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方法文章

构建人主动脉平滑肌细胞类器官芯片模型以模拟主动脉壁中的生物力学应变

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DOI：

10.3791/64122

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2022年7月6日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiac Surgery and Shanghai Institute of Cardiovascular Diseases, Zhongshan Hospital, Fudan University, 2Institutes of Biomedical Sciences and the Shanghai Key Laboratory of Medical Epigenetics, Shanghai Medical College, Fudan University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

在此，我们开发了一种人主动脉平滑肌细胞类器官芯片模型，用于模拟 体内 人主动脉壁平滑肌细胞的生物力学应变

摘要

传统的二维细胞培养技术与动物模型已被用于人类胸主动脉瘤和夹层（TAAD）的研究。然而，动物模型有时无法准确再现人类TAAD的特征。临床人体研究与动物实验之间存在明显物种差异，这可能阻碍治疗药物的发现。相比之下，传统的细胞培养模型难以模拟 体内 生物力学刺激。为此，近年来微加工和微流控技术取得了显著发展，为构建能够模拟生物力学微环境的类器官芯片模型提供了新的技术手段。本研究建立了一种人主动脉平滑肌细胞类器官芯片（HASMC-OOC）模型，用于模拟主动脉生物力学的病理生理参数，包括人主动脉平滑肌细胞（HASMCs）所经历的周期性应变的幅度和频率，这些参数在主动脉夹层（TAAD）中发挥关键作用。在该模型中，HASMCs的形态变得细长，排列方向垂直于应变方向，在应变条件下相较于静态常规条件表现出更强的收缩表型。这与天然人主动脉壁中细胞的取向和表型一致。此外，利用二叶主动脉瓣相关TAAD（BAV-TAAD）和三叶主动脉瓣相关TAAD（TAV-TAAD）患者来源的原代HASMCs，我们建立了BAV-TAAD和TAV-TAAD疾病模型，成功再现了TAAD中HASMC的特征。HASMC-OOC模型提供了一种新颖的 体外 一个与动物模型互补的平台，可用于进一步探索胸腹主动脉夹层（TAAD）的发病机制并发现治疗靶点。

引言

胸主动脉瘤和夹层（TAAD）是主动脉壁的局部扩张或分层，具有较高的发病率和死亡率1人主动脉平滑肌细胞（HASMCs）在胸腹主动脉瘤疾病（TAAD）的发病机制中发挥关键作用。HASMCs并非终末分化的细胞，具有高度可塑性，能够响应不同刺激而发生表型转换。2人主动脉平滑肌细胞主要受到节律性张应力作用 体内，这是调控平滑肌形态变化、分化及生理功能的关键因素之一3,4因此，在研究人主动脉平滑肌细胞（HASMCs）时，周期性应变的作用不容忽视。然而，传统的二维细胞培养无法模拟HASMCs所经历的周期性应变生物力学刺激。 体内此外，动物TAAD模型的构建并不适用于某些类型的TAAD，例如与二叶式主动脉瓣（BAV）相关的TAAD。而且，临床人体研究与动物实验之间的物种差异不容忽视，这阻碍了药物在临床实践中的转化应用。因此，迫切需要更复杂且具有生理相关性的系统来模拟 体内 主动脉疾病研究中的生物力学环境

用于生物医学研究和药物开发的动物实验成本高昂、耗时漫长，且存在伦理争议。此外，动物实验的结果往往无法准确预测人体临床试验的结果。5,6缺乏人类临床前模型以及临床试验的高失败率，导致仅有少数有效药物进入临床应用，从而推高了医疗成本7因此，迫切需要寻找其他实验模型以补充动物模型。近年来，微加工和微流控技术取得了显著发展，为建立器官芯片模型提供了新技术，弥补了传统二维细胞培养技术的不足，实现了更为真实、低成本且高效的实验体系。 体外 用于生理学研究和药物开发的模型。利用微流控装置，器官芯片可在微米尺度的腔室中培养活细胞，并施加不同刺激，以模拟组织或器官的关键功能。该系统由单个或多个微流控微通道组成，可在灌注腔室内培养单一类型细胞以模拟特定组织功能，也可在多孔膜上共培养多种细胞类型，以重建不同组织间的界面。基于微流控技术的类器官结合患者来源的细胞，具有独特优势，可弥合小鼠与人类疾病模型之间显著的物种差异，并克服传统二维细胞培养在疾病机制研究和药物发现中的局限性。随着近年来微流控技术的快速发展，研究人员已认识到其在 体外 器官芯片（OOC）模型模拟复杂 体内 生物参数8这些微流控类器官模拟 体外 生物力学环境，例如循环拉伸、剪切应力和液体压力，提供三维（3D）细胞培养环境。迄今为止，已有多种器官芯片模型被建立，用于模拟肺等器官中的生物力学刺激9，肾脏10肝脏11，肠道12，和心脏13, 但这些方法尚未被广泛应用于人类主动脉疾病的研究。

