方法文章

用于微孔退火颗粒支架的微凝胶构筑单元的微流控合成

DOI：

10.3791/64119

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2022年6月16日

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1Department of Biomedical Engineering, School of Engineering and Applied Sciences, University of Virginia, 2Department of Chemical Engineering, School of Engineering and Applied Sciences, University of Virginia

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案描述了一组用于合成微孔退火颗粒支架微凝胶构建单元的方法，该支架可用于多种再生医学应用。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

微孔退火颗粒（MAP）支架平台是颗粒状水凝胶的一个子类。它由可注射的微凝胶浆料组成，在经过二次基于光的化学交联步骤（即 退火）后，可在原位形成具有细胞尺度孔隙率的结构稳定支架。in situ MAP支架已在多种再生医学应用中取得成功，包括皮肤伤口愈合、声带增强以及干细胞递送。本文描述了以聚乙二醇（PEG）微凝胶作为构建单元制备MAP支架的合成与表征方法。这些方法包括定制退火大分子单体（MethMAL）的合成、微凝胶前体凝胶化动力学的测定、微流控装置的制备、微流控生成微凝胶、微凝胶纯化以及基本的支架表征，包括微凝胶尺寸测量和支架退火。具体而言，本文所述的高通量微流控方法可大量生产微凝胶，用于生成适用于各种预期应用（尤其是在再生医学领域）的MAP支架。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MAP支架平台是一种可注射的生物材料，完全由水凝胶微粒（微凝胶）组成，这些微粒交联后形成细胞尺度的微孔结构，可支持不依赖于材料降解的细胞迁移及整体组织整合1由于其能够快速与宿主组织整合且具有固有的低免疫原性，MAP支架平台已在多种再生医学治疗中展现出临床前应用潜力。2,3,4,5,6,7,8,9,10，包括加速皮肤伤口愈合1,3,11，再血管化脑卒中病灶空腔7，递送间充质干细胞2以及通过组织增容治疗声门闭合不全6MAP 还被证明可通过募集 M2 巨噬细胞，对宿主组织产生抗炎作用3 甚至可以调节以促进 Th2 反应 "组织修复" 免疫反应8MAP支架平台的这些优良特性使其能够拓展至多种临床应用领域。

先前报道的用于生成微凝胶以形成 MAP 支架的方法包括流动聚焦液滴微流控技术1,4,7,9、电喷雾法5,12以及批量乳化结合顶置式旋转法6,10。液滴微流控方法可生成单一分散性高的微粒，但其流速极慢，导致微粒产率较低（µL/h）。相比之下，电喷雾法和批量乳化法虽可产生大量微粒，但微粒的多分散性较高。本实验方案采用一种高通量微流控方法，基于 de Rutte 等人13的研究，制备具有高度单一分散性的微凝胶。该方法利用软光刻技术，通过光掩模制备聚二甲基硅氧烷（PDMS）微流控装置，并将其键合至玻片表面。该装置设计依赖于阶梯式乳化，以实现高产量微凝胶颗粒的生成（mL/h）。与其他技术相比，该方法所达到的单一分散性可更精确地调控孔隙率，因为单一分散的微凝胶可形成孔径更均匀的支架结构2。

本文详细阐述了合成和表征可作为MAP支架构建单元的单个微凝胶的方法，特别是针对含有聚乙二醇（PEG）主链并带有马来酰亚胺（MAL）基团的微凝胶的制备。该MAL基团可高效地与含硫醇官能团的交联剂发生迈克尔加成反应，从而实现微凝胶的凝胶化。为了将微凝胶的凝胶化过程与MAP支架的退火过程解耦，本文还介绍了如何合成一种已发表的14定制退火大分子单体MethMAL。MethMAL是一种具有甲基丙烯酰胺/马来酰亚胺双功能团的四臂PEG大分子单体。其中甲基丙烯酰胺官能团可高效参与自由基光聚合反应（用于微凝胶退火），同时在促进MAL基团发生迈克尔加成反应的条件下保持相对惰性。

此外，本文还概述了制备PDMS微流控装置、测定微凝胶凝胶动力学以及表征微凝胶尺寸的实验方案。文末部分详细描述了MAP支架退火过程，即微凝胶发生转变的阶段 原位 通过二次光引发交联步骤，将微凝胶表面共价键合，从而形成整体支架。需要注意的是，在MAP支架体系中还可采用其他不依赖光化学的退火方法，例如前文所述的酶介导退火。1总体而言，这些方法可直接使用，或与不同的水凝胶配方化学性质结合使用（例如， 基于透明质酸）以生成适用于任何应用的 MAP 支架。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 甲基丙烯酸化大分子单体的合成

