一种用于下游游离DNA检测的标准化液体活检预分析方案

摘要

液体活检已彻底改变了我们进行肿瘤学转化研究的方式，其中样本采集、质量和储存是其成功应用于临床的关键步骤。本文介绍了一种标准化且经过验证的下游游离DNA检测应用方案，可适用于大多数转化医学研究实验室。

摘要

液体活检（LB）是指来源于原发性或转移性肿瘤的蛋白质、DNA、RNA、细胞或细胞外囊泡等分子，存在于血液及其他体液中。LB 已成为转化研究的重要手段，并逐步进入临床肿瘤学实践，为组织活检提供了一种微创替代方案。LB 可实现对肿瘤的实时监测 通过 一种微创样本采集方法，例如血液采集。其应用包括早期癌症检测、患者随访以监测疾病进展、微小残留病灶评估，以及分子水平进展和耐药机制的潜在识别。为了获得可用于临床报告的可靠分析结果，必须审慎考虑并严格遵循分析前处理步骤。样本采集、质量控制和储存是决定样本在后续应用中有效性的关键环节。本文介绍了我们液体活检工作模块中用于采集、处理和储存血浆与血清样本的标准化操作流程，以支持基于循环游离DNA的下游液体活检分析。本流程仅需常规实验设备，具有足够的灵活性，适用于大多数专注于生物学操作的实验室。 关键词：液体活检，循环游离DNA，血浆，血清，样本采集，样本处理，样本储存，分析前步骤

引言

“液体活检”这一术语于2010年被定义为存在于血液及其他体液中的分子（如蛋白质、脱氧核糖核酸（DNA）、核糖核酸（RNA））、细胞或细胞外囊泡（如外泌体），这些物质来源于原发肿瘤¹。液体活检样本的应用已彻底改变了转化肿瘤学研究，因为组织活检仅能获取特定时间和特定区域的样本，可能因肿瘤异质性而遗漏相关克隆。此外，在原发组织稀少或难以获取的肿瘤类型中，液体活检具有重要作用，因其可避免侵入性活检，从而降低医疗成本和患者风险。此外，肿瘤的分子特征会因治疗压力而持续演变，而液体活检样本可通过纵向采集（如在疾病的不同临床和治疗阶段——基线期、治疗中、最佳疗效期、疾病进展期甚至进展前）捕捉肿瘤克隆的动态变化。“实时液体活检”的概念意味着可实时监测肿瘤的动态变化，从而实现该疾病的精准医疗。液体活检在临床中具有多种潜在应用，包括癌症的筛查与早期检测、疾病的实时监测、微小残留病灶的检测、治疗耐药机制的研究以及患者在治疗层面的分层¹。在许多肿瘤类型中，疾病复发和进展的早期检测仍是尚未满足的临床需求，也是提高癌症患者生存率和生活质量的关键因素。常规影像学手段和可溶性肿瘤标志物在此任务中可能缺乏足够的灵敏度和/或特异性。因此，临床上迫切需要新型预测标志物，例如基于循环游离核酸的标志物。

用于液体活检研究的样本类型包括但不限于血液、尿液、唾液和粪便样本。其他肿瘤特异性样本可包括细胞抽吸物、脑脊液、胸腔积液、囊肿液和腹水、痰液以及胰液²。前述液体可能含有不同类型的肿瘤来源物质、循环肿瘤细胞（CTC）或片段，如外泌体和无细胞循环肿瘤DNA（ctDNA）。核酸可能被包裹在细胞外囊泡（EVs）中，或因细胞死亡和损伤而释放到体液中。循环游离DNA（cfDNA）主要来源于凋亡或坏死的细胞，释放进入血液循环，存在于所有个体中，在炎症或肿瘤性疾病中其水平升高³。外泌体是由细胞分泌的较小细胞外囊泡（约30–150 nm），内含核酸、蛋白质和脂质。这些囊泡是细胞间通讯网络的一部分，常见于多种类型的体液中²。包裹在EVs内的核酸受到保护，免受体液中严苛环境的降解，因此在液体活检中为研究这些分子提供了更为稳定可靠的方法。

总体而言，液体活检样本中循环核酸的含量极低，因此需要采用高灵敏度的检测方法，例如数字PCR或下一代测序（NGS）。样本的分析前处理至关重要，必须防止血细胞裂解导致完整DNA释放，从而避免基因组DNA对游离DNA（cfDNA）产生污染。此外，在提取样本时需格外注意，避免引入酶法分析抑制物。

