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体外筛选适配体以区分感染性与非感染性病毒

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DOI：

10.3791/64127

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2022年9月7日

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1INQUIMAE (CONICET), Departamento de Química Inorgánica, Analítica y Química Física, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires, 2Department of Chemistry, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Department of Chemistry, University of Texas at Austin

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们提供了一种通用的实验方案，可用于筛选仅结合具有感染性的病毒、而不结合因消毒方法而失去感染性的病毒或其他类似病毒的适配体。这为在便携式快速检测中确定病毒的感染状态提供了可能。

摘要

病毒感染对社会具有重大影响；目前大多数检测方法难以判断所检测到的病毒是否具有感染性，从而导致治疗延误并加剧病毒传播。开发能够判断临床或环境样本中病毒是否具有感染性的新型传感器，将有助于解决这一尚未满足的需求。然而，极少有方法能够获得可识别完整且具有感染性病毒、并将其与经消毒处理后失去感染性的同种病毒区分开的传感分子。本文介绍一种利用配体指数富集系统进化（SELEX）技术筛选可区分感染性病毒与非感染性病毒的适配体的实验方案。该方法利用了SELEX技术的两个特点：首先，SELEX可通过反向筛选去除竞争性靶标，例如非感染性病毒或其他相似病毒，从而实现定制化筛选；其次，SELEX可直接以完整病毒作为靶标，而非仅使用病毒表面蛋白等单一组分。采用完整病毒进行SELEX筛选，可获得特异性结合病毒天然构象的适配体，且无需破坏病毒结构。因此，该方法能够基于病原体表面的功能差异来获取识别分子，而这些功能差异无需在实验前预先知晓。

引言

病毒感染对全球的经济和社会产生了巨大影响，这一点在最近的 COVID-19 大流行中愈发明显。及时且准确的诊断对于治疗病毒感染以及防止病毒传播给健康人群至关重要。尽管目前已开发出多种病毒检测方法，例如 PCR 检测1,2 和免疫分析法3，但大多数现有方法无法判断所检测到的病毒是否具有实际感染能力。这是因为仅存在病毒组分（如病毒核酸或蛋白质）并不能说明完整且具有感染性的病毒存在，这些生物标志物的水平与感染性之间的相关性较差4,5,6。例如，目前基于 PCR 的 COVID-19 检测常用的病毒 RNA，在患者具有传染性的感染初期水平极低，而当患者已康复且不再具有传染性时，RNA 水平仍可能非常高7,8。病毒蛋白或抗原生物标志物也呈现类似趋势，但通常比病毒 RNA 出现更晚，因此对传染性的预测能力更差6,9。为解决这一局限性，已开发出一些能够反映病毒感染能力状态的方法，但这些方法依赖于细胞培养微生物学技术，需要较长时间（数天至数周）才能获得结果4,10。因此，开发能够判断临床或环境样本中病毒是否具有感染能力的新传感器，有助于避免治疗延误和病毒进一步传播。然而，目前极少有方法能够获得可识别完整感染性病毒颗粒并将其与失去感染能力的同种病毒区分开来的传感分子。

在这一背景下，适配体作为一种独特的生物分子工具尤为适用11,12,13,14。适配体是短的单链DNA或RNA分子，具有特定的核苷酸序列，能够形成特定的三维构象，以高亲和力和高选择性识别靶标15,16。它们通过一种称为配体系统进化指数富集（SELEX）的组合筛选过程获得，该过程也被称为体外筛选，是在试管中利用包含1014-1015种序列的大量随机DNA文库进行的17,18,19。在该迭代过程的每一轮中，首先在设定条件下将DNA文库与靶标孵育，施加筛选压力。随后去除未与靶标结合的序列，仅保留能在给定条件下结合的少数序列。最后，通过PCR扩增上一步筛选出的序列，使具有所需功能的序列在文库中的比例得到富集，用于下一轮筛选，并重复该过程。当筛选文库的活性达到平台期（通常在8-15轮后），通过DNA测序分析文库，以鉴定出亲和力最高的优势序列。

