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方法文章

细胞追踪的正电子发射断层成像：细胞放射性标记方法

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DOI：

10.3791/64117

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2023年10月27日

 ,  , 
1Division of Nuclear Medicine, Department of Radiology, Mayo Clinic, 2Department of Radiology, University of Colorado Anschutz Medical Campus

本文内容

摘要

本文介绍一种使用正电子发射断层扫描（PET）放射性同位素对细胞进行放射性标记的实验方案。 89Zr (t1/2 78.4 小时），使用即用型放射性标记合成子 [89Zr]Zr-p-异硫氰酸苄基-去铁胺([89Zr]Zr-DBN）。使用 [89Zr]Zr-DBN 可实现对体内注射的放射性标记细胞进行长达7天的非侵入性追踪与PET成像。

摘要

干细胞和嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法正逐渐成为器官再生以及多种癌症免疫治疗的有前景的治疗手段。尽管这些领域已取得显著进展，但仍需进一步研究以更深入地理解治疗性细胞在活体系统中的药代动力学和药效动力学。对于无创、 体内 使用正电子发射断层扫描（PET）对细胞进行示踪，一种新型[89Zr]Zr-p-异硫氰酸苄基-去铁胺([89Zr]Zr-DBN介导的细胞放射性标记方法已得到开发，利用 89Zr (t1/2 78.4 小时）。本方案描述了一种[89Zr]Zr-DBN介导的即用型放射标记合成子，可用于直接标记多种细胞，包括间充质干细胞、谱系导向的心源性干细胞、再生肝细胞、白细胞、黑色素瘤细胞和树突状细胞。该方法可实现细胞迁移的无创PET成像，追踪时间长达给药后7天，且不影响放射标记细胞的生物学特性或功能。此外，本方案还描述了一种分步放射合成[89Zr]Zr-DBN，一种生物相容性制剂89Zr]Zr-DBN、细胞放射性标记前的准备，以及使用[Zr]Zr-DBN对细胞进行放射性标记89Zr]Zr-DBN，包含细胞成功放射性标记所需的所有复杂细节。

引言

干细胞疗法和嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法正日益受到关注，并正在积极研究用于治疗多种疾病，例如心肌衰竭1,2、视网膜变性2、黄斑变性2、糖尿病2、心肌梗死3,4,5以及癌症6,7,8,9,10。在干细胞疗法的两种可能机制中，干细胞可直接移植至病变部位以引发治疗反应，也可不黏附于病变部位，而是通过改变病变部位的微环境来启动间接治疗反应。间接治疗反应可通过释放因子改变病变部位的微环境，从而修复或治疗疾病5。这些干细胞治疗机制可通过放射性标记干细胞的无创成像进行评估。无创成像可将放射性标记细胞在病变部位的摄取情况与治疗反应相关联，从而解析直接与间接治疗反应之间的差异。

此外，基于免疫细胞的疗法正在被开发用于治疗多种癌症，包括CAR T细胞6,7,8,9,10和树突状细胞免疫疗法11,12。从作用机制上看，在CAR T细胞免疫疗法6,7,8,9,10中，T细胞被改造以表达一种表位，该表位可结合需要治疗的肿瘤上的特定抗原。这些经过改造的CAR T细胞在给药后，通过表位-抗原相互作用与肿瘤细胞表面的特定抗原结合。结合后，结合的CAR T细胞被激活，随后增殖并释放细胞因子，从而向宿主免疫系统发出信号，以攻击表达该特定抗原的肿瘤。相比之下，在树突状细胞疗法11,12中，树突状细胞被改造以在其表面呈递特定的肿瘤抗原。这些经过改造的树突状细胞在给药后会归巢至淋巴结，并与淋巴结中的T细胞结合。T细胞在与给药的树突状细胞表面的特定肿瘤抗原结合后被激活/增殖，进而启动宿主针对表达该特定抗原的肿瘤的免疫应答。因此，通过成像放射性标记的CAR T细胞和树突状细胞，可以评估给药后的CAR T细胞向肿瘤部位的迁移9,10以及树突状细胞向淋巴结的归巢11,12，从而判断免疫疗法的疗效。此外，非侵入性的细胞迁移成像有助于更深入理解治疗潜力，明确直接与间接治疗反应之间的差异，并预测和监测基于干细胞和免疫细胞疗法的治疗反应。