本研究中，我们介绍了一种人主动脉平滑肌细胞类器官芯片（HASMC-OOC）模型，该模型可调控施加于TAAD患者来源的原代HASMCs上的仿生机械力和节律。该芯片由三层刻有通道的聚二甲基硅氧烷（PDMS）厚板以及两片商用高柔性PDMS膜组成。HASMCs在PDMS膜上进行培养。芯片中央的通道中充满用于细胞培养的培养基。芯片的顶部和底部通道连接至真空压力供给系统，该系统可控制PDMS膜机械拉伸应变的节律和频率。HASMC-OOC可模拟HASMCs所经历的节律性应变，重现传统二维培养系统在功能上无法实现的组织或器官的生物力学微环境。凭借高分辨率、实时成像以及生物力学微环境的优势，可对活细胞的生化、遗传和代谢活动进行研究，应用于组织发育、器官生理学、疾病病因学、分子机制及生物标志物鉴定，以及心血管疾病和主动脉疾病的研究。结合组织特异性细胞和患者来源细胞，该系统可用于药物筛选、个体化医学和毒性测试。该HASMC-OOC模型为研究主动脉疾病的发病机制提供了一种新型的体外研究平台。

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方案

在复旦大学中山医院伦理委员会（编号：B2020-158）的批准下，使用人类主动脉组织样本进行原代人主动脉平滑肌细胞（HASMC）的分离。主动脉组织样本取自于复旦大学中山医院接受升主动脉手术的患者。所有患者在参与研究前均签署了书面知情同意书。

1. 人主动脉平滑肌细胞的原代分离

  1. 用无菌 PBS 清洗升主动脉的右侧区域，1 至 2 次。
  2. 使用两把眼科镊子去除组织的内膜和外膜层，保留中膜层以收获细胞。
  3. 将中膜层置于一个 10 cm 培养皿中，用剪刀剪成小块（2–3 mm），加入 5 mL 含 10% 胎牛血清和 1% 青霉素-链霉素的平滑肌细胞培养基（SMCM）。
  4. 用无菌移液滴管将小块组织转移至培养瓶中，均匀铺开；尽可能弃去培养基，然后将培养瓶倒置。
  5. 向倒置的培养瓶中加入 2 mL SMCM，放入 37 °C、5% CO2 的培养箱中孵育 1–2 小时，随后缓慢将培养瓶翻转至正置，并再加入 2 mL SMCM。
  6. 孵育 5–7 天后，更换为 4 mL 新鲜 SMCM。通常情况下，散在的平滑肌细胞约在 2 周左右开始爬出。
  7. 换液时应缓慢弃去和添加 SMCM；移动培养瓶至显微镜观察台时应轻缓运输，否则组织可能漂浮，导致细胞生长缓慢。
  8. 当细胞融合度达到约 80% 时，用 2 mL PBS 洗涤，加入 2 mL 0.25% 胰蛋白酶消化，并将细胞分种至两个新的培养瓶中，每瓶加入 4 mL 新鲜 SMCM。
  9. 通过免疫荧光分析四种平滑肌细胞特异性标志物（CNN1、SM22）来鉴定细胞身份14。