本文介绍了一种用于血浆和血清样本采集与保存的标准化方法，这是开展基于液体活检的下游应用（包括循环核酸分析）的关键第一步。

方案

在采集血样之前，已从参与的研究中心获得伦理审批。血清和血浆分离的以下操作步骤均依照生物医学研究的伦理原则进行。

注意：开始本实验方案前需考虑以下事项。在生物医学研究中使用人源样本前，必须获得相应的伦理审批及知情同意。处理血液样本时需使用二级生物安全柜。整个操作过程中应穿戴实验服、防护手套和护目镜，以避免血液传播病原体感染。血清样本处理至少需要30分钟。采集无抗凝剂的采血管血液后，于室温（RT）放置30-45分钟，以使血液充分凝固。血浆制备至少需要40分钟，使用乙二胺四乙酸（EDTA）采血管时，样本应在采血后4小时内完成处理；若使用细胞稳定化采血管或专用的无细胞DNA采血管，则应在24-48小时内处理。然而，根据部分制造商说明，这些特殊采血管中的样本在两周内保持稳定。处理时需注意检查是否发生溶血，溶血会使血浆或血清组分呈现红色。有关溶血样本的处理建议，请参见讨论部分的故障排除章节。

1. 液体活检研究的血清制备

注意：执行此步骤所需的总时间为 30 分钟（图 1）。

1. 采集4-10 mL血液至不含抗凝剂的试管中（红色或红/灰黑色盖子），室温放置30-45分钟。在采样后4小时内完成这些样本的处理。
2. 在专门设计的样本数据库中记录样本采集的时间、日期以及受试者编号（ID）。
3. 穿戴实验服、防护手套和护目镜，在室温（15 °C–25 °C）下以1,600（± 150）× g 离心10分钟，使用最大刹车速度，对含有新鲜血液的试管进行离心。
4. 离心后，小心地从离心机中取出试管；上层血清上清液应呈清澈淡黄色（图2）。检查样本是否出现溶血迹象（图3），必要时记录溶血情况。
5. 在II级生物安全柜中，将血清以250 µL为一份分装至收集管中。
   注：分装体积需根据研究要求进行调整。
6. 立即将血清直立放置于储存盒中，并在-80 °C下冷冻保存，同时记录样本储存时间。
7. 确认样本已在规定的4小时内完成处理。

2. 液体活检研究的血浆制备

注意：完成此步骤所需的总时间为 40 分钟（图 4）。

1. 使用含乙二胺四乙酸（EDTA）的采血管采集4-10 mL血液。在采血后4小时内处理样本。
2. 在专门设计的样本数据库中记录样本采集的时间、日期及受试者编号。
3. 穿戴实验服、防护手套和护目镜，在室温（15 °C–25 °C）下以1,600（±150）×g离心10分钟，使用最大刹车档位。
   注意：若使用其他类型的采血管，请参考制造商说明书。
4. 离心后，血浆上清液应呈清澈淡黄色。检查样本是否出现溶血迹象（图3），并使用一次性移液管（或一次性洗耳球移液器，或带滤芯吸头的P1000移液器）将血浆（上清液）转移至15 mL离心管中，避免扰动细胞层。在细胞层上方保留少量残留血浆体积（约5 mm）。
5. 若观察到溶血现象，应弃用该样本进行后续分析（图5）。有关溶血评估，请参见讨论部分的故障排除说明。
6. 将血浆置于15 mL离心管中，在室温（15 °C–25 °C）下以3,000（±150）×g离心10–20分钟。执行 此步骤以去除第一次离心时可能残留并被带入的完整血细胞。
7. 离心后，小心从离心机中取出离心管，使用一次性移液管（或一次性洗耳球移液器，或带滤芯吸头的P1000移液器）将1–4 mL血浆转移至1–4 mL聚丙烯冻存管中。在离心管底部必须保留一定体积的残留血浆（约0.3 mL或7 mm高度），以避免血细胞污染血浆（图5）。
8. 立即将冻存管直立放入储存盒中，并在-80 °C下速冻，同时记录样本储存时间。确认样本已在规定的4小时内完成处理。
9. 使用P1000移液器配合滤芯吸头收集细胞层（白膜层），并转移至2 mL离心管中。立即冷冻并在-80 °C下保存。