已探索用于细胞示踪的不同成像方式3,4,9,10,12，包括光学成像、磁共振成像（MRI）、单光子发射计算机断层扫描（SPECT）和正电子发射断层扫描（PET）。这些技术各有优缺点。其中，PET 因其定量性和高灵敏度而成为最有前景的成像方式，这对于基于成像的细胞示踪中细胞的可靠定量至关重要3,4,9,10。

正电子发射放射性同位素89Zr的半衰期为78.4小时，适用于细胞标记。它可实现对细胞迁移长达1周以上的PET成像，且可通过广泛可用的低能医用回旋加速器便捷地生产13,14,15,16,17。此外，已有商业化供应的适当功能化螯合剂——对异硫氰酸苄基去铁胺（DFO-Bn-NCS），可用于合成89Zr标记的即用型细胞标记前体化合物[89Zr]Zr-对异硫氰酸苄基去铁胺，也称为[89Zr]Zr-DBN18,19,20,21,22,23,24,25。 [89Zr]Zr-DBN介导的细胞标记原理基于细胞膜蛋白上的伯胺与[89Zr]Zr-DBN中的异硫氰酸酯（NCS）基团发生反应，形成稳定的共价硫脲键。

基于[89Zr]Zr-DBN的细胞标记与成像已被用于追踪多种不同类型的细胞，包括干细胞18,23,25、树突状细胞18、心源性干细胞19、蜕膜基质细胞20, 骨髓来源巨噬细胞20、外周血单个核细胞20、Jurkat/CAR T细胞21、肝细胞22,24以及白细胞25。以下方案提供了使用[89Zr]Zr-DBN进行细胞放射性标记的制备及操作步骤，并描述了针对特定细胞类型在放射性标记方案中可能需要的调整。为便于理解，本文所述的细胞放射性标记方法分为四个部分。第一部分介绍通过将89Zr 与DFO-Bn-NCS螯合来制备[89Zr]Zr-DBN的方法。第二部分描述制备一种可用于细胞放射性标记的生物相容性[89Zr]Zr-DBN制剂。第三部分涵盖细胞放射性标记前的预处理步骤，包括使用无蛋白的磷酸盐缓冲盐水（PBS）和HEPES缓冲的Hanks平衡盐溶液（H-HBSS）洗涤细胞，以去除可能干扰或竞争[89Zr]Zr-DBN与细胞表面蛋白上的伯胺发生反应的外源性蛋白。最后一部分提供了细胞实际放射性标记过程中的操作步骤及质量控制分析方法。

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方案

树突状细胞和黑色素瘤细胞购自商业来源18。肝细胞通过腹腔镜部分肝切除术从猪肝脏中分离获得22,24。干细胞从骨髓穿刺液中分离获得18,19,26。脂肪组织来源的干细胞来自美国梅奥诊所罗切斯特分校人类细胞治疗实验室23。人外周血白细胞来自美国梅奥诊所罗切斯特分校输血医学科提供的采集血液25。用于放射性标记的各种细胞均按照机构动物护理与使用委员会、梅奥诊所干细胞研究监督小组、输血医学研究委员会、机构生物安全委员会以及辐射安全委员会推荐的指南获取并使用。

1. [ 89Zr ]Zr-对异硫氰酸苯基去铁胺([ 89Zr ]Zr-DBN)的制备

用时：约 160–220 分钟
注意：在制备 [89Zr]Zr-DBN 时，如步骤 1.1 所述，将 89Zr 以 [89Zr]Zr-磷酸氢盐（[89Zr]Zr(HPO4)2）或 [89Zr]Zr-氯化物（[89Zr]ZrCl4）的形式分离。