注意：本方案专门用于修饰1 g PEG-马来酰亚胺，但可按比例放大以制备更大批次。

  1. 在小型玻璃烧杯中加入1 g 4臂20 kDa PEG-马来酰亚胺（PEG-maleimide）和10 mL 1×磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4），放入搅拌子。以300 rpm转速搅拌，直至PEG完全溶解（约30分钟）。
  2. 在搅拌（300 rpm）条件下，向反应体系中加入14.65 mg 2-氨基乙硫醇（2-aminoethanethiol）（巯基[SH]与马来酰亚胺[MAL]的摩尔比为0.67:1）。
    注：2-氨基乙硫醇上的巯基将通过迈克尔加成反应（Michael-type addition）连接至PEG-MAL的约三个臂上，从而在末端留下氨基。
    1. 参见以下计算2-氨基乙硫醇添加量的示例：
      化学中摩尔浓度的PEG计算公式；数学方程，用于教学。
      PEG-MAL化学计量方程，用于巯基-马来酰亚胺反应产率分析的化学计算。
      化学计量计算，展示2-氨基乙硫醇从毫摩尔（mmol）换算为毫克（mg）。
      注：为避免称量极小质量，可将100 mg 2-氨基乙硫醇溶于1 mL 1× PBS（pH 7.4）中，然后向反应体系中加入146.5 µL该溶液。
  3. 在步骤1.2完成后等待1小时10分钟，然后在另一个玻璃烧杯中，将160.1 mg 4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉氯化物（DMTMM，与PEG的摩尔比为12:1）和32.77 µL甲基丙烯酸（methacrylic acid，与PEG的摩尔比为8:1）溶于5 mL 1× PBS（pH 7.4）中，以300 rpm搅拌反应50分钟。
    注：在此步骤中，甲基丙烯酸与DMTMM反应生成高活性酯，该酯可进一步与PEG上可用的氨基发生偶联。
    1. 参见以下计算DMTMM添加量的示例：
      聚乙二醇摩尔数计算公式，展示质量与摩尔质量之比。
      使用PEG计算DMTMM浓度的方程，用于化学过程分析。
      化学换算公式，毫摩尔（mmol）转毫克（mg），DMTMM计算，基于方程的分析。
    2. 参见以下计算甲基丙烯酸添加量的示例：
      聚乙二醇摩尔数计算公式，展示质量与摩尔质量之比。
      聚合物计算公式，甲基丙烯酸与PEG的摩尔比方程，用于教学。
      甲基丙烯酸质量计算；方程展示从毫摩尔（mmol）换算为毫克（mg）。
      甲基丙烯酸体积计算方程；化学公式分析，精确测量。
  4. 将甲基丙烯酸/DMTMM溶液加入含有20 kDa PEG-MAL/2-氨基乙硫醇的烧杯中。
  5. 向烧杯中加入53.56 µL三乙胺（与甲基丙烯酸的摩尔比为1:1），继续以300 rpm搅拌过夜。用铝箔覆盖烧杯，防止灰尘和其他污染物进入。
    1. 参见以下计算三乙胺添加量的示例：
      甲基丙烯酸与三乙胺换算公式；化学中的化学计量计算。
      三乙胺计算方程；通过质量和摩尔质量确定体积。
  6. 将反应液转移至Snakeskin透析管（截留分子量：3,500 Da）中。
  7. 将透析管置于盛有1 M NaCl去离子水（DI水）的大烧杯中（液面需完全覆盖透析管），以300 rpm搅拌透析3天。每天更换1 M NaCl溶液2次，共进行6次洗涤。
  8. 在去离子水中透析6小时。每小时更换一次去离子水，共更换6次。
  9. 将反应液转移至50 mL锥形管中，并在−80 °C下冷冻。
  10. 在起始温度−70 °C、升温速率为0.01 °C/min的条件下冻干至少72小时，直至温度升至0 °C。
  11. 将25 mg MethMAL溶于700 µL氘代氯仿（chloroform-d）中，制备1H-NMR样品，并转移至核磁管中。
  12. 采集1H-NMR谱图。
    注：本实验方案中的谱图使用500 MHz核磁共振波谱仪采集，参数如下：扫描宽度 = 6,467.3 Hz，弛豫延迟 = 13.1 s，采集时间 = 5.1 s，脉冲时间 = 5.1 µs，扫描次数 = 8。
  13. 分析时，以马来酰亚胺峰（~6.76 ppm）为参考进行积分，再对两个甲基丙烯酰胺峰（~5.35 ppm和5.6 ppm）进行积分。将甲基丙烯酰胺峰面积之和除以三个峰的总面积，计算出甲基丙烯酰胺修饰臂的比例。
    注：可接受的修饰程度为67%–75%的甲基丙烯酰胺官能团取代率。MethMAL的典型1H-NMR谱图见图1。
    1. 使用方程（1）作为取代度计算公式：
      取代度公式；甲基丙烯酰胺峰与总峰面积；化学分析方程。   （1）

MethMAL 化学结构；核磁共振谱图对比，分子相互作用示意图。
图 1：MethMAL 的化学结构及其 1H-NMR 谱图。（A）化学结构：MethMAL 退火大分子单体由 20 kDa 的四臂聚乙二醇构成，其上修饰有三个甲基丙烯酰胺臂。（B）该结构在 5.36 ppm（3）和 5.76 ppm（2）处产生峰，而这些峰在 PEG-MAL 谱图中不存在；此外还有一个马来酰亚胺臂，在 6.71 ppm（1）处产生一个峰。溶剂氯仿在 7.26 ppm 处产生一个峰，样品中残留的水在 2.2 ppm 处产生一个峰（已在谱图中标注）。在 MethMAL 的核磁谱图中，马来酰亚胺峰的积分面积为 0.27，甲基丙烯酰胺峰的总面积为 0.73（0.37 + 0.36）。甲基丙烯酰胺的修饰百分比为 73%（0.73/(0.27 + 0.73)）。此图来自 Pfaff 等人14。版权所有 (2021) 美国化学会。请点击此处查看该图的放大版本。

2. 微凝胶前体凝胶动力学

注意：通过调节用于溶解凝胶前体组分的缓冲液的 pH 值，可以改变凝胶化时间。对于 PEG-马来酰亚胺水凝胶，pH 值越低，凝胶化时间通常越长，因为在较低 pH 条件下巯基阴离子浓度降低15。

