构建人主动脉平滑肌细胞类器官芯片模型以模拟主动脉壁中的生物力学应变

摘要

在此，我们开发了一种人主动脉平滑肌细胞类器官芯片模型，用于模拟 体内 人主动脉壁平滑肌细胞的生物力学应变

摘要

传统的二维细胞培养技术与动物模型已被用于人类胸主动脉瘤和夹层（TAAD）的研究。然而，动物模型有时无法准确再现人类TAAD的特征。临床人体研究与动物实验之间存在明显物种差异，这可能阻碍治疗药物的发现。相比之下，传统的细胞培养模型难以模拟 体内 生物力学刺激。为此，近年来微加工和微流控技术取得了显著发展，为构建能够模拟生物力学微环境的类器官芯片模型提供了新的技术手段。本研究建立了一种人主动脉平滑肌细胞类器官芯片（HASMC-OOC）模型，用于模拟主动脉生物力学的病理生理参数，包括人主动脉平滑肌细胞（HASMCs）所经历的周期性应变的幅度和频率，这些参数在主动脉夹层（TAAD）中发挥关键作用。在该模型中，HASMCs的形态变得细长，排列方向垂直于应变方向，在应变条件下相较于静态常规条件表现出更强的收缩表型。这与天然人主动脉壁中细胞的取向和表型一致。此外，利用二叶主动脉瓣相关TAAD（BAV-TAAD）和三叶主动脉瓣相关TAAD（TAV-TAAD）患者来源的原代HASMCs，我们建立了BAV-TAAD和TAV-TAAD疾病模型，成功再现了TAAD中HASMC的特征。HASMC-OOC模型提供了一种新颖的 体外 一个与动物模型互补的平台，可用于进一步探索胸腹主动脉夹层（TAAD）的发病机制并发现治疗靶点。

引言

胸主动脉瘤和夹层（TAAD）是主动脉壁的局部扩张或分层，具有较高的发病率和死亡率¹人主动脉平滑肌细胞（HASMCs）在胸腹主动脉瘤疾病（TAAD）的发病机制中发挥关键作用。HASMCs并非终末分化的细胞，具有高度可塑性，能够响应不同刺激而发生表型转换。²人主动脉平滑肌细胞主要受到节律性张应力作用 体内，这是调控平滑肌形态变化、分化及生理功能的关键因素之一^3,4因此，在研究人主动脉平滑肌细胞（HASMCs）时，周期性应变的作用不容忽视。然而，传统的二维细胞培养无法模拟HASMCs所经历的周期性应变生物力学刺激。 体内此外，动物TAAD模型的构建并不适用于某些类型的TAAD，例如与二叶式主动脉瓣（BAV）相关的TAAD。而且，临床人体研究与动物实验之间的物种差异不容忽视，这阻碍了药物在临床实践中的转化应用。因此，迫切需要更复杂且具有生理相关性的系统来模拟 体内 主动脉疾病研究中的生物力学环境

用于生物医学研究和药物开发的动物实验成本高昂、耗时漫长，且存在伦理争议。此外，动物实验的结果往往无法准确预测人体临床试验的结果。^5,

方案

在复旦大学中山医院伦理委员会（编号：B2020-158）的批准下，使用人类主动脉组织样本进行原代人主动脉平滑肌细胞（HASMC）的分离。主动脉组织样本取自于复旦大学中山医院接受升主动脉手术的患者。所有患者在参与研究前均签署了书面知情同意书。

1. 人主动脉平滑肌细胞的原代分离

1. 用无菌 PBS 清洗升主动脉的右侧区域，1 至 2 次。
2. 使用两把眼科镊子去除组织的内膜和外膜层，保留中膜层以收获细胞。
3. 将中膜层置于一个 10 cm 培养皿中，用剪刀剪成小块（2–3 mm），加入 5 mL 含 10% 胎牛血清和 1% 青霉素-链霉素的平滑肌细胞培养基（SMCM）。
4. 用无菌移液滴管将小块组织转移至培养瓶中，均匀铺开；尽可能弃去培养基，然后将培养瓶倒置。
5. 向倒置的培养瓶中加入 2 mL SMCM，放入 37 °C、5% CO₂ 的培养箱中孵育 1–2 小时，随后缓慢将培养瓶翻转至正置，并再加入 2 mL SMCM。
6. 孵育 5–7 天后，更换为 4 mL 新鲜 SMCM。通常情况下，散在的平滑肌细胞约在 2 周左右开始爬出。
7. 换液时应缓慢弃去和添加 SMCM；移动培养瓶至显微镜观察台时应轻缓运输，否则组织可能漂浮，导致细胞生长缓慢。
8. 当细胞融合度达到约 80% 时，用 2....