  1. 分离 89母体中的 Zr 89采用一种已建立的羟肟酸树脂纯化方法13,17简而言之，首先准备一个装有约100 mg羟肟酸树脂的层析柱，用8.0 mL纯无水乙腈洗涤层析柱以活化羟肟酸树脂，随后用5.0–6.0 mL空气冲洗。然后用15 mL去离子水洗涤层析柱，再次用5.0–6.0 mL空气冲洗，接着通过2.0 mL 0.50 N HCl（痕量金属分析级），再额外用5.0–6.0 mL空气冲洗。接下来，加入含有两种组分的溶液 89Zr 和 89缓慢将Y加入羟肟酸树脂中，并洗涤未结合的物质 89用20 mL 2.0 N HCl从羟肟酸树脂中洗脱Y，随后用10 mL去离子水冲洗，并用5.0–6.0 mL空气吹扫。
    注意：空气冲洗后，洗脱 89Zr 的操作可如下所示进行。
    1. 用于洗脱 89以[Zr形式存在的Zr89Zr]Zr(HPO4)2，首先加入 0.50 mL 的 1.2 M K2HPO4/KH2PO4 缓冲液（pH 3.5）加入步骤1.1中的层析柱中，静置30分钟，以促进目标物质的释放 89Zr 作为一种[89Zr]Zr(HPO4)2 从树脂中洗脱。然后，洗脱 89用额外的 1.50 mL 1.2 M K 洗脱柱中的 Zr2HPO4/KH2PO4 缓冲液（pH 3.5）。洗脱[89Zr]Zr(HPO4)2，按照步骤 1.2、1.2.1 和 1.2.2 进行 [ 的制备89Zr]Zr-DBN 使用 [89Zr]Zr(HPO4)2，如图所示 图1.
    2. 用于获取 89Zr 作为[89Zr]ZrCl4，首先洗脱 89Zr 作为 [89Zr]Zr-草酸盐
      1. 用于洗脱 89以[形式存在的Zr89Zr]Zr-草酸盐，向步骤1.1中的层析柱加入0.50 mL的1.0 M草酸，静置1分钟，以促进释放 89Zr 作为一种[89Zr]-草酸盐从树脂中洗脱。然后，洗脱 89用额外的 2.50 mL 1.0 M 草酸（共 3.0 mL）从色谱柱中洗脱 Zr17.
      2. 转换[89Zr]Zr-草酸盐转化为[89Zr]ZrCl4 使用阴离子交换柱，方法如 Larenkov 等人所述。14首先用6.0 mL乙腈洗涤以活化柱子，随后用5.0–6.0 mL空气冲洗。然后用10.0 mL生理盐水洗涤柱子，再用5.0–6.0 mL空气冲洗一次。最后通过10.0 mL去离子水，接着用5.0–6.0 mL空气冲洗。
      3. 加载含有[的3.0 mL溶液89将 Zr]Zr-草酸盐缓慢上样至活化的阴离子交换柱中，随后用 5.0–6.0 mL 空气冲洗。然后洗涤该柱 89用50.0 mL去离子水冲洗Zr负载柱以去除未结合的草酸根离子，随后用5.0–6.0 mL空气冲洗。
      4. 用于洗脱 89以[形式存在的Zr89Zr]ZrCl4，向柱中加入0.10 mL的1.0 N HCl，静置1.0分钟，以促进释放 89Zr 作为 [89Zr]ZrCl4 从树脂中洗脱 89用额外的 0.40 mL 1.0 N HCl（共 0.5 mL）将 Zr 从柱上洗脱。干燥洗脱液中的 [89Zr]ZrCl4 置于V形小瓶中，放入加热块中 65 °C 在氮气持续气流下干燥10–30分钟。干燥后，重新溶解干燥的[89Zr]ZrCl4 在水中，并按照步骤 1.3 和 1.3.1 进行 [ 的制备89Zr]Zr-DBN 使用 [89Zr]ZrCl4，如图所示 图1.
  2. 取约 ~120 µL 的 [89Zr]Zr(HPO4)2，用1.2 M K配制2HPO4/KH2PO4 (pH 3.5)（10–25 MBq），来自步骤 1.1.1，并用约100 µL 1.0 M HEPES-KOH（pH 7.5）和约~65 µL 1.0 M K2CO3.