  1. 预先确定聚合物、交联剂及其他凝胶前体组分的所需浓度（即., 多肽、糖胺聚糖）。将 PEG-MAL、RGD 和 MethMAL（PEG 骨架）溶解于 10x PBS（pH 1.5）中，将 MMP-2 交联剂溶解于 1x PBS（pH 7.4）中。
    注意：本实验方案中，凝胶前体溶液采用已发表的配方3，包含 45.88 mg/mL 的 4-臂 PEG-MAL（10 kDa）、0.82 mg/mL RGD、8.06 mg/mL MethMAL 和 4.62 mg/mL MMP-2 交联剂（酶可降解交联剂）。
  2. 准备一台黏度计或等效仪器，使用0.4 mm的间隙尺寸、1.0的剪切应变、1.0 Hz的频率和10,800 s的持续时间，监测储存模量和损耗模量。
    1. 安装35 mm平板转子（P35/Ti）测量头，在测量头周围使用加湿室或湿润的海绵以维持湿润的环境。
    2. 按1:1的体积比混合PEG骨架与MMP交联剂。
    3. 将400 µL凝胶前体溶液用移液器滴加到流变仪载台的中心。
    4. 缓慢将几何夹具降至载物台上，直至达到预设的0.4 mm间隙，并立即在室温下开始监测储能模量（G'）和损耗模量（G''），持续长达6小时。
      注意：当储能模量大于损耗模量时，视为开始凝胶化；当储能模量达到平台期时，视为凝胶化完成。典型的凝胶动力学曲线如图所示 图2.

凝胶化流变学曲线；模量随时间变化；G' 和 G'' 单位为 Pa；起始点和平台期已标出。
图 2：通过黏度计测定的 MAP 凝胶前驱体溶液（pH 4.5）凝胶化动力学的代表性曲线。 凝胶化始于储能模量（G'）的迅速上升，当 G' 曲线达到平台时，凝胶化完成。G'' 表示损耗模量。此图来自 Pruett 等人3。版权所有 (2021) Wiley-VCH GmBH。 请点击此处查看该图的放大版本。

3. 微流控装置的制备

注意：本方案描述了一种微流控阶梯乳化装置的器件制备方法，其设计改编自 de Rutte 等人13，如图 3A所示。然而，本方案也可用于任何刻蚀在 SU-8 晶圆上的装置设计。建议将 SU-8 硅晶圆母版的制备外包，除非具备相应的洁净室设施用于自行制备。

  1. 使用SU-8晶圆光刻掩模制备第一个聚二甲基硅氧烷（PDMS）微流控装置。
    1. 按10:1的质量比混合PDMS基础剂与固化剂，配制约200 g的PDMS（参见材料表）。
    2. 将SU-8晶圆放入培养皿中（用胶带将晶圆边缘固定在培养皿上），使微流控结构面朝上。
    3. 将PDMS倒入培养皿，使其在晶圆表面形成1–1.5 cm厚的层。将培养皿置于真空环境中以去除所有气泡。
    4. 让PDMS固化至完全硬化（室温下24小时，或60 °C下约2小时）。
    5. PDMS固化后，小心使用剃刀刀片或解剖刀沿晶圆上的微结构四周切割出一个矩形，使切割线距离微结构边缘留有0.5–1 cm的边距。
      注意：操作时切勿施加过大压力，应轻柔操作，避免损坏晶圆（例如产生裂纹或划痕）。
    6. 将刮刀插入其中一条切口，沿切口滑动，使PDMS与晶圆分离。
      注意：当PDMS与晶圆分离时，PDMS下方将开始形成一个气泡（参见图3B）。
    7. 用刮刀轻轻将PDMS矩形块从培养皿中抬起。
      注意：PDMS在晶圆上方形成的空腔即为微流控装置的模具。
  2. 使用同一SU-8晶圆光刻掩模制备后续PDMS微流控装置。
    1. 每套模具按10:1的比例混合PDMS基础剂与固化剂，配制约15–20 g PDMS。
    2. 将PDMS倒入模具中的矩形空腔，使其在晶圆上方形成5 mm厚的PDMS层。将模具置于真空环境中以去除气泡。
    3. 让PDMS完全固化（室温下24小时，或60 °C下2小时）。
    4. PDMS固化后，使用剃刀刀片或解剖刀沿矩形边缘切割PDMS。
      注意：操作时切勿施加过大压力，应轻柔操作，避免损坏（如开裂）晶圆。
    5. 将刮刀插入其中一条切口，沿切口滑动，使PDMS与晶圆分离。
      注意：当PDMS与晶圆分离时，PDMS下方将开始形成一个气泡。
    6. 使用1.5 mm活检打孔器在PDMS矩形块的两个入口和一个出口处打孔（参见图3B）。
    7. 若单个晶圆上包含多个装置，可用刮刀或刀片在各装置之间的PDMS上轻轻划痕，然后沿划痕处轻柔折叠PDMS，使其自然干净地分离。
    8. 将PDMS装置存放在无尘容器中。
  3. 将PDMS微流控装置键合至玻璃载片。
    1. 为每个PDMS微流控装置准备一片玻璃载片。使用胶带、过滤空气或异丙醇（IPA）清洗去除载片上的灰尘。确保载片完全干燥后再进行下一步操作。
    2. 将一片玻璃载片和一个PDMS装置（结构面朝上）并排放置于小型塑料托盘上（96孔板盖适用于此用途），然后放入等离子清洗仪中。关闭门和气流阀，开启真空泵。运行至少30秒后关闭。
    3. 将氧气瓶的气体管路连接至气流阀。让等离子腔体充入氧气30秒，随后关闭氧气并关闭气流阀。
    4. 开启真空泵，并将射频（RF）功率调至高档。等待腔体呈现紫粉色（参见图3B），持续30秒。
    5. 计时结束后，关闭等离子和真空泵。缓慢打开气流阀以释放真空，然后从等离子清洗仪中取出托盘。
    6. 轻柔地将PDMS装置翻转并贴合到玻璃载片上，完成键合。键合过程中可观察到PDMS透明度的轻微变化。
      注意：为获得最佳效果，建议将键合后的装置在60 °C下保存，直至使用前立即取出。
  4. 对PDMS微流控装置进行表面处理
    1. 将PFOCTS（三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷）按1:50比例稀释于Novec油中，配制表面处理液。每3–4个装置使用1 mL处理液。将液体转移至1 mL注射器中，并连接25 G针头。
      注意：本方案中使用的针头为斜面针头，操作锐器时需格外小心。如需要，也可使用钝头针。
    2. 为每个待处理装置裁剪一段10–12 cm长的Tygon管。
    3. 裁剪一段长约7 cm的PEEK管。如图4A所示，将数毫米长的PEEK管插入Tygon管末端，以防止针头刺穿Tygon管的入口。
    4. 从加热环境中取出装置，将Tygon管的非PEEK端插入水相入口孔。
    5. 将表面处理液注射器的针头插入PEEK管，并封住油相腔出口孔（参见图3B）。
    6. 缓慢将处理液注入装置，确保装置完全充满且无气泡。等待水相腔室先被填充，随后是细小通道，最后是油相腔室。将Tygon管从装置上移除。装置充满后，在室温下静置10分钟。
    7. 用5 mL注射器仅吸入油（不含硅烷），并连接25 G针头。
    8. 通过入口和出口将表面处理液从装置中抽吸出来。将Tygon管插入水相入口，将含油的注射器插入PEEK管，用油冲洗每个装置，然后将油从装置中抽吸出。
    9. 重复油冲洗操作2次。移除Tygon管。
      注意：装置现已准备就绪，可供使用。