2. PDMS 芯片的制备

  1. 为了聚合PDMS，按A:B = 10:1 w/w的重量比将固化剂（B组分）加入基础剂（A组分）中，并充分混合5分钟；体积根据研究需求确定。
  2. 将制备好的PDMS凝胶置于真空抽气罐中抽气30–60分钟，保持压力低于-0.8 mPa。
    注意：压力过高会导致PDMS凝胶内部的小气泡无法充分去除，从而影响后续芯片的制备。
  3. 使用计算机辅助设计（CAD）软件设计模具，外框结构为100 mm × 40 mm × 8 mm，通道尺寸为70 mm × 6 mm × 4 mm。
  4. 使用高精度数控雕刻机定制加工三层模具。使用聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）板雕刻出模具外框和微通道，然后将其粘接到另一块PMMA板上。
  5. 将制备好的PDMS凝胶倒入具有100 mm × 40 mm × 6 mm外框和70 mm × 6 mm × 4 mm通道的模具中，随后在70 °C下交联1–2小时。
  6. 将交联后的PDMS薄片从模具上剥离，并将商用PDMS膜裁剪成100 mm × 40 mm的片状。
  7. 对已制备的三块PDMS薄片和两片PDMS膜进行5分钟的氧气等离子体处理，以活化PDMS表面。具体参数设置如下：使用空气作为工艺气体；压力设定为-100 kPa；电流设定为180–200 mA；电压设定为200 V；处理时间为5分钟。
  8. 使用1 mm打孔器在三块PDMS薄片上打孔，以形成PDMS芯片上气路和培养基微通道的进出口。
  9. 按以下顺序将三块PDMS薄片和两片PDMS膜键合在一起：气道PDMS层（顶层）– PDMS膜 – 培养基通道PDMS层（中层）– PDMS膜 – 气道PDMS层（底层）。该步骤需在体视显微镜下以4倍放大进行，确保气路微通道与培养基微通道完全对齐。
  10. 将组装好的PDMS芯片置于70 °C培养箱中处理1小时。
  11. 准备若干内径1 mm、长度3 cm的乳胶软管。将外径1 mm、长1 cm的不锈钢针插入软管一端，另一端插入鲁尔接头，制成用于连接PDMS芯片气路和培养基微通道的导管。
  12. 将制备好的导管插入PDMS芯片上气路和培养基微通道的进出口中。

3. PDMS 芯片表面处理与灭菌

  1. 使用2 mL注射器将2 mL浓度为80 mg/mL的小鼠胶原蛋白注入PDMS芯片的培养基微通道中，并在室温下孵育30分钟。
  2. 孵育结束后，用2 mL注射器从通道中移除胶原蛋白并回收。将包被有胶原蛋白的PDMS芯片置于60 °C培养箱中过夜。
  3. 将PDMS芯片放入紫外灭菌器中灭菌超过1小时。将灭菌后的PDMS芯片放置于超净工作台上，以备细胞实验使用。

4. 在PDMS芯片上接种细胞及细胞拉伸过程

  1. 使用含 2% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素-链霉素的平滑肌细胞培养基（SMCM），在 37 °C、5% CO2 培养箱中培养来自患者的 4 × 105 个原代人平滑肌细胞（HASMCs）。
  2. 当 HASMC 细胞密度达到 80% 时，弃去 SMCM，并用 2 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞。
  3. 用 1 mL 0.25% 胰蛋白酶消化细胞 2 分钟，然后在 100 × g 条件下离心 5 分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 1 mL 新鲜 SMCM 中。使用 8 mL SMCM 在 10 cm 培养皿中继续培养细胞。
  4. 使用细胞计数仪计算细胞数量，并将细胞调整至终浓度为 2 × 105 个细胞/mL。
  5. 用 2 mL 注射器缓慢向经胶原包被并灭菌的 PDMS 芯片培养基微通道中注入 2 mL PBS，随后用同一注射器吸出弃去。
  6. 用 2 mL 注射器缓慢将总共 2 mL 浓度为 2 × 105 个细胞/mL 的 HASMC 悬液注入 PDMS 芯片的培养基微通道中。然后封闭 PDMS 芯片入口和出口的鲁尔接头。将 PDMS 芯片置于 37 °C、5% CO2 培养箱中培养 1 天。
  7. 待细胞在 PDMS 芯片内的 PDMS 膜上贴壁后（约 24 小时），将 PDMS 芯片上气路微通道的出口连接至真空控制系统。细胞贴壁后可在显微镜下观察到拉长的正常细胞形态，与悬浮状态下的圆形细胞形成对比。
  8. 打开电磁阀和真空泵，开启真空调节器并将压力调节至 10 kPa（产生 7.18 ± 0.44% 的应变）或 15 kPa（产生 17.28 ± 0.91% 的应变）。
  9. 在控制系统参数设定完成后，将 PDMS 芯片置于 37 °C、5% CO2 培养箱中 ，持续拉伸 24 小时。

5. 机械控制系统制备

  1. 准备多个电磁阀、真空过滤器、真空调节器、真空泵、蠕动泵，以及一个用于控制电磁阀的可编程逻辑控制器（PLC）。
  2. 对PLC控制器进行编程，将开关时间间隔设置为1 Hz，并将电磁阀连接至已编程的控制器。
  3. 将真空泵的入口连接至真空过滤器，再将真空过滤器的出口连接至真空调节器；将真空调节器的出口连接至电磁阀，最后将电磁阀的出口连接至PDMS芯片的空气微通道出口。
  4. 将蠕动泵的出口连接至PDMS芯片的培养基微通道入口，同时将蠕动泵的入口连接至PDMS芯片的培养基微通道出口，用于更换培养基和药物处理。
  5. 通过调节器调整应变幅度，并通过微控制器调整应变频率。