    1. 为获得适用于不同样本的步骤1.2.2或1.3.1所需适量的DFO-Bn-NCS 89Zr制剂，其表观比活性各不相同 89Zr，使用中和后的配方，进行一组固定体积的螯合反应89Zr]Zr(HPO4)2 或 [89Zr]ZrCl4 DFO-Bn-NCS（7.5–15 µg）。在[89Zr]Zr(HPO4)2，将螯合反应置于 37 °C 在摇床中以约550 rpm振荡60分钟。而对于[89Zr]ZrCl4，将螯合反应置于 25 °C 在约 550 rpm 摇床中反应 30 分钟。若孵育过程中或孵育结束时出现沉淀，则弃去该螯合反应液。孵育结束后，采用含 100 mM 二乙烯三胺五乙酸（DTPA，pH 7.0）的溶液作为流动相，进行放射性薄层色谱（rad-TLC）分析，以评估各反应中 DFO-Bn-NCS 的螯合效率，具体方法如下文步骤 1.5 所述。
      注意：根据螯合效率，使用步骤 1.2.2 或 1.3.1 中实现 ≥97% 螯合效率所需的最少 DFO-Bn-NCS 量，避免在中和后的 [ 制剂中出现 DFO-Bn-NCS 沉淀89Zr]Zr(HPO4)2 或 [89Zr]ZrCl4. 本文中，[89Zr]Zr-DBN 的放射化学纯度 ≥97%。
    2. 配制新鲜的5.0 mM DFO-Bn-NCS无水DMSO溶液（3.76 mg/mL），并加入 4.0 µL 5.0 mM DFO-Bn-NCS（20 nmol 或 15 µg) 至 ~285 µL 中和后的[89Zr]Zr(HPO4)2 （10-25 MBq）来自步骤1.2，并用移液器吹打混匀。螯合反应体系中终浓度的DMSO应低于总体积的2%。
  3. 取约 ~180 µL 的 [89Zr]ZrCl4 用0.1 N HCl配制的溶液（40-80 MBq，来自步骤1.1.2.4）并用约~将所得溶液中和至pH 7.5-8.025 µL 1.0 M Na2CO3.
    1. 配制新鲜的2.5 mM DFO-Bn-NCS无水二甲基亚砜（DMSO）溶液（1.88 mg/mL），并加入 4.0 µL 2.5 mM DFO-Bn-NCS（10 nmol 或 7.5 µg) 至 ~205 µL 中和后的[89Zr]ZrCl4 （40-80 MBq），来自步骤1.3。用移液器吹打混匀溶液。确保螯合混合物中终浓度的DMSO低于总体积的2%。
  4. 继续进行螯合反应 89Zr 在 37 °C 在摇床中以约550 rpm振荡60分钟，适用于[89Zr]Zr(HPO4)2，或在 25 °C 在摇床中以约550 rpm振荡30分钟，适用于[89Zr]ZrCl4.
  5. 确定 89使用100 mM DTPA（pH 7.0）作为放射性薄层色谱流动相，通过放射性薄层色谱法测定Zr的螯合效率。预期[89Zr]Zr-DBN 以显示一个 Rf 约为 0.021–0.035，[89Zr]ZrCl4 展示一个 Rf  约为 1.0，以及 [89Zr]Zr(HPO4)2 展示一个 Rf  约为 1.0。使用公式（1):
    百分比 89Zr 与 DFO-NCS 螯合形成 [89Zr]Zr-DBN = [（放射性活度在 Rf  的 [89Zr]Zr - DBN) / (放射性总和 Rf  的 [89锆-89标记的DBN和at Rf 的 [89Zr]Zr(HPO4)2 或 [89Zr]ZrCl4) ] × 100 (1)
    注意：可接受的 89通过放射性薄层色谱法（rad-TLC）测定，用于细胞放射标记的锆（Zr）螯合效率 ≥97%。建议的[89Zr]Zr-DBN 的设定依据该领域其他放射性药物所采用的标准放射化学纯度要求。参见代表性放射性薄层色谱图 补充图 S1 和 补充图 S2.

