方法文章

体内 小鼠海马区小胶质细胞的慢性双光子成像

5.2K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/64104

⸱

2022年7月6日

 ,  ,  , 
1Department of Cellular Neurobiology, Graduate School of Medicine, The University of Tokyo

本文内容

摘要

本文介绍了一种通过精确控制的手术和双光子显微镜技术，对小鼠海马CA1区静息态小胶质细胞进行慢性体内观察的方法。

摘要

小胶质细胞是大脑中唯一的常驻免疫细胞，通过调节突触和神经元兴奋性积极参与神经环路的维持。近期研究表明，不同脑区的小胶质细胞在基因表达和功能上具有异质性。海马神经网络在学习和记忆中的独特功能可能与小胶质细胞在突触重塑中的活跃作用相关。然而，手术操作引发的炎症反应一直困扰着海马小胶质细胞的双光子显微成像分析。本文介绍了一种通过成像窗口对海马CA1区各层小胶质细胞进行长期观察的方法。该方法可实现对小胶质细胞突起形态变化的持续分析，时间超过一个月。对静息状态小胶质细胞进行长期、高分辨率成像，需要采用微创手术操作、合适的物镜选择以及优化的成像技术。海马小胶质细胞在术后可能出现短暂的炎症反应，导致术后即刻成像困难，但其通常在数周内恢复静息状态的形态特征。此外，同时对神经元与小胶质细胞进行成像，有助于分析海马中多种细胞类型之间的相互作用。该技术可为理解小胶质细胞在海马中的功能提供重要信息。

引言

小胶质细胞是大脑中唯一的免疫细胞和常驻组织巨噬细胞。除了作为免疫细胞的功能（例如对炎症的快速反应）外，研究还表明它们在神经环路的维持与重塑过程中发挥多种生理作用，例如突触修剪、突触可塑性的调控以及神经元活动的控制1,2,3,4,5。小胶质细胞与神经元之间的生理相互作用在神经环路发育和疾病神经生物学研究中正受到越来越多的关注。在活体（in vivo）条件下分析小胶质细胞的生理特性，需要采用不造成组织损伤和炎症反应的观察方法。然而，小胶质细胞对炎症极为敏感，在组织损伤时会显著改变其形态和功能6,7。

双光子活体成像技术是捕捉小胶质细胞生理动态的理想工具8。早期的活体双光子成像应用揭示了成年小鼠大脑皮层中小胶质细胞突起为进行环境监测而产生的动态运动9,10。后续的双光子成像研究进一步拓展了对小胶质细胞的活体监测，用于分析其与神经元之间的功能性和结构性相互作用5,11,12,13,14。然而，传统双光子显微镜的成像深度通常局限于脑表面以下不到1 mm的范围15,16。这一限制解释了此前关于海马等深部脑区中小胶质细胞行为的研究极为稀少的原因。

近期的RNA测序研究揭示了小胶质细胞存在显著的区域异质性，提示其可能具有不同的功能作用17,18,19,20,21因此，有必要记录小胶质细胞与不同脑区神经元之间的相互作用，但技术上的困难阻碍了此类研究的开展。特别是，已有研究报道小胶质细胞主动参与突触重塑，对海马神经网络的发育及其与记忆相关的功能具有关键作用。22,23然而，目前尚缺乏有效的方法来观察未受刺激的海马区小胶质细胞 体内 尚未提供。

本方案详细说明了利用精确控制的外科技术，对背侧海马体CA1区静息小胶质细胞进行慢性体内观察的操作步骤。通过在CX3CR1-GFP小鼠（CX3CR1+/GFP）中进行CA1区域的双光子成像，可实现对所有CA1层中分支状小胶质细胞的高分辨率观察，该小鼠模型的小胶质细胞表达GFP24。本方案包含成功植入观察窗及设置适当成像条件的多项实用技巧。此外，还展示了CA1区锥体神经元与小胶质细胞同时成像的应用实例。同时讨论了该技术的优势、局限性及潜在应用价值。

方案

所有动物实验均经东京大学动物伦理委员会和基因重组实验安全委员会批准，并按照其政策执行。实验中使用了2至4个月大的雄性和雌性CX3CR1-GFP小鼠。为确保实验人员的安全并维持无菌条件，所有操作均在穿戴白大衣、口罩和无菌手套的情况下进行。所有器械在使用前均经过灭菌处理。 

1. 仪器与动物的准备

  1. 组装带有玻璃底的金属管（图1A）。
    1. 将少量紫外光固化光学胶滴加至定制的不锈钢管一端（外径 3.0 mm，内径 2.8 mm，高度 1.7 mm），并将胶水均匀涂抹在管子的圆形边缘。
      注意：应使用足量的胶水，以完全覆盖管子的整个边缘。
    2. 将圆形玻璃盖玻片（直径 3.0 mm，厚度 0.15 ± 0.02 mm）放置于涂有胶水的金属管末端，并轻轻按压盖玻片，使金属管与玻璃之间的缝隙被胶水充分填充。随后，调整玻璃的位置，使其完全位于金属管的外缘之内。
    3. 用紫外光照射玻璃足够时间，使胶水完全固化。
      注意：确保玻璃与金属管已完全粘合。若粘附不牢固，玻璃可能在手术后脱落，导致成像失败或脑脊液（CSF）泄漏。
    4. 用 70% 乙醇对组装好的带玻璃底金属管进行消毒，并用无菌生理盐水冲洗以去除残留物。
  2. 使用干热灭菌器对所有手术器械进行灭菌。
  3. 准备用于植入窗手术的小鼠。
    ​注意：小鼠应处于合适的年龄。建议使用经基因工程改造、可在 CA1 区和齿状回（DG）表达荧光蛋白的小鼠。这些要点将在讨论部分进一步说明。

