe 试剂盒	Hypoxyprobe	HP1-1000Kit	抗体稀释倍数 1:500
低熔点琼脂糖粉末	Sigma	A9414	终浓度 2% w/v
微波炉	Sharp
N,N,N′,N′-四(2-羟丙基)乙二胺	Sigma	122262	终浓度 9% w/w
NaCl	Sigma	S9888	终浓度 150 mM
NaN3	Sigma	S2002	终浓度 0.10% w/v
p27 Kip1 (D69C12) XP	Cell Signalling technology	3686S	使用稀释倍数 1:500
多聚甲醛溶液	Proscitech	C004	终浓度 4% w/v
磷酸盐缓冲液 (PBS)	Thermofisher	18912014	终浓度 1x
移液器	Eppendorf
Quickspin 小型离心机			或类似设备
滚轴混合器	Ratek	BTR10-12V	或类似设备
转子	Ratek	RSM7DC	或类似设备
摇床	Ratek	EOM5	或类似设备
蔗糖	Sigma	S9378	终浓度 44% w/w
Tris-HCl pH 7.4	Sigma	T5941	终浓度 20 mM
Triton X-100	Sigma	X100	终浓度 0.10% v/v
Triton X-100	Sigma	X100	终浓度 0.1% v/v
Tween 20	Sigma	P1379	终浓度 0.1% v/v
尿素	Sigma	U5379	终浓度 22% w/w