本方案展示了如何在简单的实验室台式条件下分离人脐带来源的间充质干细胞小细胞外囊泡（hUC-MSC-sEVs）。通过纳米颗粒追踪分析、BCA蛋白定量检测、蛋白质印迹以及透射电子显微镜，分别对分离得到的hUC-MSC-sEVs的粒径分布、蛋白浓度、sEVs标志物及形态进行表征。
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摘要
摘要
基于超速离心的方法被认为是分离小细胞外囊泡（sEVs）的常用方法。然而，该分离方法的得率相对较低，且在分离sEV亚型方面效率不高。本研究展示了一种简单的台式过滤方法，用于分离人脐带来源的间充质干细胞小细胞外囊泡（hUC-MSC-sEVs），通过超滤法从hUC-MSCs的条件培养基中成功分离出sEVs。采用纳米颗粒追踪分析、BCA蛋白定量、蛋白质印迹以及透射电子显微镜分别对所分离的hUC-MSC-sEVs的粒径分布、蛋白浓度、外泌体标志物（CD9、CD81、TSG101）及形态特征进行了表征。所分离的hUC-MSC-sEVs粒径为30–200 nm，颗粒浓度为7.75 × 1010 个/mL，蛋白浓度为80 µg/mL。外泌体标志物CD9、CD81和TSG101均检测到阳性条带。本研究表明，hUC-MSC-sEVs可从hUC-MSCs条件培养基中成功分离，且表征结果显示所获得的产物符合2018年细胞外囊泡研究最低信息标准（MISEV 2018）的要求。
引言
根据 MISEV 2018 标准，小细胞外囊泡（sEVs）是不具有功能性细胞核的非复制性脂质双层颗粒，大小为 30–200 nm1。间充质干细胞（MSC）来源的 sEVs 含有多种重要的信号分子，在组织再生中发挥关键作用，例如 microRNA、细胞因子或蛋白质。它们在再生医学和无细胞治疗领域正日益成为研究"热点"。大量研究表明，MSC 来源的 sEVs 在治疗多种疾病方面具有与 MSCs 相当的疗效，例如免疫调节2,3,4,5、促进成骨6、糖尿病7,8或血管再生9,10。随着早期临床试验的推进，MSC 来源细胞外囊泡（MSCs-EVs）在临床转化过程中凸显出三个主要关键问题：囊泡的产量、囊泡的纯度（无细胞碎片及其他生物污染物如蛋白质和细胞因子），以及分离后囊泡磷脂双分子层膜的完整性。
已开发出多种方法用于分离sEVs，这些方法利用了sEVs的密度、形状、大小以及表面蛋白特性11。目前在sEVs分离中最常用的两种方法是基于超速离心和基于超滤的技术。
基于超速离心的方法被认为是sEVs分离的金标准方法。常用的两种超速离心技术为差速超速离心和密度梯度超速离心。然而，超速离心方法通常产率较低，且需要昂贵的高速离心设备（100,000–200,000 × g）11。此外，仅使用超速离心技术难以有效分离EV亚型（sEVs与大型EVs），导致沉淀层纯度不高11。最后，密度梯度超速离心还可能耗时较长，并需要额外的预防措施，例如添加蔗糖缓冲液以防止在加速和减速过程中破坏梯度结构12。因此，超速离心通常导致相对较低的产率，且无法有效区分不同群体的EVs13，这限制了其在大规模EV制备中的应用11。
第二种EV分离方法是超滤法，该方法基于尺寸过滤原理。与超速离心法相比，超滤法在时间和成本上相对更有效，因为它不需要昂贵的设备或长时间的处理过程14。因此，超滤法似乎比前述两种超速离心方法更为有效的分离技术。根据孔径大小，所获得的分离产物可具有更高的特异性和得率15。然而，过滤过程中施加的额外作用力可能导致EVs发生形变或破裂16。
本文提出了一种经济高效且节省时间的台式实验方案，用于分离间充质干细胞来源的小细胞外囊泡（sEVs），以用于后续分析和治疗目的。该方法结合了简单的过滤步骤与台式离心技术，可从人脐带间充质干细胞（hUC-MSCs）中分离出高产量且高质量的细胞外囊泡，适用于粒径分析、生物标志物检测以及电子显微镜成像等后续分析。