2. 麻醉与头部固定

  1. 通过腹腔注射氯胺酮-赛拉嗪混合物（氯胺酮100 mg/kg，赛拉嗪10 mg/kg）对小鼠进行麻醉。术前通过皮下注射给予美洛昔康（2 mg/kg）以提供镇痛。通过疼痛刺激（如夹尾）确认小鼠痛觉反射消失，以确保达到足够的麻醉深度。手术过程中若麻醉效果减弱，通常在首次给药后1小时及此后每30分钟追加一次半剂量的氯胺酮-赛拉嗪混合物。使用加热垫置于小鼠身下以维持体温，并在眼睛上涂抹眼用软膏以防止麻醉期间角膜干燥。
    注意：手术麻醉方式的选择至关重要，这一点将在讨论部分详细阐述。
  2. 涂抹脱毛膏 去除头皮上的毛发。用聚维酮碘溶液以环形动作多次擦拭头皮进行消毒，随后使用酒精消毒。将小鼠置于已铺有无菌防水垫的手术台上，并覆盖无菌手术巾以固定手术区域。然后， 剪开并移除头皮 用手术刀作环形切口，使手术侧的顶骨和枕骨完全暴露。
  3. 用棉签蘸取无菌生理盐水擦拭以去除皮下结缔组织，并止血。用圆头微型刀轻轻刮除颅骨表面的骨膜，以增强骨水泥与骨组织之间的黏附力（参见步骤2.6）。
  4. 将牙科酸蚀材料涂抹至整个表面，等待数十秒后，用足量无菌生理盐水冲洗。
  5. 使用防水墨水标记需去除的骨区域（以冠状缝前约2.5 mm、外侧约2.5 mm处为中心，直径为3.0 mm的圆形区域）。标记后，彻底干燥颅骨表面。
    注意：颅骨开窗的位置取决于海马体的大小，应根据不同年龄进行优化。以下将介绍确定颅骨开窗位置的有用参考指标（见步骤 3.4.5，注意）。
  6. 使用牙科树脂胶按照制造商说明将一块厚度为1.0 mm、中心带有直径5.0 mm孔洞的矩形铝板固定在颅骨上。
    1. 将平板中心的孔与用笔标记的圆形区域（见步骤2.5）精确对齐，使铝板与颅骨标记表面平行（图1B）。确保骨水泥紧密封闭骨板与骨骼之间的所有间隙。等待约5分钟，使骨水泥充分固化。
  7. 将小鼠放置于带有角度调节器的头部固定装置上 通过 附着的板

3. 观察窗的植入

注意：以下手术操作应在体视显微镜下进行。

  1. 使用直径为 3.0 mm 的皮肤打孔器在颅骨上制作一个环形凹槽。将环形凹槽与步骤 2.5 中用笔标记的区域对齐。以轻柔的压力旋转皮肤打孔器，使凹槽深度逐渐增加。频繁检查整个圆周上的凹槽深度是否一致。
  2. 当皮肤打孔器到达颅骨最内层、但尚未接触下方硬脑膜时，使用 30 G 针头轻轻抬起中央的骨岛。
    注意：凹槽底部出现轻微液体渗漏表明凹槽已接近硬脑膜。
  3. 使用硬脑膜剥离器去除硬脑膜。
    注意：必须完全清除颅窗范围内的硬脑膜，需使用精细镊子仔细切除边缘残留的硬脑膜组织。
  4. 使用连接至吸液装置的 23 G 或 25 G 钝头针，轻柔吸除组织，以暴露海马伞（alveus of the hippocampus）。
    注意：此步骤是成功成像最关键的环节。组织吸除的关键技术要点在讨论部分有详细描述。
    1. 吸除软脑膜及其表面血管。
    2. 从表面开始吸除皮层组织。保持整个颅窗范围内暴露组织表面的深度均匀一致。逐步加深吸除深度，直至暴露出外囊纤维。
    3. 将吸头小心地置于位于颅窗前外侧端的侧脑室（LV）附近的外囊处。先去除沿尾内侧至前外侧方向走行的外囊表层，再去除沿中侧方向走行的内层。
      注意：靠近侧脑室（LV）的外囊可较容易地从其下方结构上分离去除。
    4. 通过确认海马伞表面和背侧海马联合（DHC）完全暴露，来验证外囊是否已全部清除。
      注意：背侧海马联合（DHC）覆盖 CA1 区的尾内侧部分。可通过纤维走向区分海马伞与 DHC 和外囊：海马伞与 DHC 内的纤维沿前内侧至后外侧方向走行，而外囊纤维方向不同。海马伞和 DHC 紧密附着于 CA1 区，不应受到损伤。必须彻底清除所有外囊碎片，因为任何残留都会阻碍玻璃盖玻片与海马伞的直接接触。
    5. 确认出血已完全停止，并用无菌生理盐水填充至与颅骨表面齐平。
      注意：此处视野有助于判断开窗位置是否适合该特定年龄的小鼠。理想情况下，海马伞及其下方的 CA1 区应占据中央大部分区域。背侧海马联合（DHC）的一部分在尾内侧区域可见。侧脑室（LV）的开口可在前外侧边缘被识别（图 3A）。
  5. 将玻璃底金属套管（见步骤 1.1）垂直插入孔中，同时吸除从套管边缘溢出的多余液体，直至玻璃底轻轻压住海马伞，并使下方 CA1 区部分压平。
    注意：此压力需适当调整。若压力过大，会损伤 CA1 区；若压力过小，CA1 区曲率引起的球面像差将影响深层结构的成像分辨率。
  6. 使用牙科树脂胶将插入的套管壁固定于周围颅骨上（图 1C）。确保整个圆周紧密密封，无空气或脑脊液泄漏。等待约 5 分钟，使胶体完全硬化。
    注意：若在胶体黏度较低时施加，可能通过套管与颅骨之间的缝隙渗入脑实质并造成损伤。因此，应在胶体聚合启动、黏度升高后施加，以减少经缝隙泄漏的风险。
  7. 用无菌生理盐水清洗整个平台、颅骨表面及套管内部，以清除碎屑。