制备[89Zr]Zr-DBN示意图；同位素分离、中和、通过放射性薄层色谱分析进行螯合。
图1：[89Zr]Zr-DBN 制备示意图。 制备 [89Zr]Zr-DBN 时，先将预配制的 [89Zr]Zr(HPO4)2 或 [89Zr]ZrCl4 溶液调节 pH 至 7.5–8.0。将中和后的溶液与 DFO-Bn-NCS 共同孵育。通过放射性薄层色谱（rad-TLC）检测 89Zr 与 DFO-Bn-NCS 的螯合效率。请点击此处查看该图的放大版本。

[  89Zr ]Zr-DBN 细胞放射性标记的生物相容性制剂（图2）

耗时：约 35 分钟
注意：由于步骤 3 的细胞制备需要一定时间，建议在步骤 2 开始前约 20 分钟开始执行步骤 3，以便进行约 30 分钟的孵育。这样可在完成步骤 2 至步骤 3.2.2 后约 5–10 分钟内开始步骤 4 的细胞放射性标记。

  1. 对于由 [89Zr]ZrCl4 制备的 [89Zr]Zr-DBN 溶液，向 50.0 µL 的 [89Zr]Zr-DBN 中加入 50.0 µL 的细胞兼容性混合液，该混合液包含约 27.0 µL 的 1.2 M K2HPO4/KH2PO4 溶液（pH 3.5）和约 23.0 µL 的 1.0 M HEPES-KOH 缓冲液（pH 7.5）。将 [89Zr]Zr-DBN-细胞兼容性混合液在室温（25 °C）下孵育约 30 分钟。
    ​注：由 [89Zr]Zr(HPO4)2 制备的 [89Zr]Zr-DBN 溶液具有生物相容性，适用于细胞放射性标记，无需进行步骤 2。

用于细胞放射性标记的生物相容性[89Zr]Zr-DBN制剂流程；含试剂示意图
图2：[生物相容性制剂的制备89Zr]Zr-DBN 用于细胞放射性标记。 用于制备即用型生物相容性放射标记合成子的制剂, 加入等体积的细胞兼容性混合液，其成分为 1.2 M K2HPO4/KH2PO4 (pH 3.5) + 1.0 M HEPES-KOH 等体积混合至[89Zr]Zr-DBN。在指定条件下孵育 25 °C 约 30 分钟。 请点击此处以查看此图的放大版本。

3. 放射性标记用细胞的制备

时间：约 40–50 分钟

  1. 用胰蛋白酶处理约 12 × 106 个贴壁细胞（干细胞、黑色素瘤癌细胞、心源性干细胞、树突状细胞或肝细胞），并将细胞转移至 15.0 mL 圆锥形离心管中，在 4 °C 条件下以约 96 × g 离心 10 分钟。
    1. 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于约 500 µL PBS 中，转移至 1.5 mL 微量离心管。在 4 °C 条件下以微量离心机以约 96 × g 离心 10 分钟。
    2. 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于约 500 µL H-HBSS 中。在 4 °C 条件下以 1.5 mL 微量离心管以约 96 × g 离心 10 分钟。重复步骤 3.1.2 一次，然后进行步骤 4.1.1。
      注：H-HBSS 是指含 0.01 M HEPES（pH 8.0）的 Hanks 平衡盐溶液。
  2. 对于非贴壁细胞（例如从血液中新分离的人外周血白细胞），跳过胰蛋白酶消化步骤，直接将含有约 12 × 106 个细胞的细胞悬液在 1.5 mL 微量离心管中于 4 °C 条件下以约 96 × g 离心 10 分钟。
    1. 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于约 500 µL PBS 中，在 4 °C 条件下以 1.5 mL 微量离心管以约 96 × g 离心 10 分钟。
    2. 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于约 500 µL H-HBSS 中。在 4 °C 条件下以 1.5 mL 微量离心管以约 96 × g 离心 10 分钟。重复步骤 3.2.2 一次，然后进行步骤 4.1.1。