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方案
注意：有关本实验方案中使用的所有材料、设备和软件的详细信息，请参见材料表。
1. 人脐带间充质干细胞及其培养
- 将hUC-MSCs以5 × 103/cm2的接种密度接种于DMEM培养基中，培养基中添加8%人血小板裂解液和1%青霉素-链霉素溶液。在37 °C、5% CO2条件下培养细胞。每3天更换一次培养基，以保证细胞正常生长。
- 将细胞扩增至第5代，用于sEV的分离。
注意：需要大量培养瓶才能获得较高产量的sEV（产量随细胞数量增加而增加）。
2. 人脐带间充质干细胞来源的小细胞外囊泡的分离
- 当第5代细胞培养至70%-80%融合度时，更换为新鲜的无酚红DMEM培养基，添加1%青霉素-链霉素[条件培养基（CM）]。
注意：仅使用基础培养基；避免使用胎牛血清（FBS）和人血小板裂解液补充剂，以防止外源性小细胞外囊泡（sEVs）污染。 - 24 h后，以200 × g离心CM g 在4 °C下离心5分钟以去除细胞碎片。收集上清液，并通过0.22 µm滤膜过滤，以去除大于220 nm的颗粒。
- 用经 0.2 µm 滤膜过滤的 30 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）填充离心过滤装置。在 3,500 × g 4 °C下离心5分钟。
- 将过滤后的CM加入离心过滤装置中（每个装置的最大体积为70 mL）。在3,500 × g 在 4 °C 下。
注意：离心时间应不时监测，直至溶液达到滤膜表面。 - 弃去滤液杯中的溶液。将样品滤杯倒置，与浓缩收集杯一起在4 °C、1,000 x g条件下离心2分钟。
- 将浓缩的CM转移回离心过滤装置中。向离心过滤装置中加入30 mL过滤后的PBS，并于4 °C下以3,500 × g离心。
- 弃去滤液杯中的溶液。在过滤单元上安装浓缩收集杯，于1,000 × g条件下反向离心。 g 4 °C下离心2分钟以获得纯化的sEVs。
- 通过0.22 µm针筒滤器过滤sEVs。
- 将样品转移至新管中，并于 -80 °C 保存以备后续分析。
3. hUC-MSC-sEVs 的表征
- 纳米颗粒追踪分析
- 用过滤后的 PBS 将分离的 hUC-MSC-sEVs 稀释至每帧 20–100 个颗粒。
- 使用 1 mL 一次性注射器将 1 mL 稀释后的样品注入 NTA 样品室。
- 相应设置测量参数：将相机水平调整为14 级，设定检测阈值以尽可能包含更多颗粒，同时确保计数的红色十字标记为 10–100 个，且蓝色十字标记限制在5 个以内。
- 每次测量记录五个 1 分钟的视频，并使用 NanoSight 软件（检测阈值设为 5）进行分析。
- 每个样品重复测量三次。
- 蛋白质印迹分析
- 用预冷的放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解缓冲液裂解 hUC-MSC-sEVs，在 4 °C 下孵育 30 分钟，然后在 4 °C 下以 200 × g 离心 5 分钟，收集上清液。
- 使用二辛可宁酸（BCA）蛋白质检测试剂盒 定量蛋白质。按要求组装凝胶电泳装置，以 90 V 进行电泳，直至蛋白质迁移至浓缩胶末端，随后将电压调至 200 V，继续电泳至分离胶末端。
- 采用半干转法，在 15 V 条件下电转 1 小时，将蛋白质从凝胶转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。