4. 术后立即进行双光子显微镜检查以评估手术质量

  1. 将小鼠置于双光子显微镜物镜下的头部固定装置中，并放置于电动控制的XY扫描台上。使用加热垫以维持体温。按照步骤2.1所述监测并调整麻醉深度，此质量检查过程可能需要长达30分钟。 
    注意：建议使用工作距离（WD）大于3 mm且具有高数值孔径（NA）的水浸物镜。通过调节物镜的校正环，可补偿玻璃与生物材料之间折射率的不匹配，从而提高分辨率。
  2. 在玻璃与物镜之间注满水，需特别注意避免产生气泡。如有必要，可使用塑料薄膜扩大金属板的覆盖面积，以容纳更多水，确保完全覆盖物镜的前透镜。
  3. 开启波长为920 nm的飞秒脉冲激光器，用于激发脑内表达的荧光探针，并启动图像采集软件。
  4. 利用电动控制的载物台和电动调焦系统，将焦平面调整至CA1区。在脉冲激光持续照射下，根据脑实质发出的荧光以及金属管边缘反射的光线，定位目标结构。
  5. 通过电动调焦系统调节焦平面，测量脑实质与玻璃底面接触处的深度。比较不同水平位置的深度，以判断玻璃底面与成像平面是否对齐。
    1. 通过倾斜头部固定装置，调整小鼠头部的角度，直至玻璃底面与成像平面平行。
  6. 调节物镜的校正环，使在CA1区目标结构所在深度达到最高分辨率。
  7. 确认在距玻璃底面500 µm深度处，齿状回（DG）上角分子层（ML）中的荧光细胞可在整个视场内被清晰成像。
    注意：此步骤对于评估手术质量至关重要。若CA1区受损，局部脑水肿将导致在距表面超过200 µm深度处无法检测到荧光信号。只有当CA1区未受损伤，且其层状结构被上方盖玻片适当压平后，才能在术后立即检测到DG区的信号（图2A-D）。代表性结果部分提供了一种简单方法，用于确定CA1与DG之间的边界。

5. 术后护理

  1. 吸出管内的水，并用塑料封口膜覆盖，以防止异物进入。
  2. 保持小鼠体温，并等待其从麻醉中恢复。
  3. 只要小鼠表现出与疼痛相关的行为，即皮下注射美洛昔康（2 mg/kg），每24小时一次。
  4. 术后将小鼠单独饲养数周。

6. 体内 使用CX3CR1-GFP小鼠进行小胶质细胞的慢性双光子成像

  1. 麻醉诱导后，用无菌生理盐水冲洗金属管内部以去除碎屑。确保通过玻璃能够观察到海马的白色齿状回。图3A且无术后出血等并发症。
  2. 按照步骤 4.1 至 4.6，将小鼠置于双光子显微镜下。
  3. 通过双光子激发检查海马体获取的图像的质量和强度（图3B）。确保在术后水肿消退后拍摄的图像与手术当天拍摄的图像具有可比性，或优于手术当天的图像（图2A，参见步骤 4.5。
    注意：图像质量下降表明脑内存在组织损伤。
  4. 确保小胶质细胞已恢复其分枝状形态（图3C).
    注意：小胶质细胞的成像数据显示，小胶质细胞恢复至基础状态至少需要3-4周。
  5. 执行 体内 为实验的特定目的对CA1的任何层进行成像。