4. 细胞的放射性标记

时间：约 125–155 分钟

  1. 细胞放射性标记的启动（图3)
    1. 使用步骤 3.1.2 或步骤 3.2.2 中的细胞悬液制备约 ~500 µL 细胞悬液，浓度约为 ~6 × 106 细胞在 ~500 µL pH 7.5–8.0 的 H-HBSS，置于 1.5 mL 微离心管中
    2. 加入约 ~100 µL 生物相容性配方的[89步骤2中的Zr]Zr-DBN
  2. 用于放射性标记的细胞孵育（图4)
    1. 混合生物相容性配制的[89Zr]Zr-DBN 和细胞悬液，使用设置在约 ~ 的微量移液器轻轻上下吹打混合500 µL. 使用放射性活度剂量校准仪，在489设定下测量孵育管中的放射性活度 89Zr同位素16.
    2. 孵育细胞并[89Zr]Zr-DBN 混合物在摇床中以约 550 rpm 的速度于 25–37 °C 孵育30-45分钟用于细胞标记。
      注意：孵育温度将根据用于放射性标记的细胞类型而有所不同，如图所示 表1.
    3. 在步骤4.2.2孵育后，使用新配制的放射性薄层色谱溶剂（20 mM 柠檬酸钠 [pH 4.9–5.1] : 甲醇 [1:1, V:V]）对细胞放射性标记反应进行放射性薄层色谱（rad-TLC）分析。完成rad-TLC运行后，观察[89Zr]Zr-DBN 和 [89Zr]ZrCl4 左右 Rf 约 0.73-0.81 Rf = 0.01–0.02，用于放射性标记细胞。计算放射性百分比 Rf = ~0.01-0.02，使用公式（2).
      放射性活度百分比 Rf = ~0.01-0.02 = [（放射性计数在 Rf = ~0.01 - 0.02) / (各放射性总和) Rf 约 0.01 - 0.02 且 Rf = ~0.73 - 0.81) ] × 100 (2)
      注意：为了理解所观察到的峰 Rf = 约0.01-0.02且 Rf = ~0.73-0.81，参见白细胞放射性标记反应的放射性薄层色谱（rad-TLC）结果 补充图 S3.
    4. 在另一个1.5 mL微量离心管中，混合~100 µL 生物相容性配方的[89Zr]Zr-DBN 与 ~500 µL pH 7.5–8.0 的 H-HBSS，用于在步骤 4.2.5 中作为无细胞对照以进行背景校正。在与步骤 4.2.2 相同的温度和时间条件下孵育后，进行放射性薄层色谱（rad-TLC）。rad-TLC 运行结束后，检测 [89Zr]Zr-DBN 和 [89Zr]ZrCl4 大约 Rf = ~0.73-0.81。计算放射性活度的百分比 Rf = ~0.01-0.02，使用公式（3).
      放射性活度在 Rf = ~0.01-0.02 = [（放射性计数在 Rf = ~0.01 - 0.02) / (各时间点放射性总和) Rf 约 0.01 - 0.02 Rf = ~0.73 - 0.81) ] × 100 (3)
      注意：为了理解所观察到的峰 Rf 约0.01-0.02和0.73-0.81，参见无细胞对照反应的放射薄层色谱（rad-TLC）结果 补充图 S4.