- 将 PVDF 膜置于含 3% 牛血清白蛋白（BSA）/Tris 缓冲盐水-0.1% v/v 吐温 20（TBS-T）的溶液中，在室温摇床上封闭 1 小时。随后加入一抗孵育：小鼠抗 CD9 单克隆抗体（1:500）、小鼠抗 CD81 单克隆抗体（1:500）、小鼠抗 GRP94 单克隆抗体、小鼠抗 TSG101 单克隆抗体（1:500），4 °C 过夜，持续振荡。
- 次日，用 TBS-T 洗涤 PVDF 膜 5 次，每次 5 分钟，再加入二抗：辣根过氧化物酶偶联的小鼠 IgG 轻链结合蛋白（m-IgGκ BP-HRP）（1:5,000），室温振荡孵育 1 小时。
- 再次用 TBS-T 洗涤 PVDF 膜 5 次，使用化学发光检测试剂在电荷耦合（CCD）成像仪中显影。使用 ImageJ 软件分析蛋白表达水平。首先在 ImageJ 中打开图像文件（文件 | 打开…），通过调整亮度和对比度（图像 | 调整 | 亮度/对比度）优化图像质量，调整至条带清晰可见后点击应用按钮，然后将图像保存为 TIFF 格式（文件 | 另存为 | TIFF…）。
- 透射电子显微镜
- 将一份 hUC-MSC-sEVs 样品与四份过滤后的 PBS 混合稀释，总体积为 10 µL，置于碳支持铜网上孵育 15 分钟。
- 用实验室擦拭纸吸去多余液体，室温下静置干燥 3 分钟。
- 加入 10 µL 1% 磷钨酸（PTA）溶液染色 3 分钟。
- 用实验室擦拭纸吸去多余的 1% PTA 溶液，室温下静置干燥 3 分钟。
- 将样品用于透射电子显微镜成像。
注：实验步骤的汇总示意图参见图 1。
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结果
图2 显示，hUC-MSC-sEVs 的粒子尺寸主峰为 53 nm，其他显著的粒子尺寸峰分别为 96 nm 和 115 nm。通过 NTA 测定的 hUC-MSC-sEVs 浓度为 7.75 × 1010 粒子/mL。采用 BCA 法测定的 hUC-MSC-sEVs 蛋白质浓度约为 80 µg/mL。
在蛋白质印迹分析中，hUC-MSC-sEVs 对外泌体标志物 CD9、CD81 和 TSG101 呈阳性条带，但对 GRP94 呈阴性（图3）。GRP94 是一种内质网标志物，通常用作 sEVs 的阴性标志物。通过透射电子显微镜（TEM）观察分离得到的 hUC-MSC-sEVs，以确定其大小和形态。hUC-MSC-sEVs 大小约为 100 nm，呈杯状双层膜结构（图4）。
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讨论
细胞外囊泡（EVs）是间充质干细胞（MSCs）分泌组中的一个重要亚群，在正常和病理过程中发挥关键作用。然而，在过去十年中，直径在30至200 nm之间的sEVs已逐渐成为无细胞治疗的一种潜在工具。目前已有多种技术用于从MSCs中分离sEVs。但是，差速超速离心法、超滤法、基于聚合物的沉淀法、免疫亲和捕获法以及基于微流控的分离法各自具有不同的优缺点17。这些分离技术中，尚无任何一种方法能够同时实现高回收率和高特异性。因此，研究人员必须根据自身需求，在高回收率或高特异性之间权衡，选择合适的方法。
在分离MSCs的sEVs之前，采用流式细胞术对MSCs进行表面标志物检测，包括阳性标志物（CD90、CD105、CD73）和阴性标志物（CD34、CD11b、CD19、CD45和HLA-DR），具体方法如前所述18。本研究在sEVs技术方面的优势可能为当前情况提供一种解决方案。该方法仅需实验室常规台面设备即可完成sEVs的分离，无需使用高端仪器。在所述方案中，MSCs采用无血清培养基进行饥饿处理，这...