使用PDMS进行微流控器件制备；通道示意图、水相/油相入口及制备步骤。
图3：微流控PDMS器件。（A）微流控器件设计的计算机辅助设计（AutoCAD）图示。微凝胶液滴在油相通道两侧的通道中形成，如放大插图所示。（B）PDMS器件制备流程概览。缩写：PDMS = polydimethylsiloxane。请点击此处查看该图的放大版本。

4. 微流控法制备微凝胶

  1. 预先确定聚合物、交联剂及其他凝胶前体组分的所需浓度（即., 多肽、糖胺聚糖）。将 PEG-MAL、RGD 和 MethMAL（PEG 骨架）溶于 10x PBS（pH 1.5）中，将 MMP-2 交联剂与 5 µM 生物素-马来酰亚胺溶于 1x PBS（pH 7.4）中。
    注意：本实验方案中，凝胶前体溶液采用已发表的配方3 由45.88 mg/mL 4臂PEG-MAL（10 kDa）、0.82 mg/mL RGD、8.06 mg/mL MethMAL和4.62 mg/mL MMP-2交联剂（酶可降解交联剂）组成。以下所述方法可制备约3 mL微凝胶。
  2. 通过将5%的FluoroSurfactant储备液用Novec油稀释至至少1%的浓度，配制6 mL表面活性剂溶液。将该溶液加入一支10 mL注射器中。
    注意：氟化表面活性剂与水不相溶，因此在纯化步骤的 PBS 洗涤过程中，当凝胶转变为水相时，氟化表面活性剂可被轻易去除。
  3. 剪取三段适当长度的Tygon管，以适配注射泵的高度。
  4. 剪取两段长约1英寸的PEEK管。将PEEK管的末端插入两段Tygon管的端口约几毫米，如图所示 图 4A，以防止针头刺穿Tygon管的入口。
  5. 将Tygon管的非PEEK端插入微流控装置的入口。将剩余的一段Tygon管（末端无PEEK管）插入微流控装置的出口，如图所示 图 4C.
  6. 向5 mL塑料注射器中加入至少3 mL油，并连接至25 G针头。小心将针头插入其中一个Tygon入口的PEEK管路中。用油轻轻冲洗管路和装置，从出口处用锥形管收集流出的油。对另一个Tygon入口重复上述油冲洗步骤。
  7. 将注射泵设置为所需的流速。
    注意：本实验方案中水相流速为 3 mL/h，油相流速为 6 mL/h。可能需要使用两台独立的注射泵。
  8. 将含有表面活性剂的注射器通过25 G针头连接至油相入口（参见 图 4A并轻轻加入足量油以润洗管路和微流控装置的油相通道。
  9. 设置好装置和油相入口后，将0.5 mL油加入一支新的5 mL注射器中，该注射器将用于装载凝胶前体溶液。加入少量油的目的是在实验结束时帮助将前体溶液冲洗通过微流控装置。
  10. 在锥形管中，加入1.5 mL PEG主链溶液和1.5 mL交联剂溶液。涡旋振荡30 s，迅速将混合的凝胶前体溶液转移至5 mL注射器中。
  11. 将装有凝胶前体溶液的注射器通过25 G针头连接至水相入口。轻轻推动注射器，加入足量溶液以润洗管路和水相通道。
  12. 将注射器夹紧在相应的注射泵上并按压 运行 （参见 图4B确保水相和油相通道中均有液体流动。
    注意：建议使用显微镜观察PDMS装置内微凝胶的形成。
  13. 观察来自通道的均匀大小的颗粒（参见 图4D)。从出口处收集微凝胶至锥形管中。