结果

HASMC-OOC 模型由真空控制系统、循环系统和 PDMS 芯片组成，其示意图设计如图1所示。真空控制系统包括真空泵、电磁阀和 PLC 控制器。循环系统采用蠕动泵来更新细胞培养基并添加药物。PDMS 芯片包含两个真空腔室和一个中间腔室，中间腔室填充平滑肌细胞培养基（SMCM）用于细胞生长。根据芯片结构设计制备了 PMMA 模具，并通过将 PDMS 倒入模具中并在 70 °C 下交联 2 小时制备出三块 PDMS 板。经等离子体处理后，将三块 PDMS 板与两片 PDMS 膜键合在一起（图2）。PDMS 芯片制备完成后，将 HASMCs 培养在芯片内的 PDMS 膜上，并将 PDMS 芯片连接至真空控制系统和循环系统。整个系统的示意图见补充图1。PDMS 芯片的参数见图3A，PDMS 膜的力学性能见图3B。为量化 PDMS 膜的拉伸应变，我们从微流控模型的横截面视图实.......

讨论

随着微流控技术的快速发展，能够模拟一个或多个器官生物学功能与结构的器官芯片模型 体外 近年来已在生物学、医学和药理学应用中出现¹⁵器官芯片可模拟人体生理微环境的关键功能，对于探索疾病机制和推动临床前药物转化至关重要^8,16尽管器官芯片（OOC）仍处于早期发展阶段，且需要更多投入以优化其设计，但近年来已取得显著进展。^17,18与其他三维细胞培养模型不同，器官芯片（OOC）能够模拟人体内对组织发育和器官功能维持至关重要的生物力学参数。心血管系统的器官和组织持续受到由流体流动引起的剪切力和周期性张力的作用。 在体因此， 体外 心血管系统细胞实验需要在能够提供此类生物力学参数的实验平台上进行，以获得与实际生理条件下可比的、真实的实验结果 体内 研究。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
4% 多聚甲醛	Beyotime	P0099-100ml	用于细胞固定
Alexa Fluor 350 标记的山羊抗兔 IgG	Beyotime	A0408	用于免疫荧光染色的抗体
牛血清白蛋白	Beyotime	ST025-20g
钙黄绿素 AM/碘化丙啶	Invitrogen	L3224
细胞培养瓶	Corning	430639
CNN1	Abcam	Ab46794
商用柔性 PDMS 膜	杭州巴尔德先进材料	KYQ-200
F-肌动蛋白	Invitrogen	R415
FBS	Sigma	M8318
软管	润泽流体	96410	内径 1 mm；外径 3 mm；壁厚 1 mm；官方网站地址：https://www.runzefluidsystem.com
人主动脉平滑 肌细胞系 CRL1999	ATCC	批号：70019189
Image J	Imagej.net/fiji/downloads	免费下载地址：https://fiji.sc	用于检测荧光强度的成像平台
培养箱	Thermo Fisher Scientific		确保实验过程中温度、 湿度和光照条件 完全一致。
Luer 接头	润泽流体	RH-M016	官方网站地址：https://www.runzefluidsystem.com。
显微镜	Olympus
小鼠胶原蛋白	Sigma	C7661
氧等离子体	常州宏明仪器	HM-Plasma5L
巴斯德吸管	Biologix	30-0138A1
PBS	Beyotime	C0221A
青霉素-链霉素	Sigma	P4458-100ml	用于防止细胞培养过程中细菌 污染的抗生素。
蠕动泵	Kamoer	F01A-STP-B046
培养皿	Corning	430167
PLC 控制器	浙江俊腾（BenT）数控机床厂	BR010-11T8X2M	详细程序设置见补充材料。官方网站地址：files.http://www.btcnc.net
聚二甲基硅氧烷（PDMS）	Dow Corning	Sylgard 184
SM22	Abcam	ab14106
SMCM	ScienCell	货号 1101
电磁阀	SMC（中国）	VQZ300
注射器	贝克顿·迪金森公司	300841
Triton-X 100	Beyotime	ST795	用于穿透细胞膜
Trizol	Invitrogen	10296010	用于 RNA 提取
胰蛋白酶	Sigma	15400054
真空过滤器	SMC（中国）	ZFC5-6	官方网站地址：https://www.smc.com.cn
真空泵	Kamoer	KVP15-KL-S
真空调节阀	AirTAC	GVR-200-06
引物
引物名称	正向引物（5’ 至 3’）	反向引物（5’ 至 3’）
SM22	CCGTGGAGATCCCAACTGG	CCATCTGAAGGCCAATGACAT
CNN1	CTCCATTGACTCGAACGACTC	CAGGTCTGCGAAACTTCTTAGA