结果

利用该技术，可在背侧CA1区的所有层中长期观察到分支状且静息状态的小胶质细胞，包括最内层的海马锥体层（SO）、锥体细胞层（SP）、辐射层（SR）以及疏松分子层（SLM），尤其是在术后3-4周炎症消退后更为明显。若手术操作得当，可在术后数月内持续进行成像观察。本节包含三个有助于评估活体成像质量的主题内容：首先，提供了术后即刻及慢性期的示例图像，作为手术与成像操作规范的参考；其次，描述了小胶质细胞在特定海马层中的独特形态、荧光强度以及血管分布特征，以帮助读者判断从海马髓突至齿状回（DG）范围内的成像深度；最后，提供了一个应用实例，展示神经元与小胶质细胞的同时成像过程。

术后立即在CX3CR1-GFP小鼠中观察到的小胶质细胞代表性图像如图2所示。如果CA1区无明显损伤，且覆盖的盖玻片已将CA1层的曲率适当压平，则双光子成像可穿透整个CA1层，成像深度可达手术表面下500 µm处，该位置对应于齿状回（DG）的分子层（ML）或颗粒细胞层（GCL）（图2A； 参见步骤4.7及图4E）。小胶质细胞的分支程度略有降低，尤其是靠近手术表面的细胞层，与完整海马组织中的小胶质细胞相比更为明显。然而，这些细胞未表现出显著的活化特征，提示手术操作得当（图2B）。相反，若CA1区因组织损伤而出现水肿，则成像深度将受限，仅能达到200 µm（图2C）。组织损伤还会引起小胶质细胞异常活化，例如向游离组织表面伸出肿胀突起并发生聚集（图2D；与图2B上图比较）。这些均为手术操作不当的表现。

术后3周以上的慢性期小胶质细胞代表性图像如图3所示。可再次对CA1区以外更深的DG层进行成像，荧光强度和分辨率更高，分布更均匀（见步骤6.3，图3B）。成像质量优于术后即刻的图像（图2A），这种差异可能归因于水肿和炎症的减轻。所有层的小胶质细胞均已恢复其分支状形态（图3C），与术后形态（图2B）明显不同。CA1区小胶质细胞的延时成像显示细胞体相对静止，而突起高度活跃，用于监视周围环境（视频1-2）。其运动行为与既往报道的皮层小胶质细胞突起动态相似9。

利用表达荧光探针的海马神经元小鼠，根据神经元胞体的分布和深度来明确成像的海马各层结构是较为直接的方法25,26,27。在缺乏神经元胞体位置信息的情况下，仅凭小胶质细胞的荧光信号也可为海马各层的识别提供一定线索（图3B）。位于alveus层的小胶质细胞具有细长的胞体和突起，其突起倾向于沿轴突通路延伸（图4A）。其他层的小胶质细胞则可通过其圆形的胞体以及无特定方向放射状延伸的突起来加以区分。SP层的小胶质细胞位于致密排列的锥体神经元之间，其突起密度较低，因此可据此进行识别。SP层上方和下方的层次分别被确定为SO层和SR层（图4B）。仅基于小胶质细胞的特性无法区分SR层与SLM层。CA1区与DG区之间的边界可通过沿边界走行的粗大血管进行识别（图4C）。通过腹腔注射荧光染料（如磺基罗丹明101（SR101；5 mM，4 µL/g体重））标记血管，可更清晰地识别这些血管（图4D）。与上方的CA1区相比，DG区的小胶质细胞荧光信号显著减弱，这可能是由于这些结构的折射率差异所致。这种荧光强度的差异也有助于界定DG区与CA1区之间的边界。作为一个应用示例，展示了同时成像GFP阳性小胶质细胞与tdTomato标记的锥体神经元的结果（图4E）。在该实验中，CX3CR1-GFP小鼠接受了腺相关病毒（AAV）注射，以在海马锥体神经元中表达tdTomato。神经元标记将有助于明确CA1区的精确分层结构。

figure-results-1
图 1：观察窗植入的示意图。（A）组装好的玻璃底金属管的横截面图。圆形玻璃盖玻片粘附在圆柱形不锈钢管的一端。（B）固定在颅骨上的铝板的横截面图。铝板应与颅骨标记的表面平行，以避免干扰物镜，物镜需靠近铝板进行聚焦。（C）植入后金属管的横截面图。玻璃底端应紧贴海马体的海马伞，以轻柔压迫并展平CA1区表面。请点击此处查看该图的放大版本。

figure-results-2
图2：CX3CR1-GFP 小鼠术后即刻的小胶质细胞 体内 成像。 （A）CX3CR1-GFP 小鼠术后第 0 天（POD 0）CA1 区域 体内 成像的代表性三维重建图像（宽度：511 µm，高度：511 µm，深度：550 µm）。位于玻璃底部下方 500 µm 深度处齿状回（DG）分子层（ML）中的荧光标记小胶质细胞，可通过整个 CA1 区域被成像。（B）图（A）中典型的 GFP 标记小胶质细胞图像，显示为厚度 20 µm 的图像序列在距玻璃底部 100、300 和 520 µm 深度处的最大强度投影（MIP）。从小鼠 CA1 浅层至 DG 的分子层均可观察到小胶质细胞形态，尽管在 DG 区域图像质量明显下降。尤其靠近手术表面层的小胶质细胞分支减少，但未表现出明显活化。比例尺：50 µm。（C）手术损伤后 CA1 区域的代表性三维图像重建。数据来自术后第 0 天的 CX3CR1-GFP 小鼠（宽度：399 µm，高度：399 µm，深度：450 µm）。与未受损的 CA1 区域（A）中可在 500 µm 深度检测到荧光小胶质细胞不同，此处仅在 200 µm 深度内可检测到小胶质细胞荧光信号。（D）图（C）中异常活化的小胶质细胞典型图像。在距玻璃底部 60 µm 深度处，厚度为 20 µm 的 GFP 图像序列最大强度投影显示，小胶质细胞的突起膨大并朝向手术暴露的组织表面延伸。整体小胶质细胞形态与图（B）所示图像不同。比例尺：100 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