用于液滴生成与分析的微流控装置，包含注射泵、显微镜及示意图。
图 4：微流控装置示意图。（A）描绘将PEEK管（上方）和Tygon管连接至注射器（下方）上25 G针头的方法。（B）包含注射泵、管路、微流控芯片和显微镜的微流控实验装置。（C）微流控芯片装置的实际图像，具有两个入口（水相和油相）和一个出口。（D）微流控芯片的示意图，以及在阶梯乳化装置的通道中预期形成的微凝胶的代表性明场图像。请点击此处查看该图的放大版本。

5. 微凝胶的纯化与灭菌

  1. 凝胶完成后（通过凝胶动力学表征中储存模量达到平台期的时间确定），使用移液器小心地从管底去除油相（参见图5）。将废液弃置于含氟废物的适当废液容器中。
    注意：可通过在收集管中加入有机可溶性碱（例如三乙胺）来加速凝胶过程，但需注意强碱的加入可能导致未反应的马来酰亚胺发生水解。若需在凝胶后通过过量马来酰亚胺对微凝胶进行功能化修饰，请勿添加三乙胺。
  2. 向微凝胶收集管中按1:1比例加入更多油相。通过轻轻倒置收集管进行混合。切勿涡旋振荡。
  3. 让收集管静置约5分钟，使两相充分分离。观察底部为油相，顶部为水相（即微凝胶）（参见图5）。
  4. 至少再重复油相洗涤2次。
  5. 按1:1比例向凝胶中加入更多油相，并按4:1（PBS:凝胶）的比例加入1× PBS。反复倒置数次以混匀。为分离各层，将管子在约2,000 ×g条件下离心约30秒。观察管底为油相，中间为凝胶，顶部为PBS（参见图5）。
  6. 用移液器去除油相，并弃置于废液容器中。
    注意：不要去除PBS。若原始收集管为15 mL，可换用更大的锥形管继续洗涤。
  7. 再重复油相和PBS洗涤至少2次。最终洗涤时观察凝胶由不透明变为透明（如图5所示），表明表面活性剂已被去除，凝胶已进入PBS相。
  8. 去除所有油相。不要从锥形管中去除PBS。
  9. 在化学通风橱中，使用玻璃移液管向管中加入与PBS等体积的己烷。涡旋振荡锥形管30秒或直至充分混匀。在4,696 × g条件下离心5分钟。
  10. 分层后，观察顶部为己烷层，中间为PBS层，底部为凝胶（参见图5）。去除上层己烷并弃置于有机废液容器中。吸除PBS层。
  11. 至少再重复己烷和PBS洗涤2次，或直至凝胶几乎呈半透明状（参见图5）。再用PBS洗涤1次，以去除残留的己烷。在4,696 ×g条件下离心5分钟。吸除PBS层时注意不要扰动凝胶沉淀。
    1. 为封端或淬灭微凝胶中任何未反应的马来酰亚胺，配制100 mM的N-乙酰-L-半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine）1× PBS溶液，并将其加入凝胶中。置于37 °C旋转仪上过夜，随后用PBS多次洗涤以去除未反应的N-乙酰-L-半胱氨酸。
    2. 如需长期保存（最长1年），将微凝胶重悬于70%异丙醇（IPA）中，并在4 °C保存，以防止细菌在微凝胶上生长。
    3. 为对微凝胶进行灭菌，在生物安全柜中按4:1（v/v）比例向凝胶中加入70% IPA。涡旋振荡30秒，然后在4,696 × g条件下离心5分钟。在生物安全柜中吸除凝胶沉淀上的IPA上清液。再进行2次IPA洗涤，随后进行3次无菌1× PBS洗涤。
      注意：在将凝胶用于细胞或动物实验前，必须完全去除所有IPA。

凝胶纯化过程示意图，显示通过PBS、油、正己烷洗涤逐步提高澄清度。
图5：微凝胶纯化流程概览。 缩写：PBS = 磷酸盐缓冲盐水；IPA = 异丙醇。 请点击此处查看该图的高清版本。

