本文介绍一种使用正电子发射断层扫描（PET）放射性同位素对细胞进行放射性标记的实验方案。 89Zr (t1/2 78.4 小时），使用即用型放射性标记合成子 [89Zr]Zr-p-异硫氰酸苄基-去铁胺([89Zr]Zr-DBN）。使用 [89Zr]Zr-DBN 可实现对体内注射的放射性标记细胞进行长达7天的非侵入性追踪与PET成像。
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摘要
摘要
干细胞和嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法正逐渐成为器官再生以及多种癌症免疫治疗的有前景的治疗手段。尽管这些领域已取得显著进展，但仍需进一步研究以更深入地理解治疗性细胞在活体系统中的药代动力学和药效动力学。对于无创、 体内 使用正电子发射断层扫描（PET）对细胞进行示踪，一种新型[89Zr]Zr-p-异硫氰酸苄基-去铁胺([89Zr]Zr-DBN介导的细胞放射性标记方法已得到开发，利用 89Zr (t1/2 78.4 小时）。本方案描述了一种[89Zr]Zr-DBN介导的即用型放射标记合成子，可用于直接标记多种细胞，包括间充质干细胞、谱系导向的心源性干细胞、再生肝细胞、白细胞、黑色素瘤细胞和树突状细胞。该方法可实现细胞迁移的无创PET成像，追踪时间长达给药后7天，且不影响放射标记细胞的生物学特性或功能。此外，本方案还描述了一种分步放射合成[89Zr]Zr-DBN，一种生物相容性制剂89Zr]Zr-DBN、细胞放射性标记前的准备，以及使用[Zr]Zr-DBN对细胞进行放射性标记89Zr]Zr-DBN，包含细胞成功放射性标记所需的所有复杂细节。
引言
干细胞疗法和嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法正日益受到关注，并正在积极研究用于治疗多种疾病，例如心肌衰竭1,2、视网膜变性2、黄斑变性2、糖尿病2、心肌梗死3,4,5以及癌症6,7,8,9,10。在干细胞疗法的两种可能机制中，干细胞可直接移植至病变部位以引发治疗反应，也可不黏附于病变部位，而是通过改变病变部位的微环境来启动间接治疗反应。间接治疗反应可通过释放因子改变病变部位的微环境，从而修复或治疗疾病5。这些干细胞治疗机制可通过放射性标记干细胞的无创成像进行评估。无创成像可将放射性标记细胞在病变部位的摄取情况与治疗反应相....
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方案
树突状细胞和黑色素瘤细胞购自商业来源18。肝细胞通过腹腔镜部分肝切除术从猪肝脏中分离获得22,24。干细胞从骨髓穿刺液中分离获得18,19,26。脂肪组织来源的干细胞来自美国梅奥诊所罗切斯特分校人类细胞治疗实验室23。人外周血白细胞来自美国梅奥诊所罗切斯特分校输血医学科提供的采集血液25。用于放射性标记的各种细胞均按照机构动物护理与使用委员会、梅奥诊所干细胞研究监督小组、输血医学研究委员会、机构生物安全委员会以及辐射安全委员会推荐的指南获取并使用。
1. [ 89Zr ]Zr-对异硫氰酸苯基去铁胺([ 89Zr ]Zr-DBN)的制备
用时：约 160–220 分钟
注意：在制备 [89Zr]Zr-DBN 时，如步骤 1.1 所述，将 <....
