一种从人间充质干细胞中分离小细胞外囊泡的简单台式过滤方法

摘要

该协议演示了如何使用简单的实验室规模台式设置分离人脐带衍生间充质干细胞的小细胞外囊泡（hUC-MSC-sEVs）。采用纳米颗粒示踪分析、BCA蛋白测定、蛋白质印迹和透射电子显微镜分别对分离的hUC-MSC-sEV的粒径分布、蛋白浓度、sEVs标志物和形貌进行了表征。

摘要

基于超速离心的过程被认为是小细胞外囊泡（sEV）分离的常用方法。然而，这种分离方法的产量相对较低，并且这些方法在分离sEV亚型方面效率低下。本研究展示了一种简单的台式过滤方法，用于分离人脐带衍生的MSC小细胞外囊泡（hUC-MSC-sEVs），通过超滤成功地从hUC-MSC的条件培养基中分离出来。采用纳米颗粒示踪分析、BCA蛋白测定、蛋白质印迹和透射电镜分别对分离的hUC-MSC-sEVs的尺寸分布、蛋白浓度、外泌体标志物（CD9、CD81、TSG101）和形貌进行了表征。分离出的hUC-MSC-sEVs的尺寸为30-200 nm，颗粒浓度为7.75 ×^{10 10} 颗粒/mL，蛋白质浓度为80 μg/mL。观察到外泌体标志物CD9，CD81和TSG101的阳性条带。本研究表明，hUC-MSC-sEVs已成功从hUC-MSCs条件培养基中分离出来，表征表明分离出的产物符合2018年细胞外囊泡研究最小信息（MISEV 2018）提到的标准。

引言

根据MISEV 2018，sEV是非复制的脂质双层颗粒，不存在功能核，尺寸为30-200 nm¹。MSC 衍生的 sEV 含有重要的信号分子，在组织再生中起重要作用，例如 microRNA、细胞因子或蛋白质。它们日益成为再生医学和无细胞疗法的研究"热点"。许多研究表明，间充质干细胞衍生的sEV在治疗不同疾病方面与间充质干细胞一样有效，例如免疫调节²，³，⁴，⁵，增强成骨⁶，糖尿病7，⁸或血管再生^9，10。随着早期试验的进展，与MSCs-EVs的临床转化相关的三个主要关键问题得到了强调:EVs的产量，EVs的纯度（不含细胞碎片和其他生物污染物，如蛋白质和细胞因子），以及分离后EV磷脂双层膜的完整性。

已经开发了各种方法来分离sEV，利用sEV的密度，形状，大小和表面蛋白¹¹。sEV分离中最常见的两种方法是基于超速离心和基于超滤的技术。

基于超速离心的方法被认为是sEV分离的金标准方法。通常采用的两种类型的超速离心技术是差分超速离心和密度梯度超速离心。然而，超速离心方法通常会导致低产量，并且需要昂贵的高速超速离心设备（100，000-200，000 × g）¹¹。此外，单独的超速离心技术在分离EV亚型（sEV和大型EV）方面效率低下，导致^沉积层不纯11。最后，密度梯度超速离心也可能非常耗时，并且需要额外的预防措施，例如添加蔗糖缓冲液以抑制加速和减速步骤¹²期间的梯度损伤。因此，超速离心通常会导致相对较低的产率，并且无法区分不同EV群体¹³，这限制了其在大规模EV制备中的应用¹¹。

EV隔离的第二种方法是通过超滤，它基于尺寸过滤。与超速离心相比，超滤相对省时且具有成本效益，因为它不涉及昂贵的设备或较长的处理时间¹⁴。因此，超滤似乎是一种比上述两种超速离心方法更有效的分离技术。分离的产品可以根据孔径和更高的产量更具体¹⁵。然而，在过滤过程中产生的额外力可能导致EV变形或喷发¹⁶。

本文提出了一种经济高效的台式方案，用于分离MSC衍生的sEV用于下游分析和治疗目的。本文描述的方法将简单的过滤方法与台式离心相结合，从hUC-MSC中分离出高产量和高质量的EV，用于下游分析，包括粒度分析，生物标志物测定和电子显微镜成像。

方案

注意:有关此协议中使用的所有材料、设备和软件的详细信息，请参阅 材料表 。

1. 人脐带间充质干细胞及培养

1. 在DMEM中以5×10^{3 /} cm² 的接种密度培养hUC-MSC，并补充有8%的人血小板裂解物和1%笔链球菌。将细胞在37°C的5%CO₂中孵育。每3天更换一次细胞培养基，以确保细胞正常生长。
2. 将细胞扩增至T175烧瓶中的传代5进行sEV分离。
   注意:收获高产量的sEV需要许多烧瓶（产量随着细胞数量的增加而增加）。