6. 微凝胶尺寸表征

注意：建议将微凝胶颗粒在 37 °C 的 1× PBS 中平衡过夜，使其溶胀至最终直径后再进行粒径测定。

  1. 观察凝胶微粒。
    1. 以 4,696 × g 离心 MAP 凝胶 5 分钟，吸除上清液。
    2. 使用正向置换移液器，从凝胶沉淀中取出 5 µL 微凝胶，加入 1 mL PBS 中稀释至微型离心管内（1:200 稀释）。根据需要调整稀释比例。
      注：在配制凝胶前体溶液时，可加入 5 µM 生物素-马来酰亚胺，并以此替代荧光染料标记微凝胶。在此情况下，可按 1:300 稀释比例（从 1 mg/mL 储液）加入链霉亲和素-荧光染料。成像前需孵育链霉亲和素至少 15 分钟。
    3. 使用正向置换移液器，将 100 µL 稀释后的微凝胶转移至透明 96 孔板的孔中。
    4. 使用宽场或共聚焦显微镜，以 10 倍物镜观察微凝胶。采集微凝胶图像用于分析。
    5. 代表性共聚焦图像参见 图 6。
  2. 使用 ImageJ 进行微粒尺寸分析
    1. 在 ImageJ 中打开显微镜获取的图像文件。
    2. 选择 分析 | 设置标尺，并根据显微镜物镜设置图像标尺。
    3. 选择 图像 | 类型 | 8 位。
    4. 选择 图像 | 调整 | 阈值，然后从下拉框中选择“Otsu”自动阈值选项。
    5. 点击 分析 | 设置测量，选择 Feret 直径 和 仅限阈值范围。
    6. 点击 分析 | 分析颗粒，输入微凝胶预期的面积大小范围（以像素²为单位，以排除小碎片被分析）。将圆形度设置为 0.75–1.00，并选择 显示 | 轮廓。勾选 显示结果 和 排除边缘颗粒。
      注：圆形度形状滤波器可排除图像边缘的微凝胶，避免其导致直径测量不准确。
    7. 运行 分析颗粒 模块。
    8. 等待输出结果，即每个颗粒的 Feret 直径，并将这些结果导出至电子表格中。
    9. 本方案中，通过计算多分散性指数（PDI）以评估微凝胶尺寸的异质性。需分析至少 100 个微凝胶以定义群体：PDI 范围为 1.00–1.05 时定义为单分散群体，PDI 大于 1.05 时定义为多分散群体。使用公式（2）、公式（3）和公式（4）计算 PDI，如下所述。
      微凝胶数均直径公式，Σ 方程，颗粒尺寸分析，教学图示。 （2）
      微凝胶重均直径公式，Σ 加权 d²/d 求和，分析化学。 （3）
      PDI 公式 PDI=Dw/Dn，用于科研与实验中的聚合物分布分析。 （4）

微凝胶分析过程：荧光成像、阈值处理、颗粒轮廓、透射光、结果。
图6：微凝胶的代表性图像。（A）微凝胶群体A的荧光共聚焦图像，（B）经阈值处理后的微凝胶图像，以及（C）ImageJ分析后的颗粒轮廓。（D）微凝胶群体B的荧光共聚焦图像，（E）微凝胶的透射光图像（微凝胶几乎透明）。（F）本实验方案中所述ImageJ分析的代表性结果。两个微凝胶群体均表现出相对均一的PDI值。两组微凝胶均在3 mL/h的水相流速和6 mL/h的油相流速下合成。然而，微凝胶尺寸的差异源于微流控装置台阶尺寸的不同。例如，微凝胶群体A使用通道台阶尺寸为11 µm的微流控装置合成，而微凝胶群体B则在台阶尺寸为40 µm的装置中合成。比例尺 = 100 µm。缩写：PDI = 多分散指数。请点击此处查看该图的放大版本。

7. 微孔退火颗粒（MAP）支架的退火

  1. 在1× PBS（pH 7.4）中配制2 mM的二苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂（LAP）储备液。
  2. 将LAP储备液用1× PBS稀释至0.2 mM，体积与凝胶体积相等。若将LAP光引发剂用于细胞实验或动物实验，使用前务必对溶液进行灭菌处理。
  3. 以4,696 × g 离心5分钟，沉淀MAP凝胶，并吸除上清液。
  4. 使用正向置换移液器，将所需体积的凝胶转移至微量离心管中。
  5. 按1:1的体积比向凝胶中加入0.2 mM LAP（最终LAP浓度为0.1 mM）。
  6. 涡旋混合物，并在避光条件下孵育至少15分钟。
  7. 以18,000 × g 离心5分钟，使凝胶沉淀。
  8. 小心移除凝胶沉淀上的上清液。
  9. 使用正向置换移液器将MAP凝胶转移至目标位置。
  10. 对样品施加聚焦光（365 nm，8.66 mW/cm2）照射113秒，以完成支架的退火。
    注意：113秒的退火时间是基于先前发表的0.1 mM LAP浓度优化所得14，但对于不同浓度的光引发剂，可能需要进一步优化。

光介导退火过程；聚合示意图；三维显微成像结果，结构分析。
图7：MAP支架的退火过程。（A）MAP支架退火过程示意图。当存在光引发剂并暴露于光照时，MethMAL大分子单体上的甲基丙烯酰胺功能基团发生光引发“点击”聚合反应，从而使微凝胶表面相互连接。（B）双光子显微镜图像的三维重建图（Imaris），显示退火形成的三维饼状结构的MAP微凝胶（绿色），其孔隙中包含葡聚糖（红色）。（C）双光子显微镜图像的三维重建图（Imaris），显示经荧光标记的70 kDa葡聚糖（红色）灌注后MAP支架的孔隙结构。比例尺 = （B）100 µm，（C）70 µm。缩写：MAP = 微孔退火颗粒；MethMAL = 定制退火大分子单体。请点击此处查看该图的放大版本。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本实验方案的目的是概述合成用于MAP支架的微凝胶构建单元所需的所有步骤。MethMAL退火大分子单体具有高度选择性和高效性，并且可与多种聚合物主链兼容14。为确保高效的退火效率，必须使20 kDa PEG-马来酰亚胺中至少67%–75%被甲基丙烯酰胺功能基团修饰。修饰百分比最简便的测定方法是分析1H-NMR谱图中的峰，如图1所示。通过黏度计测定的凝胶动力学是每种凝胶配方需考虑的重要指标。本方案采用含有MAL基团的PEG主链作为凝胶前体溶液，该基团可高效地与硫醇功能化的交联剂反应，从而实现微凝胶的凝胶化。然而，多种水凝胶化学体系均可通过本文所述的高通量微流控方法制备微凝胶。凝胶化起始时间将有助于确定微流控微凝胶生成过程的持续时间。建议选择能够在30分钟（图2）至2小时之间引发凝胶化的凝胶前体pH值。