SELEX 具有独特的优势，可用于提高对其他相似靶标的特异性识别能力20,21，例如针对病毒的感染状态22。首先，SELEX 可使用多种不同类型的靶标进行筛选，从小分子和蛋白质到完整的病原体和细胞均可应用16。因此，为获得能够结合具有感染性病毒的适配体，可直接使用完整病毒作为靶标，而非病毒表面蛋白19。全病毒 SELEX 能够筛选出特异性结合病毒天然构象的适配体，无需对病毒进行破坏。其次，SELEX 可通过每轮筛选中引入反向筛选步骤，定制化地去除竞争性靶标21,23，例如其他相似病毒或无感染活性的灭活病毒22。在反向筛选过程中，将 DNA 文库暴露于不希望结合的靶标，任何发生结合的序列将被剔除。

在本研究中，我们提供了一种通用的实验方案，可用于筛选出能够结合感染性病毒、但不结合经特定消毒方法灭活后的同种病毒或其他相关病毒的适配体。该方法能够基于病毒表面的功能差异来获得识别分子，而无需预先了解这些差异，因此在新发病原体或研究较少疾病的检测方面具有额外优势。

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方案

1. 试剂与缓冲液的准备

  1. 通过加入0.9 M Tris碱、0.9 M硼酸、20 mM EDTA（二钠盐）以及去离子水，定容至1 L，配制10倍浓度Tris-硼酸-EDTA缓冲液（10x TBE）。搅拌至所有组分完全溶解。
  2. 按如下方法配制10%变性聚丙烯酰胺储备溶液。在250 mL玻璃瓶中，加入120 g尿素（8 M）、25 mL 10x TBE、62.5 mL 40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺（29:1）溶液，并加入蒸馏水定容至250 mL。搅拌至所有组分完全溶解。
  3. 按如下方法配制2x上样缓冲液。在50 mL离心管中，加入21.636 g尿素（8 M）、1.675 g EDTA（1 mM）和4.5 mL 10x TBE。用蒸馏水定容至45 mL，并搅拌至所有组分完全溶解。
  4. 通过加入100 mM乙酸钠和1 mM EDTA（二钠盐）配制提取缓冲液。将最终pH值调节至5。
  5. 按如下方法配制乙醇沉淀溶液。配制3 M乙酸钠溶液，调节pH至5.2，于4 °C保存。配制70%（v/v）乙醇溶液，于-20 °C保存。配制100%乙醇，于-20 °C保存。
  6. 配制500 mL SELEX缓冲液，其中含1x PBS、2.5 mM MgCl2和0.5 mM CaCl2。调节pH至7.4。另配制100 mL含8 M尿素的SELEX缓冲液，其中含1x PBS、2.5 mM MgCl2、0.5 mM CaCl2和8 M尿素。调节pH至7.4。
    注意：SELEX缓冲液的选择至关重要，以确保所筛选的适配体在最终应用样本中能够有效发挥作用。例如，针对SARS-CoV-2的适配体将用于生物样本（如唾液或鼻咽拭子）中。因此，应选择能够模拟目标生物样本中离子浓度、pH值和缓冲体系的条件。
  7. 按如下方法配制结合与洗涤缓冲液。在50 mL离心管中，配制5 mM Tris、0.5 mM EDTA（二钠盐）和2 M NaCl。调节pH至7.5。

2. DNA文库与引物的设计与合成

  1. 设计初始的ssDNA文库和引物时需遵循以下标准（参见 表1 以一个ssDNA文库和一组引物为例，其中N表示随机核苷酸位置。
    1. 确保文库包含一个位于中央的随机区域，长度为35至60个核苷酸，其两侧分别带有位于3'和5'端的恒定序列，作为扩增用的引物区域。典型的文库长度为45个随机核苷酸。
    2. 确保反向引物带有生物素修饰，以便在后续步骤中利用链霉亲和素包被的磁珠分离单链DNA与扩增得到的双链PCR产物 体外 筛选过程。
  2. 从商业来源购买经标准脱盐纯化的DNA寡核苷酸。通过10%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（dPAGE）对单链DNA文库和引物进行纯化，随后按照标准程序进行乙醇沉淀。24.
    警告：丙烯酰胺单体和溴化乙锭为有害化学物质（人类致癌物），进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）时须佩戴适当的个人防护装备（实验服、手套和护目用具）。如有可能，应避免使用溴化乙锭，并以更安全的染料替代。
    注意：可以订购经过HPLC纯化的寡核苷酸，以避免执行此纯化步骤，但这种方法对短链寡核苷酸的去除效果较差。
  3. 加入无核酸酶水，通过乙醇沉淀法将单链DNA重悬至所需浓度（100 µM）。通过在λ = 260 nm处的紫外吸收测定单链DNA文库和引物的浓度。于-20 °C保存。
  4. 购买未经修饰的反向引物，用于高通量测序文库构建和qPCR定量。