2. 从 hUC - MSC 中分离的小细胞外囊泡

1. 当培养物在第5代达到70%-80%汇合度时，用补充有1%Pen-Strep [条件培养基（CM）]的新鲜无酚红DMEM替换培养基。
   注意:仅使用基础培养基;避免补充FBS和人血小板裂解物，以避免外部sEV污染。
2. 24小时后，将CM在4°C下以200× g 离心5分钟以除去细胞碎片。通过0.22μm过滤器收集并过滤上清液，以去除大于220nm的颗粒。
3. 用 30 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 填充离心过滤装置，该盐水通过 0.2 μm 过滤器过滤。在4°C下以3，500× g 离心离心过滤单元5分钟。
4. 将过滤后的CM填充到离心过滤单元中（每个单元的最大体积为70 mL）。在4°C下以3，500× g 离心CM。
   注意:应不时监测离心的持续时间，直到溶液到达过滤器表面。
5. 将溶液丢弃在滤液溶液杯中。在4°C下以1，000×g反向离心带有浓缩收集杯的样品过滤杯2分钟。
6. 将浓缩的CM转移回离心过滤装置。将30mL过滤的PBS加入离心过滤单元中，并在4°C下以3，500×g离心该单元。
7. 将溶液丢弃在滤液溶液杯中。在过滤单元上安装浓缩收集杯，并在4°C下以1，000× g 反向离心2分钟以获得纯化的sEV。
8. 通过0.22μm注射器过滤器过滤sEV。
9. 将样品转移到新管中，并将其储存在-80°C以进行进一步分析。

3. hUC-MSC-sEV的表征

1. 纳米颗粒跟踪分析
   1. 将过滤PBS中分离的hUC-MSC-sEV稀释至20-100个颗粒/帧。
   2. 使用 1 mL 一次性注射器将 1 mL 稀释的样品引入 NTA 室。
   3. 相应地设置测量设置:将 相机级别 调整为 14级，确定 检测阈值 以包含尽可能多的颗粒，限制计数 10-100个红 叉， 蓝叉计数 限制为 5个。
   4. 对于每次测量，记录五个 1 分钟的视频，并使用检测阈值为 5 的 NanoSight 软件对其进行分析。
   5. 对每个样品进行一式三份的测量。
2. 蛋白质印迹分析
   1. 用冰冷的放射免疫沉淀测定（RIPA）裂解缓冲液裂解hUC-MSC-sEV，在4°C孵育30分钟，并在4°C下以200× g 离心5分钟。 收集上清液。
   2. 使用二辛可宁酸 （BCA） 蛋白质检测试剂盒定量蛋白质。相应地组装凝胶电泳装置，并在90 V下进行凝胶电泳，直到蛋白质到达堆叠凝胶的末端。将电压更改为200 V以分离蛋白质，直到分离凝胶结束。
   3. 进行半干转印，以15 V将蛋白质从凝胶转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上1小时。
   4. 在室温下摇床上用3%牛血清白蛋白（BSA）/Tris缓冲盐水-0.1%v / v 吐温20（TBS-T）封闭PVDF膜1小时。将PVDF膜与一抗孵育如下:小鼠抗CD 9单克隆抗体（1:500），小鼠抗CD 81单克隆抗体（1:500），小鼠抗GRP 94单克隆小鼠抗TSG 101单克隆抗体（1:500）在4°C下持续振荡过夜。
   5. 第二天，用TBS-T洗涤PVDF膜5 x 5分钟，并进一步与二抗孵育:辣根过氧化物酶偶联小鼠IgG κ结合蛋白（m-IgGκ BP-HRP）（1:5，000）在室温下搅拌1小时。
   6. 再次，用TBS-T洗涤PVDF膜五次，并使用化学发光检测试剂在电荷耦合（CCD）成像仪中可视化膜。使用 ImageJ 软件分析蛋白质的表达水平。首先，在 ImageJ 中打开图像文件（文件 |打开...通过调整亮度和对比度来提高图像质量（图片 |调整 |亮度/对比度）。调整图像，直到印迹清晰可见，单击"应用"按钮，然后将图像保存为TIFF格式（文件|另存为 |啧...
3. 透射电子显微镜
   1. 用四份过滤的PBS稀释一部分hUC-MSC-sEVs样品至总体积为10μL，并在碳涂层铜网格上孵育15分钟。
   2. 使用实验室擦拭布去除多余的样品，使其风干3分钟。
   3. 孵育 10 μL 1% 磷钨酸 （PTA） 溶液以染色样品 3 分钟。
   4. 使用实验室擦拭布去除多余的 1% PTA 溶液，使其风干 3 分钟。
   5. 使用样品进行透射电子显微镜成像。
      注意:有关总结的原理图实验步骤，请参阅 图1 。

结果

图2 显示hUC-MSC-sEV在53 nm处具有粒径模式，而其他显著的粒径峰分别为96和115 nm。NTA测量的hUC-MSC-sEVs浓度为7.75×10¹⁰ 个颗粒/mL。用BCA测定法测量的hUC-MSC-sEVs的蛋白质浓度约为80μg/ mL。

在蛋白质印迹分析中，hUC-MSC-sEVs的外泌体标志物CD9、CD81和TSG101呈阳性条带，但GRP94呈阴性（图3）。GRP94是一种内质网标记物，通常用作sEV的阴性标记物。分离的hUC-MSC-sEV在TEM下可视化以确定其大小和形态。hUC-MSCs-sEVs尺寸为~100 nm，并显示出杯状双层膜结构（图4）。