如果凝胶时间过快，凝胶前体溶液将在微流控装置内开始聚合，导致通道堵塞。此外，需要注意的是，改变巯基化配体的浓度（例如., RGD）可能会影响凝胶过程中的网络形成，可能需要通过调整配方来加以考虑。微流控装置的制备步骤可能较为繁琐，但文中展示了成功键合装置的代表性结果。 图3本方案采用一种高通量、并行化、阶梯式乳化微流控装置，该装置改编自 de Rutte 等人的设计。13，硅晶圆的制备已外包给一家微流控技术公司。然而，本方案中所述的步骤可适用于在SU-8硅晶圆光刻掩模上刻蚀的任何装置设计。需要注意的是，在器件制备过程中，必须优化光刻掩模上通道的台阶尺寸，因为它将影响微凝胶颗粒的大小。

微流控生成微凝胶的流速应根据凝胶化时间、期望的颗粒尺寸以及微流控装置设计等因素，针对每种凝胶配方进行优化。若使用高通量装置，水相的流速最高可达 5 mL/h。图 4B 展示了本实验方案中所用高通量装置的设置。若装置运行正常，微凝胶的形成情况应与 图 4D 所示相似。在纯化前，微凝胶呈不透明状。完成各种油相、PBS 和正己烷洗涤后，凝胶应呈现如 图 5 中代表性图像所示的透明外观。若将荧光染料掺入微凝胶中，纯化后的产品可能带有轻微颜色，但仍应接近半透明状态。纯化并溶胀后，微凝胶的尺寸应高度均一，多分散系数（PDI）介于 1.00 至 1.05 之间，如 图 6 所示。可使用多种光引发剂对 MAP 支架进行光退火处理。若使用本文所述 LAP 以外的替代光引发剂，必须如先前所述方法确定其退火动力学14。此外，只要光源与所用光引发剂相匹配，可采用多种光源进行光退火。必须确保对光源进行校准和聚焦。退火时间与光强可能需要根据凝胶配方和光引发剂浓度进行优化。本实验方案中所述的退火方法可用于体外（in vitro）和体内（in vivo）研究。退火后，微凝胶将形成多孔支架结构，可通过双光子显微镜观察（图 7B-C）。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案描述了合成与表征微凝胶的方法，这些微凝胶是多孔退火颗粒（MAP）支架的基本构建单元。本方案采用高通量微流控技术，可制备大量均一的微凝胶，而其他方法难以实现这一目标，例如流动聚焦式微流控1,4,7,9（单一分散性高，产率低）、批量乳化法6,10以及电喷雾法5,12（单一分散性低，产率高）。通过本方案所述方法，可制备出单一分散的微凝胶，用于构建适用于多种再生医学应用（如细胞递送、伤口愈合）的MAP支架。

本方案的关键步骤是制备PDMS微流控装置。如果装置制备不当，可能会对微凝胶的形成及其单分散性产生不利的下游影响。在PDMS固化前应避免引入杂质（如气泡、灰尘），因为这些杂质可能堵塞通道并显著影响微凝胶的形成。为尽可能减少此类问题，建议使用胶带去除灰尘，将装置存放在无尘容器中，并尽可能在无尘环境的通风橱内操作。此外，建议将装置在60 °C下保存，以获得表面处理的最佳效果。

浇注PDMS装置时，应保持均匀的厚度，其厚度应等于或小于活检打孔器的长度。如果装置过厚，活检打孔器将无法完全穿透。使用活检打孔器打孔或插入管路时，必须避免撕裂PDMS装置的入口/出口。PDMS装置出现撕裂会导致入口/出口处泄漏，进而造成凝胶前体溶液流失。若PDMS装置发生泄漏，最佳解决方案是尽快更换为新的装置。

进行等离子体处理时，使用纯氧气并处理30秒，可获得PDMS与玻璃载片粘附的最佳效果。如果器件未能正确键合（即等离子体处理后PDMS仍可从玻璃载片上剥离），应仔细检查等离子体处理仪是否正常工作，并确认器件和载片是否已彻底清洗。正确选择硅烷表面处理剂也至关重要；为获得最佳效果，PDMS器件应在使用前立即进行表面处理。其他表面处理方法，如化学气相沉积，也可使用。

另一个关键步骤是正确使用PDMS微流控装置进行微凝胶的形成。建议使用至少2:1的流速比（本方案采用6 mL/h的油相流速和3 mL/h的水相流速），但可根据需要调整以获得理想的微凝胶尺寸。微凝胶前体溶液的pH值也是优化过程中一个重要的参数，需加以控制以防止装置堵塞。在迈克尔加成化学反应中，磷酸盐缓冲液（PBS）可加速硫醇盐的形成，本方案中所用的PBS浓度在微流控装置中可实现最佳的微凝胶凝胶化效果。启动注射泵后，微流控通道中可能会出现少量气泡，但数分钟后应会达到平衡。建议使用显微镜监测微凝胶的形成过程。如果流动状态与本视频中显示的不一致，和/或部分通道产生较大颗粒，则问题很可能出在表面处理步骤。最佳解决方案是更换为 freshly 经过表面处理的新装置。