3. 感染性与非感染性病毒样本

注意：传染性和非传染性病毒样本属于生物安全二级（BSL2）样本，需格外小心以确保安全和规范操作。所有涉及此类样本的操作步骤必须在生物安全柜内进行，或者病毒溶液必须置于密封容器中（例如，带盖的塑料管）。

  1. 获取具有感染性的病毒储备液，或根据每种病毒的相应实验方案进行制备。本实验中使用的SARS-CoV-2、SARS-CoV-1和H5N1假病毒由美国伊利诺伊大学芝加哥分校（UIC）Lijun Rong教授实验室提供，溶于PBS缓冲液中，并依据已发表的实验方案制备22,25,26。
    注意：对于需要在生物安全三级（BSL-3）设施中操作的完整感染性病毒，可使用假病毒进行实验。假病毒是以慢病毒（HIV）为骨架、在其包膜上表达目标病毒表面蛋白的重组病毒，能够模拟目标病毒的表面结构和入侵机制，但不具备持续复制能力。
  2. 获取非感染性病毒储备液，或按照消毒程序进行制备。本实验中使用的经紫外线灭活的SARS-CoV-2假病毒（p-SARS-CoV-2）储备液由Rong教授实验室（UIC）提供，溶于PBS缓冲液中，并采用先前报道的方法进行紫外线灭活处理22。
    注意：如条件允许，应进行感染性检测实验，以确认病毒已被完全灭活。
  3. 病毒储备液的定量
    1. 按照标准操作流程，采用噬斑实验（plaque assay）对病毒进行定量27,28,29。该方法不仅可用于病毒数量的测定，还可反映病毒的感染活性，从而确认具有感染能力的病毒浓度。
    2. 对于无法使用噬斑实验的假病毒或其他病毒，可采用 commercially available 定量慢病毒ELISA试剂盒进行病毒定量。
    3. 将p-SARS-CoV-2、p-SARS-CoV-1和p-H5N1分别配制为1 × 108 拷贝/mL的储备液，每50 µL分装为一份，保存于-80 °C。每次实验前取出新的分装样品进行解冻。