讨论

EV是间充质干细胞分泌组的重要子集之一，在正常和病理过程中起着至关重要的作用。然而，在过去十年中，尺寸范围在30至200nm之间的sEV已成为无细胞治疗的潜在工具。开发了各种技术来从间充质干细胞中分离sEV。然而，差示超速离心、超滤、基于聚合物的沉淀、免疫亲和捕获和基于微流体的沉淀具有不同的优缺点¹⁷。这些分离技术都无法实现高回收率和特异性。因此，研究人员必须根据自己的喜好，根据高回收率或高特异性选择合适的方法。

在分离MSC sEV之前，通过流式细胞术评估MSC的阳性表面标志物（CD90，CD105，CD73）和阴性标志物（CD34，CD11b，CD19，CD45和HLA-DR），如前^所述18。这项sEV研究的技术优势可能为当前情况提供解决方案。它只需要在实验室中设置一个基本的台式，以避免使用高端设备来隔离sEV。MSCs在所述方案中缺乏培养基，而不添加任何血清。这对于防止血清补充剂对EV的任何污染至关重要。然而，考虑到血清补充剂在某些情况下是不可避免的，在配制完全培养基时可以考虑使...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
40% 丙烯酰胺	Nacalai Tesque	06121-95	蛋白质印迹
95% 乙醇	Nacalai Tesque	14710-25	消毒剂
无水甲醇	Chemiz	45081	活化 PVDF 膜（蛋白质印迹）
Accutase	STEMCELL Technologies	7920	细胞解离酶
过硫酸铵	Chemiz	14475	凝胶聚合（凝胶电泳
抗 CD 81 （B-11）	Santa Cruz Biotechnology	sc-166029	sEVs 标志物
抗体 抗 TSG 101 （C-2）	Santa Cruz Biotechnology	sc-7964	sEVs 标志物
血清白蛋白	Nacalai Tesque	00653-31	PVDF 膜阻断
溴酚蓝	Nacalai Tesque	05808-61	电泳颜色标记物
Centricon Plus-70 （100 kDa NMWL）	Millipore	UFC710008	sEVs 分离
ChemiLumi One L	Nacalai Tesque	7880	化学发光检测试剂
CryoStor 冷冻培养基	Sigma-Aldrich	C3124-100ML	细胞冷冻保存
Dulbecco's 修改后的鹰's 培养基	Nacalai Tesque	08458-45	细胞培养基
ExcelBand 增强型 3 色高范围蛋白质标记	SMOBIO	PM2610	蛋白质分子量标记
超厚印迹纸	ATTO		缓冲液储备（蛋白质印迹）
甘油	Merck	G5516	蛋白质印迹化学品
甘氨酸	1st 碱基	BIO-2085-500g	缓冲液 （Western Blot）
辣根过氧化物酶偶联小鼠 IgG κ 结合蛋白 （m-IgGκBP-HRP）	Santa Cruz Biotechnology	sc-516102	二抗（Western Blot）
Human Wharton's 果冻衍生的间充质干细胞 （MSCs）	马来西亚国立大学
抗体抗 CD 9 （C-4）	Santa Cruz Biotechnology	sc-13118	sEVs 标记物
Nanosight NS300 配备 CMOS 相机、20 × 物镜、蓝色激光模块（488 nm） 和 NTA 软件 v3.2	Malvern Panalytical， UK
多聚甲醛	Nacalai Tesque	02890-45	TEM 期间的样品固定
青霉素–链霉素	Nacalai Tesque	26253-84	苯
甲基磺酰氟	Nacalai Tesque	27327-81	添加裂解缓冲液磷酸盐缓冲盐水后抑制 sEVs 样品中的蛋白酶
	Gibco	10010023	洗涤，样品稀释
聚偏二氟乙烯 （PVDF） 膜，孔径 0.45 mm 孔径	ATTO		在蛋白质转移过程中保持蛋白质（蛋白质印迹）
蛋白酶抑制剂混合物	Nacalai Tesque	25955-11	添加裂解缓冲液后抑制 sEVs 样品中的蛋白酶
蛋白质测定二辛可宁酸盐试剂盒	Nacalai Tesque	06385-00	蛋白质测量
样品缓冲溶液与 2-ME	Nacalai Tesque	30566-22	蛋白质印迹钠还原剂
氯化物	Nacalai Tesque	15266-64	蛋白质印迹化学品
十二烷基硫酸钠	Nacalai Tesque	31606-62	凝胶电泳过程中的离子表面活性剂
Tecnai G2 F20 S-TWIN 透射电子显微镜	FEI，美国
四甲基乙二胺	Nacalai Tesque	33401-72	制备凝胶
tris-base	1st Base	BIO-1400-500g	缓冲液用化学品（Western Blot）
Tween 20	GeneTex	GTX30962	用于蛋白质印迹
UVP（超视觉产品）的化学品 CCD 成像仪	用于蛋白质印迹信号检测的 CCD 成像仪