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结果
本文所展示的代表性结果源自先前的[89Zr]Zr-DBN合成及细胞放射性标记研究18,19,22,23,24,25。简言之，使用7.5–15 µg的DFO-Bn-NCS，在25–37 °C条件下反应约30–60分钟，可成功将89Zr与DFO-Bn-NCS形成络合物（表2）。细胞放射性标记效率在洗涤后的放射性标记细胞沉淀中测得的未校正产率范围内为20–50%（表1）18,19,
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讨论
以下是该方案中需要优化的关键步骤，以实现有效的细胞放射性标记。在方案步骤 1.2 和 1.3 中，根据所使用的 [89Zr]Zr(HPO4)2 或 [89Zr]ZrCl4 的体积，必须使用适当体积（微升）的碱；中和 [89Zr]Zr(HPO4)2 时必须使用 1.0 M K2CO3 溶液，而中和 [89Zr]ZrCl4 时必须使用 1.0 M Na2CO3 溶液，以达到 pH 7.5–8.0 的范围。在步骤 2.1 中，当 [89Zr]Zr-DBN 配方由 [89Zr]ZrCl4 制备时，必须向其中加入由 K2HPO4/KH2PO4 和 HEPES 组成的细胞相容性混合物，以提高细胞.......
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披露
作者没有经济利益冲突，但均为本技术的发明人（专利号：US20210330823A1）。
致谢
本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 5R21HL127389-02、NIH 4T32HL007111-39、NIH R01HL134664 和美国能源部（DOE）资助项目 DE-SC0008947、国际原子能机构（维也纳）、梅奥诊所核医学科、放射科及梅奥诊所再生医学中心（罗切斯特，明尼苏达州）提供支持。所有插图均使用 BioRender.com 制作。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 乙腈 | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA | A996-4 | |
| α最低必需培养基 | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA | 12571063 | |
| 阴离子交换柱 | Macherey-Nagel, Inc., Düren, Germany | 731876 | Chromafix 30-PS-HCO3 SPE 45 mg 羧tridge |
| 锥形离心管（15 mL） | Corning Inc., Glendale, AZ, USA | 352096 | Falcon 15 mL 高透明度聚丙烯（PP）锥形离心管 |
| 树突状细胞 | 美国模式培养物集存库，Manassas, VA, USA | CRL-11904 | |
| DFO-Bn-NCS | Macrocyclics, Inc., Plano, TX, USA | B-705 | p-SCN-Bn-去铁胺 |
| 二甲基亚砜 | Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO | 276855 | |
| 剂量校准仪 | Mirion Technologies (Capintec), Inc., Florham Park, NJ, USA | 5130-3234 | CRC -55tR 剂量校准仪 |
| Dulbecco’s 改良 Eagle’s 培养基 | 美国模式培养物集存库，Manassas, VA, USA | 30-2002 | |
| 胎牛血清（FBS） | 美国模式培养物集存库，Manassas, VA, USA | 30-2020 | |
| Hanks 平衡盐溶液（HBSS） | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA | 14025092 | 用于配制 H-HBSS |
| 盐酸（痕量金属级） | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA | A508P212 | |
| 黑色素瘤细胞 | 美国模式培养物集存库，Manassas, VA, USA | CRL-6475 | |
| 甲醇 | Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO | 34860 | |
| 微量离心管 | Eppendorf, Hamburg, Germany | 30108442 | Protein LoBind 微量离心管 |
| 小鼠 GM-CSF | R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN USA | 415-ML-010 | |
| 青霉素/链霉素 | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA | 15140-122 | |
| 不含 Ca2+ 和 Mg2+ 的磷酸盐缓冲液 | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA | 10010023 | 用于洗涤细胞 |
| 生理盐水 | Covidien LLC, Mansfield, MA, USA | 1020 | 0.9% 无菌生理盐水溶液 |
| 振荡器 | Eppendorf, Hamburg, Germany | T1317 | Thermomixer |
| 硅胶-放射-薄层色谱纸板 | Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, USA | SGI0001 | iTLC-SG |
参考文献
- Bhawnani, N., et al. Effectiveness of stem cell therapies in improving clinical outcomes in patients with heart failure. Cureus. 13 (8), e17236(2021).
- Zakrzewski, W., Dobrzynski, M., Szymonowicz, M., Rybak, Z. Stem cells: past, present, and future.
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重印与许可