    5. 通过从放射活性百分比中减去以下数值来计算有效细胞放射标记率（%）： Rf 约 0.01–0.02（来自第 4.2.4 步放射薄层色谱法测定的放射性百分比） Rf 约 0.01–0.02（来自步骤 4.2.3 的放射性薄层色谱法）
  3. 放射性标记淬灭与细胞洗涤（图5)
    1. 在4.2.5步骤中通过放射性薄层色谱（rad-TLC）确认标记反应完成后，通过加入约～进行放射性标记反应的淬灭600 µL 预冷的、适合细胞的完全培养基，或通过添加H-HBSS，如图所示 表1.
    2. 在微型离心机中以约96 × g 10 min 4 °C弃去上清液。
    3. 轻轻重悬沉淀的细胞于约 ~500 µL 预冷的培养基（DMEM + 10% 胎牛血清 + 5% 青霉素/链霉素，或 RPMI-1640 + 10% 胎牛血清 + 5% 青霉素/链霉素，或特定细胞类型的 H-HBSS，具体如图所示） 表1用移液枪轻轻吹打细胞沉淀，使其重悬，移液枪量程设为约~500 µL.
    4. 在微型离心机中以约96 × g离心细胞 g 在 4 °C 下离心 10 分钟。
    5. 重复步骤 4.3.2–4.3.4 两次，以洗去未结合的放射性物质。
    6. 将沉淀物转移至新的1.5 mL微量离心管中，干细胞使用含10%胎牛血清和5%青霉素/链霉素的DMEM，其他细胞使用H-HBSS，然后在剂量校准仪上设置为489档测量细胞沉淀的放射活性 89Zr同位素16.
    7. 在完成所有洗涤步骤后，使用公式（4).
      放射性标记效率 = [（第4.3.6步细胞沉淀中经衰变校正的放射活性）/（第4.2.1步细胞沉淀及H-HBSS中经衰变校正的放射活性）] × 1004)
    8. 为确保放射性标记细胞的质量，首先需目视检查放射性标记细胞终悬液中是否存在任何团块。若无团块，可将此终悬液用于后续步骤。若存在团块，但可通过移液或轻柔振荡重新悬浮，则应进行重悬并继续后续步骤，此情况视为通过目视检查。然而，若通过移液或轻柔振荡均无法使团块重新悬浮，则应弃去该悬液并重新开始实验。
    9. 若目视检查合格，则在放射性标记及洗涤步骤（4.3.3–4.3.7）完成后的1小时内，使用PBS配制的0.4%台盼蓝溶液进行台盼蓝排斥法活率检测，以评估放射性标记细胞的细胞活力。
      1. 进行测试时，加入 10.0 µL 0.4% 台盼蓝溶液 10.0 µL 将放射性标记和非标记的细胞悬液混合，用移液器在微量移液器设定的体积下反复吹打台盼蓝-细胞悬液 10.0 µL.
      2. 用移液器吸取约10.0 µL 吸取台盼蓝-细胞悬液混合液，立即在显微镜低倍镜下或使用自动细胞计数仪对血细胞计数板中的蓝色染色细胞数及细胞总数进行计数。根据公式（5).
        活细胞百分比 = 100 - [（蓝色染色细胞数）/（总细胞数）] × 1005)
    10. 若放射性标记细胞悬液中活细胞百分比与未标记对照组相比无变化，则可使用该放射性标记细胞；若活细胞百分比低于未标记对照组，则弃用该放射性标记细胞。