figure-results-3
图3: 在体 慢性期CX3CR1-GFP小鼠小胶质细胞成像 (A) 慢性期右侧背侧CA1区植入窗的代表性外观。通过玻璃底端可清晰观察到白质纤维束的alveus，且无术后出血。在尾侧内侧区域部分可见DHC，在头侧外侧边缘部分可见LV。比例尺，1 mm。B代表性三维重建结果 体内 术后第24天对CX3CR1-GFP小鼠进行CA1区慢性成像（宽度： 511 µm，高度： 511 µm，深度： 670 µm）。与术后即刻的影像相比（图 2A），小胶质细胞表现出更均一的分布，并且由于水肿和炎症的减轻，在齿状回深层的分布可更清晰地被观察到。C) 小胶质细胞的典型图像来自（B) 具有完全恢复的分支形态的细胞在GFP图像堆栈的最大强度投影（MIP）中显示为 20 µm 100、280 和 500 µm 从手术表面。比例尺， 50 µm. 请点击此处以查看此图的放大版本。

figure-results-4
图4：在海马体各层识别过程中的线索 体内 成像及该方法的应用示例 (A) CX3CR1-GFP 小鼠慢性期海马伞部小胶质细胞的典型图像。通过GFP图像堆栈的最大强度投影（MIP）显示小胶质细胞胞体及其沿轴突通路延伸的突起 10 µm 深度处的厚度 15 µm比例尺， 50 µm. (B慢性期SO、SP和SR区域小胶质细胞的代表性图像，显示为GFP图像序列的最大强度投影（MIP） 5 µm 厚度。由于SP区域锥体神经元密集排列，小胶质细胞突起的局部密度在SP中低于周围的SO和SR区域。比例尺， 100 µm. (CCA1与DG边界处走行的粗大血管仅可通过小胶质细胞的荧光识别。对拼接的GFP图像序列进行平均强度投影， 90 µm 慢性期约深度处的厚度 500 µm 显示的是GFP信号的空缺区域，对应于较粗的血管。比例尺， 500 µm. (D（上）腹腔注射SR101后与C图相同视野的图像。比例尺， 500 µm（下）SR101注射后拼接图像的三维重建（宽度：2.60 mm，高度：1.73 mm，深度：0.69 mm）。沿CA1区与DG区边界走行的粗大血管可通过血管内SR101荧光清晰识别。E（左）CA1和DG的三维重建（宽度： 255 µm，高度： 255 µm，深度： 730 µm以及（右）由图像堆栈生成的SP中GFP和tdTomato荧光的最大强度投影（MIP） 20 µm 厚度。术前1周， 1.5 µL AAV1-CAG-FLEX-tdTomato（5.0 × 10⁵）混合物的12 vg/mL）和 AAV1-hSyn-Cre（1.0 × 109 vg/mL）被注射到CX3CR1-GFP小鼠的海马体中以稀疏标记神经元。成像在术后第0天（POD 0）进行。颗粒层（SP）和颗粒细胞层（GCL）可通过神经元胞体的位置轻松识别。比例尺， 50 µm. 请点击此处以查看此图的放大版本。

视频 1：慢性期 SO 小胶质细胞的延时成像。 对 SO 小胶质细胞进行延时成像，显示 GFP 图像序列的最大强度投影（MIP），投影厚度为 20 µm，动画速率为 28 分钟压缩为 1 秒播放。比例尺：50 µm。请点击此处下载该视频。

视频 2：慢性期小胶质细胞的延时成像。 对 SR 小胶质细胞进行延时成像，GFP 图像序列生成厚度为 20 µm 的最大强度投影（MIP），动画速率为 28 分钟压缩为 1 秒播放。比例尺：50 µm。请点击此处下载该视频。

讨论

该方法包含精细的手术操作，但如果准备得当，可在较长时间内对整个CA1区获得高分辨率图像。对多只小鼠进行的实验表明，慢性术后阶段的成像质量优于急性术后成像，且良好的图像质量可维持超过2个月。最常见的失败原因是手术过程中意外损伤CA1区，这可在术后质量检查中被发现（见步骤4）。损伤可能由以下因素引起：吸除操作造成的直接伤害、脑组织干燥、玻璃盖片施加过大的压力，或最后一步中牙科水泥的毒性作用。另一类失败原因是术后出血，可在术后1周内通过底部为玻璃的观察窗确认（见步骤6.1）。请仔细阅读实验方案，并采取一切预防措施以避免此类问题。