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结果

HASMC-OOC 模型由真空控制系统、循环系统和 PDMS 芯片组成，其示意图设计如图1所示。真空控制系统包括真空泵、电磁阀和 PLC 控制器。循环系统采用蠕动泵来更新细胞培养基并添加药物。PDMS 芯片包含两个真空腔室和一个中间腔室，中间腔室填充平滑肌细胞培养基（SMCM）用于细胞生长。根据芯片结构设计制备了 PMMA 模具，并通过将 PDMS 倒入模具中并在 70 °C 下交联 2 小时制备出三块 PDMS 板。经等离子体处理后，将三块 PDMS 板与两片 PDMS 膜键合在一起（图2）。PDMS 芯片制备完成后，将 HASMCs 培养在芯片内的 PDMS 膜上，并将 PDMS 芯片连接至真空控制系统和循环系统。整个系统的示意图见补充图1。PDMS 芯片的参数见图3A，PDMS 膜的力学性能见图3B。为量化 PDMS 膜的拉伸应变，我们从微流控模型的横截面视图实...

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讨论

随着微流控技术的快速发展，能够模拟一个或多个器官生物学功能与结构的器官芯片模型 体外 近年来已在生物学、医学和药理学应用中出现15器官芯片可模拟人体生理微环境的关键功能，对于探索疾病机制和推动临床前药物转化至关重要8,16尽管器官芯片（OOC）仍处于早期发展阶段，且需要更多投入以优化其设计，但近年来已取得显著进展。17,18与其他三维细胞培养模型不同，器官芯片（OOC）能够模拟人体内对组织发育和器官功能维持至关重要的生物力学参数。心血管系统的器官和组织持续受到由流体流动引起的剪切力和周期性张力的作用。 在体因此， 体外 心血管系统细胞实验需要在能够提供此类生物力学参数的实验平台上进行，以获得与实际生理条件下可比的、真实的实验结果 体内 研究。

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者声明本研究工作得到了上海市科学技术委员会（20ZR1411700）、国家自然科学基金委员会（81771971）以及上海市扬帆计划（22YF1406600）资助项目的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
4% 多聚甲醛BeyotimeP0099-100ml用于细胞固定
Alexa Fluor 350 标记的山羊抗兔 IgGBeyotimeA0408用于免疫荧光染色的抗体
牛血清白蛋白BeyotimeST025-20g
钙黄绿素 AM/碘化丙啶InvitrogenL3224
细胞培养瓶 Corning430639
CNN1Abcam Ab46794
商用柔性
PDMS 膜		杭州巴尔德先进材料KYQ-200
F-肌动蛋白InvitrogenR415
FBSSigmaM8318
软管润泽流体96410内径 1 mm；外径 3 mm；壁厚 1 mm；官方网站地址：https://www.runzefluidsystem.com
人主动脉平滑
肌细胞系 CRL1999		ATCC批号：70019189
Image JImagej.net/fiji/downloads免费下载地址：https://fiji.sc用于检测荧光强度的成像平台
培养箱Thermo Fisher Scientific确保实验过程中温度、
湿度和光照条件
完全一致。
Luer 接头润泽流体RH-M016官方网站地址：https://www.runzefluidsystem.com。
显微镜Olympus
小鼠胶原蛋白SigmaC7661
氧等离子体 常州宏明仪器HM-Plasma5L
巴斯德吸管Biologix30-0138A1
PBSBeyotimeC0221A
青霉素-链霉素SigmaP4458-100ml用于防止细胞培养过程中细菌
污染的抗生素。
蠕动泵KamoerF01A-STP-B046
培养皿Corning430167
PLC 控制器浙江俊腾（BenT）数控机床厂BR010-11T8X2M详细程序设置见补充材料。官方网站地址：files.http://www.btcnc.net
聚二甲基硅氧烷（PDMS）Dow CorningSylgard 184
SM22Abcam ab14106
SMCMScienCell货号 1101
电磁阀SMC（中国）VQZ300
注射器贝克顿·迪金森公司300841
Triton-X 100BeyotimeST795用于穿透细胞膜
TrizolInvitrogen10296010用于 RNA 提取
胰蛋白酶Sigma15400054
真空过滤器SMC（中国）ZFC5-6官方网站地址：https://www.smc.com.cn
真空泵KamoerKVP15-KL-S
真空调节阀AirTACGVR-200-06
引物
引物名称正向引物（5’ 至 3’）反向引物（5’ 至 3’）
SM22CCGTGGAGATCCCAACTGGCCATCTGAAGGCCAATGACAT
CNN1CTCCATTGACTCGAACGACTCCAGGTCTGCGAAACTTCTTAGA

参考文献

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