结果

在对不含抗凝剂的采血管进行离心后，上层呈现淡黄色，对应于血清组分（图2）。小心移除此组分，并分装用于后续分析。

溶血可能出现在血浆或血清部分，上层液相会呈现红色，表明溶血的存在及其程度（图3）。

EDTA 管离心后，可观察到多个相或分层；上层（淡黄色）为血浆组分，占总血容量的 55%；中间薄层呈灰白色，为含有白细胞和血小板的白膜层，占总血容量的 <1%；下层（红色）含有红细胞，占总血容量的 45%。吸取时应位于白细胞层上方 1 cm 处，确保不扰动细胞层，以减少血细胞对血浆的污染（图 5）。应小心移除此组分，并分装用于后续分析。

应使用基于电泳的方法评估从血浆样本中提取的游离DNA（cfDNA）的浓度和完整性。cfDNA采用市售的基于离心柱的试剂盒进行提取。定量分析使用专为cfDNA应用设...

讨论

液体活检在癌症管理的不同阶段具有多种潜在应用。首先，在诊断时用于识别肿瘤分子标志物，以提示可能存在需进一步临床检查的肿瘤病灶。其次，在治疗期间用于疾病的实时监测、评估治疗的分子学反应、克隆演化，以及早期发现疾病复发或治疗耐药。最后，在手术治疗后，可作为检测微小残留病灶的工具。欧洲医学肿瘤学会（ESMO）近期发布了关于在转移性非小细胞肺癌（NSCLC）中实施循环肿瘤DNA（ctDNA）突变检测以识别可靶向治疗靶点的指南。这些指南涵盖了ctDNA分析的方法学考量、技术评估与验证，并讨论了一些挑战，例如体细胞嵌合现象、低变异等位基因频率（VAF）以及偶然发现的胚系致病性变异⁴。近期发布的ESMO转移性乳腺癌患者诊断、分期和治疗临床实践指南指出，在治疗策略发生改变或进入临床试验需要的情况下，可采用基于ctDNA的分析⁵。

样本应在提取后4小时内进行处理。超出该时间范围进行样本处理可能导致样本降解，进而引起溶血增加，影响游离DNA（cfDNA）浓度，并对下游应用（如miRNA谱分析）产生不利影响。...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL Eppendorf管	Eppendorf	0030 120.086	可使用任何标准的试管/设备
10 mL 血清学一次性移液管	BIOFIL	GSP010010	可使用任何标准的试管/设备
10 mL 真空采血管 K2 EDTA 管	Becton Dickinson	367525	这些试管可用于血浆采集
15 mL 聚丙烯离心管	BIOFIL	CFT411150	可使用任何标准的试管/设备
3.5 mL BD Vacutainer 无抗凝剂采血管	Becton Dickinson	368965	可使用8.5 mL或3.5 mL试管进行血清采集
4 mL聚丙烯冻存管，圆底，可直立	康宁	430662	可使用任何标准的试管/设备
4 mL 真空采血管（K2 EDTA 管）	Becton Dickinson	367864	这些试管可用于血浆采集
4200 TapeStation 系统	安捷伦	G2991BA	有多种定量方法可供选择  cfDNA 的特定应用
5 mL 血清学一次性移液管	BIOFIL	GSP010005	可使用任何标准的试管/设备
8.5 mL BD Vacutainer 无抗凝剂采血管	Becton Dickinson	366468	可使用8.5 mL或3.5 mL试管进行血清采集
离心机，可达到约 3000 x g 使用摆动桶转子	赛默飞世尔科技	Sorvall ST 16  10688725	可使用任何标准的试管/设备
用于1的冷冻储存盒–4 mL 冻存管	康宁	431120	使用4 mL小瓶进行储存时需要这些盒子
p1000 移液器吸头	CORNING	4809	可使用任何标准的试管/设备
QIAamp 循环核酸提取试剂盒	Qiagen	55114	任何市售的特异性用于cfDNA分离的试剂盒均可与本血液处理方案联合使用。
Streck Cell-Free DNA BCT CE 管 10 mL	Streck	218997	这些试管可用于血浆采集
-80℃ 超低温冰箱 °C)	ESCO	2180104	可使用任何标准的试管/设备