即使在实验室中配备了GaAsP探测器的双光子显微镜现有装置下，尝试透过皮层对背侧CA1进行成像，仍会因光的显著散射而导致分辨率明显下降。因此，为了获得足够的分辨率以观察CA1区小胶质细胞突起的运动或神经元树突棘的形成，必须去除部分覆盖的皮层，正如本方法所述。在保持高分辨率的同时减少皮层切除范围的唯一替代方法是植入中继透镜，例如梯度折射率（GRIN）透镜。在此方法中，已将GRIN透镜置入直接植入CA1上方的导管内，用于CA1的长期成像28,29。该导管的外径为1.8 mm，小于本文所用装置的3.0 mm，同时实现了与本系统相当的高分辨率（数值孔径NA；0.82，本系统的有效NA为0.88）。然而，使用GRIN透镜的方法在高分辨率观测下视场狭窄，且成像深度受限于GRIN透镜的工作距离（WD），较为有限。因此，以高分辨率在宽视场下对整个海马各层进行成像，是本文方法的独特优势。

该操作的一个局限性在于，部分切除皮层及炎症反应可能对海马体产生一些不利影响。然而，由于被切除的皮层并不直接向海马体传入信息，内嗅皮层未受损伤，且海马体本身也未受到直接伤害，因此总体评估认为海马体的功能障碍并不显著。已有若干先前研究证实，在植入海马窗后，海马体的功能（包括学习与记忆）得以保留25,26,27,30,31,32,33,34。因此，经过充分的术后恢复期后，本文所述的成像方法有望真实反映海马体的功能状态。

基于该成像技术，未来研究方向可能包括通过小胶质细胞与神经元的同步成像来检测突触修剪5，学习相关的小胶质细胞与突触的相互作用35小胶质细胞的运动性受海马神经元活动调控36以及小胶质细胞对周围炎症或组织损伤的反应7该方法还将有助于阐明神经退行性疾病的进展。例如，在阿尔茨海默病（AD）中，β-淀粉样蛋白和tau蛋白的积累与神经元细胞死亡及海马萎缩同步发生，导致认知功能障碍；已有研究报道小胶质细胞参与了这一过程。37,38. 在体 利用阿尔茨海默病小鼠模型对小胶质细胞和神经元进行慢性成像，将使我们能够监测小胶质细胞功能与阿尔茨海默病小鼠模型海马区神经元病理变化之间的相关性。

本文聚焦于小胶质细胞成像，但相同的成像方法也适用于CA1区的其他神经元和胶质细胞类型。此外，本方案目前仅限于麻醉小鼠的成像，但该技术也可拓展至清醒小鼠海马小胶质细胞的监测。在清醒小鼠实验中，由呼吸、心跳和身体运动引起的运动伪影，尤其是在远离玻璃窗口的深层海马区域，可能会存在。因此，可能需要采用适当的运动校正系统，以准确捕捉小胶质细胞的形态和动态变化。

与实验方案相关的讨论
建议根据荧光探针在时间和空间上的特异性表达需求，选择合适年龄和遗传修饰的小鼠（见步骤 1.3）。1 月龄小鼠可用于实验，但超过 2 个月龄的小鼠更易于操作，因其体型更大，对手术应激的耐受性更强。此外，在较年轻的小鼠中，外囊与海马齿状回的辐射层更难以分离。因此，在幼年小鼠中去除外囊需要更高的手术技巧（见步骤 3.4.3–4）。若小鼠在 CA1 区和 DG 区能够稳定且均匀地表达荧光蛋白，则手术评估和后续成像将更为简便（见步骤 4.7）。因此，在初次开展手术时，建议使用神经元稀疏标记的转基因小鼠，例如 Thy1-YFP 或 Thy1-GFP 小鼠39，或小胶质细胞标记的小鼠，例如 CX3CR1-GFP 小鼠24。

为了确保手术成功，麻醉方式的选择至关重要（参见步骤 2.1）。不同类型的麻醉可能导致术中脑水肿程度不同，从而影响手术难度、植入金属管的相对位置以及玻璃窗对脑组织的压迫程度。这些因素还可能影响术后海马神经元的存活情况。

在暴露海马体的吸除过程中（参见步骤 3.4），应注意以下要点，以尽量减少对脑组织的损伤并确保成像成功。通过在颅窗侧边放置出口，持续向组织表面供应无菌生理盐水。在吸除过程中，防止组织表面暴露于空气中。组织吸除的基本原理是利用液体流动将组织表面吸入吸管尖端。应避免吸管尖端直接接触组织。将施加于吸管的负压调节至最低必要水平。逐步吸除组织，并在每一步确认出血已得到控制。若出血持续时间较长，应等待其自行停止。保持从出血点附近较短距离处持续用无菌生理盐水冲洗并进行吸除。吸除组织以形成一个圆柱形空间，其尺寸应与玻璃底金属管相匹配（参见步骤 1.1）。使用 23 G 针头吸除较粗的软脑膜血管或较大的组织碎片，使用 25 G 针头吸取较小的组织残屑。