细胞放射性标记示意图：使用[89Zr]Zr-DBN进行细胞标记，生物相容性制剂过程。
图3：细胞放射性标记起始过程示意图。 将生物相容性配制的[89Zr]Zr-DBN加入用HEPES缓冲的Hanks平衡盐溶液制备的细胞悬液中，以启动细胞的放射性标记。 请点击此处查看该图的放大版本。

放射性标记过程示意图；细胞与[89Zr]Zr-DBN孵育、孵育及放射性薄层色谱分析。
图4：细胞孵育进行放射性标记的示意图。将生物相容性配制的[89Zr]Zr-DBN与细胞悬液充分混合，并在摇床上的温控加热块中孵育30-60分钟。请点击此处查看此图的放大版本。

放射性标记过程示意图；离心、测量放射性、沉淀悬浮步骤。
图5：终止放射性标记及细胞洗涤的示意图。通过加入预冷的细胞培养基或H-HBSS终止细胞的放射性标记，并在4 °C下离心。进行细胞洗涤时，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于约500 µL预冷的细胞培养基或H-HBSS中。重复弃去上清液并将细胞沉淀重悬于新鲜培养基中的步骤，以去除任何未结合的放射性标记前体分子。请点击此处查看该图的放大版本。

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结果

本文所展示的代表性结果源自先前的[89Zr]Zr-DBN合成及细胞放射性标记研究18,19,22,23,24,25。简言之，使用7.5–15 µg的DFO-Bn-NCS，在25–37 °C条件下反应约30–60分钟，可成功将89Zr与DFO-Bn-NCS形成络合物（表2）。细胞放射性标记效率在洗涤后的放射性标记细胞沉淀中测得的未校正产率范围内为20–50%（表1）18,19,

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讨论

以下是该方案中需要优化的关键步骤，以实现有效的细胞放射性标记。在方案步骤 1.2 和 1.3 中，根据所使用的 [89Zr]Zr(HPO4)2 或 [89Zr]ZrCl4 的体积，必须使用适当体积（微升）的碱；中和 [89Zr]Zr(HPO4)2 时必须使用 1.0 M K2CO3 溶液，而中和 [89Zr]ZrCl4 时必须使用 1.0 M Na2CO3 溶液，以达到 pH 7.5–8.0 的范围。在步骤 2.1 中，当 [89Zr]Zr-DBN 配方由 [89Zr]ZrCl4 制备时，必须向其中加入由 K2HPO4/KH2PO4 和 HEPES 组成的细胞相容性混合物，以提高细胞...

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披露

作者没有经济利益冲突，但均为本技术的发明人（专利号：US20210330823A1）。

致谢

本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 5R21HL127389-02、NIH 4T32HL007111-39、NIH R01HL134664 和美国能源部（DOE）资助项目 DE-SC0008947、国际原子能机构（维也纳）、梅奥诊所核医学科、放射科及梅奥诊所再生医学中心（罗切斯特，明尼苏达州）提供支持。所有插图均使用 BioRender.com 制作。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
乙腈Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USAA996-4
α最低必需培养基Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA12571063
阴离子交换柱Macherey-Nagel, Inc., Düren, Germany731876Chromafix 30-PS-HCO3 SPE 45 mg 羧tridge
锥形离心管（15 mL）Corning Inc., Glendale, AZ, USA352096Falcon 15 mL 高透明度聚丙烯（PP）锥形离心管
树突状细胞美国模式培养物集存库，Manassas, VA, USACRL-11904
DFO-Bn-NCSMacrocyclics, Inc., Plano, TX, USAB-705p-SCN-Bn-去铁胺
二甲基亚砜Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO276855
剂量校准仪Mirion Technologies (Capintec), Inc., Florham Park, NJ, USA5130-3234CRC -55tR 剂量校准仪 
Dulbecco’s 改良 Eagle’s 培养基 美国模式培养物集存库，Manassas, VA, USA30-2002
胎牛血清（FBS）美国模式培养物集存库，Manassas, VA, USA30-2020
Hanks 平衡盐溶液（HBSS）Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA14025092用于配制 H-HBSS
盐酸（痕量金属级）Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USAA508P212
黑色素瘤细胞美国模式培养物集存库，Manassas, VA, USACRL-6475
甲醇Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO34860
微量离心管Eppendorf, Hamburg, Germany30108442Protein LoBind 微量离心管
小鼠 GM-CSFR&D Systems, Inc., Minneapolis, MN USA415-ML-010
青霉素/链霉素Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA15140-122
不含 Ca2+ 和 Mg2+ 的磷酸盐缓冲液Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA10010023用于洗涤细胞
生理盐水Covidien LLC, Mansfield, MA, USA10200.9% 无菌生理盐水溶液
振荡器 Eppendorf, Hamburg, GermanyT1317Thermomixer
硅胶-放射-薄层色谱纸板 Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, USASGI0001iTLC-SG

参考文献

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