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本视频的出版得到了 My CytoHealth Sdn. Bhd. 的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 40% 丙烯酰胺 | Nacalai Tesque | 06121-95 | 蛋白质印迹法 |
| 95% 乙醇 | Nacalai Tesque | 14710-25 | 消毒剂 |
| 绝对甲醇 | Chemiz | 45081 | 活化PVDF膜（Western blot） |
| Accutase | STEMCELL Technologies | 7920 | 细胞解离酶 |
| 过硫酸铵 | Chemiz | 14475 | 催化凝胶聚合（凝胶电泳） |
| 抗 CD81（B-11） | Santa Cruz Biotechnology | sc-166029 | sEVs标志物抗体 |
| 抗TSG101（C-2） | Santa Cruz Biotechnology | sc-7964 | sEVs标志物抗体 |
| 牛血清白蛋白 | Nacalai Tesque | 00653-31 | PVDF膜封闭 |
| 溴酚蓝 | Nacalai Tesque | 05808-61 | 电泳彩色标记物 |
| Centricon Plus-70（100 kDa NMWL） | Millipore | UFC710008 | sEVs 分离 |
| ChemiLumi One L | Nacalai Tesque | 7880 | 化学发光检测试剂 |
| CryoStor 冻存培养基 | Sigma-Aldrich | C3124-100ML | 细胞冻存 |
| 杜尔贝科’s 改良伊格尔’s 培养基 | Nacalai Tesque | 08458-45 | 细胞培养基 |
| ExcelBand增强型三色高分子量蛋白Marker | SMOBIO | PM2610 | 蛋白质分子量标准品 |
| 超厚印迹滤纸 | ATTO | 缓冲液储液槽（Western blot） | |
| 甘油 | 默克 | G5516 | Western blot 化学试剂 |
| 甘氨酸 | 1st Base | BIO-2085-500g | 缓冲液（Western Blot）用化学品 |
| 辣根过氧化物酶标记的小鼠 IgG kappa 结合蛋白（m-IgG）κBP-HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-516102 | 二抗（Western Blot） |
| 人类华通胶’源自果冻状物质的间充质干细胞（MSCs） | 马来西亚国民大学医学院组织工程与再生医学中心 | ||
| 小鼠抗-CD9抗体（C-4） | Santa Cruz Biotechnology | sc-13118 | sEVs 标志物抗体 |
| 配备CMOS相机和20 mW 488 nm激光器的Nanosight NS300 × 物镜，蓝色激光模块（488 纳米米），NTA 软件 v3.2 | 英国马尔文帕纳科 | ||
| 甲醛 | Nacalai Tesque | 02890-45 | 透射电镜样品固定 |
| 青霉素–链霉素 | Nacalai Tesque | 26253-84 | 培养基用抗生素 |
| 苯甲基磺酰氟 | Nacalai Tesque | 27327-81 | 在加入裂解缓冲液后抑制sEVs样本中的蛋白酶活性 |
| 磷酸盐缓冲液 | Gibco | 10010023 | 洗涤，样品稀释 |
| 聚偏二氟乙烯（PVDF）膜 0.45 mm 孔径 | ATTO | 用于蛋白质转膜（Western blot）过程中固定蛋白质 | |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Nacalai Tesque | 25955-11 | 在sEVs样本中加入裂解缓冲液后，抑制蛋白酶活性 |
| 蛋白定量BCA试剂盒 | Nacalai Tesque | 06385-00 | 蛋白质浓度测定 |
| 含2-ME的样品缓冲液 | Nacalai Tesque | 30566-22 | Western blot 还原剂 |
| 氯化钠 | Nacalai Tesque | 15266-64 | Western blot 试剂 |
| 十二烷基硫酸钠 | Nacalai Tesque | 31606-62 | 凝胶电泳中的离子型表面活性剂 |
| Tecnai G2 F20 S-TWIN 透射电子显微镜 | FEI，美国 | ||
| 四甲基乙二胺 | Nacalai Tesque | 33401-72 | 制备凝胶所用化学品 |
| tris碱 | 1st Base | BIO-1400-500g | 缓冲液（Western Blot）用化学品 |
| Tween 20 | GeneTex | GTX30962 | Western 印迹试剂 |
| UVP（Ultra Vision Product）CCD 成像仪 | 用于 Western 印迹信号检测的 CCD 成像仪 |
参考文献
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