披露

所有作者均无利益冲突。

致谢

我们感谢M. Kondo和M. Matsuzaki借给我们XLPLN25XSVMP物镜。本研究得到了日本学术振兴会（JSPS）科研费资助项目中JSPS特别研究员奖励金（18J21331，R.K.）以及科学研究费补助金（20H00481、20A301、20H05894、20H05895，S.O.）、日本医疗研究开发机构（JP19gm1310003和JP17gm5010003，S.O.）以及日本科学技术振兴机构登月计划研发项目（Moonshot R&D（JPMJMS2024，授予 H.M.）

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
23 G 钝头针NIPRO02-166用于抽吸的吸头。
25 G 钝头针NIPRO02-167用于抽吸的吸头。
3 mm 皮肤打孔器（DermaPunch）Maruho213001610开颅手术工具。
30 G 针头Dentronics一次性针头 No. 30开颅手术工具。
飞秒脉冲激光器Spectra-PhysicsMaiTai Deep See波长为 920 nm 的钛宝石激光器。
双光子显微镜NikonA1R MP+用于 CA1 区成像的显微镜。
AAV1-CAG-FLEX-tdTomatoPenn Vector Core用于神经元标记的腺相关病毒。
AAV1-hSyn-CrePenn Vector Core用于神经元标记的腺相关病毒。
双光子成像用物镜OlympusXLPLN25XSVMP25× 物镜，具有长工作距离、高数值孔径和校正环
吸管器Shin-ei IndustriesKS-500抽吸工具。
铝板NarishigeCP-1用于固定头部的铝制板。
化学脱毛膏YANAGIYA用于手术部位周围脱毛的乳膏。
圆形玻璃盖玻片Matsunami Glass3φ No.1与不锈钢管粘合的盖玻片。
CX3CR1-GFP 小鼠The Jackson Laboratory008451用于小胶质细胞成像的转基因小鼠。
圆柱形不锈钢管MORISHITA定制用于植入的金属管。外径 3.0 mm，内径 2.8 mm，高度 1.7 mm。
牙科酸蚀材料Sun Medical204610461用于蚀刻颅骨。
牙科树脂粘接剂（Super-Bond C&B）Sun Medical204610555牙科水泥。
硬脑膜剥离针（Micro Points）Fine Science Tools10063-15用于去除硬脑膜的工具。
精细镊子（Dumont #5）Fine Science Tools11252-20手术工具。
镊子Bio Research CenterPRI13-3374用于消毒手术部位。
头部固定装置NarishigeMAG-2带角度调节器的小鼠头部固定装置
加热垫Bio Research CenterBWT-100A 和 HB-10手术期间为小鼠提供热支持的工具。
加热垫ALA ScientificHEATINGPAD-1 和 Hot-1安装在头部固定装置上，为小鼠提供热支持的工具。
氯胺酮（Ketalar）Daiichi Sankyo CompanyS9-001665手术期间的麻醉剂。
美洛昔康Tokyo Chemical IndustryM1959手术期间的镇痛剂。
眼用软膏Sato Pharmaceutical用于防止手术期间眼睛干燥。
聚维酮碘擦洗液Meiji Seika Pharma2612701Q1137用于消毒手术部位。
圆头微型刀具Surgistar4769手术工具。
手术刀MURANAKA MEDICAL INSTRUMENTS450-098-67一次性手术工具。
体视显微镜Leica MicrosystemsS8 APO用于手术的显微镜。
无菌生理盐水Otsuka Pharmaceutical Factory3311401A2026手术期间的冲洗液。
无菌防水垫AS ONE8-5945-01手术平台。
磺基罗丹明 101Sigma-AldrichS7635用于活体血管成像的染料。
手术单Medline IndustriesMP-0606F6T带孔手术单。
紫外光ToshibaGL15用于固化粘合剂。
紫外固化光学粘合剂ThorlabsNOA81用于将盖玻片粘合至不锈钢管的粘合剂。
赛拉嗪（Celactal 2%）Bayer手术期间的麻醉剂。