如果微凝胶出现聚结现象，可能是由于氟化表面活性剂浓度不足所致。建议的解决方案是增加油相中表面活性剂的质量百分比（wt%）。然而，使用高浓度表面活性剂的一个局限性在于，其在后续纯化步骤中更难被完全去除。建议微流控装置仅使用一次，但如果在使用后立即用Novec油冲洗以去除可能在装置内发生凝胶化并堵塞通道的水相溶液，则装置可重复使用。虽然单个微流控装置即可实现高通量的微凝胶生产（mL/h），但通过并行使用多个微流控装置，可进一步放大生产速率。

MAP支架组装的退火步骤依赖于使用光引发的自由基聚合光引发剂，可根据预期应用选择合适的光引发剂。例如，LAP光引发剂具有较快的退火时间（<使用长波紫外光时，对细胞活力影响极小，照射时间约为30秒 体外14然而，该波长的光会被组织强烈吸收16 退火效率可能较低 体内 作为 体外.

伊红Y是另一种可被可见光波长（505 nm）激活的光引发剂，其在组织中的穿透深度更大，从而增强了MAP支架在组织下方进行退火的能力。然而，伊红Y退火所需的较长光照时间可能会延长细胞暴露于自由基的时长，影响体外细胞活力in vitro14。采用这些方法可高通量地制备高度均一的微凝胶结构单元，将加速以MAP支架为核心的研究，并推动可注射多孔材料在再生医学领域的发展。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明无利益冲突。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者谨此感谢加州大学洛杉矶分校的 Joe de Rutte 及 Di Carlo 实验室，感谢他们在本研究中所用微流控装置的原始设计方面提供的帮助，以及在 PDMS 装置制备和故障排查方面的早期指导。图示示意图使用 Biorender.com 制作。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2-氨基乙硫醇盐酸盐Acros OrganicsAC153770250用于 MethMal 合成
分子量：113.61 Da
35 mm 平板转子HAAKEP35/TiHAAKE 粘度计用几何转子
4-臂 PEG-马来酰亚胺（10 kDa）NOF AMERICA CorporationSUNBRIGHT PTE-100MA用于微凝胶前体溶液
4-臂 PEG-马来酰亚胺（20 kDa）NOF AMERICA CorporationSUNBRIGHT PTE-200MA用于 MethMal 合成
分子量因批次而异
带鲁尔锁扣头的 BD 注射器Becton Dickinson一次性塑料注射器
活检打孔器MitexMLTX33-31A-P/25直径 1.5 mm
氘代氯仿Acros OrganicsAC209561000用于 MethMal 合成
准直 LED 光源ThorLabsM365LP1-C1365 nm
培养皿（15 cm）CorningCLS430599150 mm × 25 mm
DMTMM（4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉氯化物）Oakwood Chemical151882用于 MethMal 合成
分子量：276.72 Da
氟化表面活性剂Ran Technologies008-Flurosurfactant-5wtH-200GHFE7500 中含 5 wt% 的 008-氟化表面活性剂
FreeZone Triad 冷冻干燥系统Labconco7400000 系列用于 MethMal 合成
冻干机
载玻片Fisher Scientific12-550-A3普通未涂层载玻片
HAAKE Rheowin 粘度计HAAKE
ImageJ版本 1.8.0_172
KDS Legato 210 双通道注射泵Kd Scientific 
LED 驱动器ThorLabsDC2200
二苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次磷酸锂（LAP）Sigma-Aldrich900889光引发剂
甲基丙烯酸Sigma Aldrich155721用于 MethMal 合成
分子量：86.09 Da
密度：1.015 g/mL
微流控装置 SU8-Si 母版晶圆FlowJemN/A定制，经硅烷化处理
MMP-2 可降解交联剂FlowJem序列：Ac-GCGPQGIAGQDGCG-NH2
针头（25 G，斜面）BD305122长度：15.88 mm
规格：0.5 mm
Novec 75003M7100025016氟化油
氧气PraxairUN1072压缩气体
peek 管Trajan Scientific03-350-523外径 1/32"；内径 0.02"；长度 10 英尺
PFOCTS（三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷）Sigma-Aldrich448931用于表面处理
磷酸盐缓冲液Fisher BioReagantsBP3994用超纯水稀释至 1×，pH = 7.4
等离子清洗机Harrick PlasmaPDC-001-HP
剃须刀片Fisher Scientific12-640
RGD 细胞黏附肽WatsonBio Sciences序列：Ac-RGDSPGGC-NH2
Rheowin 软件HAAKE 与 HAAKE 粘度计兼容的软件
手术刀片Bard-Parker371210型号：#10
手术刀柄Bard-Parker371030型号：#3
氯化钠Fisher BioReagentsBP358-1用于 MethMal 合成
分子量：58.44 Da
Sylgard 184 硅橡胶弹性体套件DOW Chemical2065622基础剂与固化剂
三乙胺Fisher ScientificO4884-100用于 MethMal 合成
分子量：101.19 Da
密度：0.73 g/mL
Tygon 管Saint Gobain Performance PlasticsAAD04103内径：0.51 mm
外径：1.52 mm
Varian Inova 500 核磁共振波谱仪VarianNMR
位于弗吉尼亚大学生物分子磁共振中心

参考文献

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