参考文献

  1. Wolf, S. A., Boddeke, H. W. G. M., Kettenmann, H. Microglia in physiology and disease. Annual Review of Physiology. 79, 619-643 (2017).
  2. Wake, H., Moorhouse, A. J., Miyamoto, A., Nabekura, J. Microglia: actively surveying and shaping neuronal circuit structure and function. Trends in Neurosciences. 36 (4), 209-217 (2012).
  3. Wu, Y., Dissing-Olesen, L., MacVicar, B. A., Stevens, B. Microglia: dynamic mediators of synapse development and plasticity. Trends in Immunology. 36 (10), 605-613 (2015).
  4. Nakayama, H., et al. Microglia permit climbing fiber elimination by promoting GABAergic inhibition in the developing cerebellum. Nature Communications. 9 (1), 2830(2018).
  5. Iida, T., Tanaka, S., Okabe, S. Spatial impact of microglial distribution on dynamics of dendritic spines. The European Journal of Neuroscience. 49 (11), 1400-1417 (2019).
  6. Kettenmann, H., Hanisch, U., Noda, M., Verkhratsky, A. Physiology of microglia. Physiological Reviews. 91 (2), 461-553 (2011).
  7. Kondo, S., Kohsaka, S., Okabe, S. Long-term changes of spine dynamics and microglia after transient peripheral immune response triggered by LPS in vivo. Molecular Brain. 4 (1), 27(2011).
  8. Benninger, R. K. P., Piston, D. W. Two-photon excitation microscopy for the study of living cells and tissues. Current Protocols in Cell Biology. 59 (1), 4-11 (2013).
  9. Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
  10. Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nature Neuroscience. 8 (6), 752-758 (2005).
  11. Tremblay, M., Lowery, R. L., Majewska, A. K. Microglial interactions with synapses are modulated by visual experience. PLoS Biology. 8 (11), 1000527(2010).
  12. Miyamoto, A., et al. Microglia contact induces synapse formation in developing somatosensory cortex. Nature Communications. 7, 12540(2016).
  13. Akiyoshi, R., et al. Microglia enhance synapse activity to promote local network synchronization. eNeuro. 5 (5), 0088(2018).
  14. Favuzzi, E., et al. GABA-receptive microglia selectively sculpt developing inhibitory circuits. Cell. 184 (15), 4048-4063 (2021).
  15. Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50 (6), 823-839 (2006).
  16. Isshiki, M., Okabe, S. Evaluation of cranial window types for in vivo two-photon imaging of brain microstructures. Microscopy. 63 (1), 53-63 (2014).
  17. Grabert, K., et al. Microglial brain region-dependent diversity and selective regional sensitivities to aging. Nature Neuroscience. 19 (3), 504-516 (2016).
  18. De Biase, L. M., et al. Local cues establish and maintain region-specific phenotypes of basal ganglia microglia. Neuron. 95 (2), 341-356 (2017).
  19. Ayata, P., et al. Epigenetic regulation of brain region-specific microglia clearance activity. Nature Neuroscience. 21 (8), 1049-1060 (2018).
  20. Böttcher, C., et al. Human microglia regional heterogeneity and phenotypes determined by multiplexed single-cell mass cytometry. Nature Neuroscience. 22 (1), 78-90 (2019).
  21. Masuda, T., et al. Spatial and temporal heterogeneity of mouse and human microglia at single-cell resolution. Nature. 566 (7744), 388-392 (2019).
  22. Paolicelli, R. C., et al. Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development. Science. 333 (6048), 1456-1458 (2011).
  23. Wang, C., et al. Microglia mediate forgetting via complement-dependent synaptic elimination. Science. 367 (6478), 688-694 (2020).
  24. Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX3CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Molecular and Cellular Biology. 20 (11), 4106-4114 (2000).
  25. Gu, L., et al. Long-term in vivo imaging of dendritic spines in the hippocampus reveals structural plasticity. The Journal of Neuroscience. 34 (42), 13948-13953 (2014).
  26. Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation. Nature Neuroscience. 13 (11), 1433-1440 (2010).
  27. Schmid, L. C., et al. Dysfunction of somatostatin-positive interneurons associated with memory deficits in an Alzheimer's disease model. Neuron. 92 (1), 114-125 (2016).
  28. Barretto, R. P., Messerschmidt, B., Schnitzer, M. J. In vivo fluorescence imaging with high-resolution microlenses. Nature Methods. 6 (7), 511-512 (2009).
  29. Attardo, A., Fitzgerald, J. E., Schnitzer, M. J. Impermanence of dendritic spines in live adult CA1 hippocampus. Nature. 523 (7562), 592-596 (2015).
  30. Sheffield, M. E. J., Dombeck, D. A. Calcium transient prevalence across the dendritic arbour predicts place field properties. Nature. 517 (7533), 200-204 (2015).
  31. Attardo, A., et al. Long-term consolidation of ensemble neural plasticity patterns in hippocampal area CA1. Cell Reports. 25 (3), 640-650 (2018).
  32. Kaifosh, P., Lovett-Barron, M., Turi, G. F., Reardon, T. R., Losonczy, A. Septo-hippocampal GABAergic signaling across multiple modalities in awake mice. Nature Neuroscience. 16 (9), 1182-1184 (2013).
  33. Lovett-Barron, M., et al. Dendritic inhibition in the hippocampus supports fear learning. Science. 343 (6173), 857-863 (2014).
  34. Hainmueller, T., Bartos, M. Parallel emergence of stable and dynamic memory engrams in the hippocampus. Nature. 558 (7709), 292-296 (2018).
  35. Parkhurst, C., et al. Microglia promote learning-dependent synapse formation through brain-derived neurotrophic factor. Cell. 155 (7), 1596-1609 (2013).
  36. Merlini, M., et al. Microglial Gi-dependent dynamics regulate brain network hyperexcitability. Nature Neuroscience. 24 (1), 19-23 (2021).
  37. Sarlus, H., Heneka, M. T. Microglia in Alzheimer's disease. Journal of Clinical Investigation. 127 (9), 3240-3249 (2017).
  38. Hansen, D. V., Hanson, J. E., Sheng, M. Microglia in Alzheimer's disease. Journal of Cell Biology. 217 (2), 459-472 (2018).
  39. Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

CA1

相关文章