4. 体外 筛选或指数富集配体系统进化（SELEX）过程：第一轮

注意：所有使用感染性病毒的步骤均须在BSL2级生物安全柜中进行。

  1. 变性单链DNA文库。取10 µL浓度为100 µM的单链DNA文库（1 nmol），与240 µL SELEX缓冲液混合。在干浴中95 °C加热15分钟，然后将离心管置于冰上15分钟。
  2. 将单链DNA文库与感染性病毒孵育（正向筛选步骤），操作如下：将步骤4.1中250 µL溶于SELEX缓冲液的单链DNA文库与50 µL感染性病毒（1 × 108 拷贝/mL）混合，在室温下孵育2小时。
  3. 封闭离心滤膜中的非特异性结合位点，操作如下：在等待步骤4.2的同时，为后续步骤准备离心滤膜。
    1. 向每个将要使用的0.5 mL离心滤膜中加入400 µL浓度为1 mM的T20序列（表1）——包括一个截留分子量为100 kDa的滤膜和一个截留分子量为10 kDa的滤膜。
    2. 室温孵育30分钟，然后在14,000 × g下离心10分钟以去除滤膜中的T20溶液。用SELEX缓冲液洗涤3次，以去除多余的T20序列。
  4. 洗涤未结合的序列，操作如下：将步骤4.2中孵育后的混合液加入已封闭的100 kDa离心滤膜中，在14,000 × g下离心10分钟。洗涤3次，每次加入400 µL SELEX缓冲液，并在14,000 × g下离心10分钟。保留滤膜中的组分，弃去穿滤液。
  5. 洗脱结合的序列，操作如下。
    1. 更换离心滤膜的收集管，在步骤4.4中的离心滤膜中加入300 µL含8 M尿素的SELEX缓冲液。将离心滤膜在干浴中95 °C加热15分钟，然后在14,000 × g下离心10分钟。
    2. 收集穿过滤膜、含有洗脱序列的组分。重复此操作三次。操作需在BSL2生物安全柜中进行，所有使用过的材料需用10%次氯酸钠溶液清洗以灭活病毒后方可丢弃。
  6. 浓缩并脱盐，操作如下：将步骤4.5中收集的溶液加入已封闭的10 kDa离心滤膜中，在14,000 × g下离心15分钟。弃去穿滤液。
    注：由于病毒在前一步中已被截留在含8 M尿素的滤膜中并失活，因此本步骤及后续步骤无需在生物安全柜中进行。若使用0.5 mL离心管，需重复此过程直至收集完步骤4.5中全部溶液（共1.2 mL穿过滤膜）。
  7. 用300 µL SELEX缓冲液洗涤3次，每次在14,000 × g下离心15分钟以去除尿素。弃去穿滤液。将滤膜倒置放入洁净的收集管中，离心5分钟，回收滤膜中的溶液。
  8. 使用移液器在塑料管中测量步骤4.7回收溶液的最终体积。该溶液命名为Ria，其中i代表筛选轮次。通常获得的体积在30 µL至50 µL之间。取1 µL洗脱的单链DNA，通过qPCR定量DNA含量。
    注：此处可作为暂停点，R1a样品可保存于−20 °C，待后续继续实验。
  9. 进行PCR扩增，操作如下。
    1. 在第一轮中，取R1a样品的90%作为PCR模板。在后续轮次中，取步骤4.8总体积的60%进行PCR，其余部分储存于−20 °C。
    2. 配制50 µL PCR反应体系，各组分终浓度如下：1× PCR反应缓冲液，200 µM dNTPs，10 µL DNA模板（R1a样品），上下游引物各200 nM，聚合酶1.25 U（2.5 U/µL原液）。
    3. 根据每对引物和单链DNA文库的特点，优化PCR条件，包括循环数和退火温度。避免循环数过多，以免产生非特异性PCR副产物（如引物二聚体）。根据引物的熔解温度测试不同的退火温度。
    4. 使用优化后的条件进行PCR扩增：95 °C预变性5分钟，随后进行18个循环（95 °C变性1分钟，52 °C退火30秒，72 °C延伸1分钟），最后在72 °C延伸10分钟，以获得双链DNA文库。
      注：此处为另一可能的暂停点，PCR产物可保存于−20 °C，待后续继续实验。
  10. 使用链霉亲和素修饰的磁珠回收单链DNA。
    1. 取80%的PCR产物。剩余部分储存于−20 °C。
    2. 将PCR产物分装为每份50 µL，加入含有50 µL链霉亲和素修饰磁珠（MB）的微量离心管中。室温下轻度振荡孵育30分钟（例如使用旋转摇床）。然后将微量离心管置于磁力架上分离磁珠，用移液器吸除上清液（应为澄清溶液）。
    3. 向管中加入200 µL结合与洗涤缓冲液进行洗涤。将离心管从磁力架上取下，轻弹管壁，并用移液器将磁珠重悬为均匀溶液。再将微量离心管放回磁力架上分离磁珠，用移液器吸除上清液。重复此洗涤步骤两次。
    4. 洗涤完成后，将磁珠重悬于总共100 µL的SELEX缓冲液中，并在95 °C加热10分钟。在溶液冷却前立即置于磁力架上，收集含有单链DNA文库的上清液。重复一次回收步骤，加入50 µL SELEX缓冲液。
  11. 使用移液器测量步骤4.10中回收组分的最终体积。该组分命名为Rix，其中i代表筛选轮次。通常获得的体积在140至150 µL之间。取1 µL R1x样品，通过qPCR定量DNA含量。

5. 后续筛选轮次

  1. 使单链DNA（ssDNA）文库变性。取60%的R1x样品，与50 µL SELEX缓冲液混合，在干浴仪中95 °C加热15分钟，然后将离心管置于冰上冷却15分钟。
  2. 将单链DNA文库与非致病性病毒及其他可能产生干扰的病毒共同孵育（反向筛选步骤）。将步骤5.1中变性后的单链DNA文库与SELEX缓冲液的混合液，与每种病毒各50 µL（5 × 109 拷贝/mL；例如非致病性p-SARS-CoV-2、p-SARS-CoV-1和p-H5N1）混合，在室温下孵育1小时。
  3. 封闭离心过滤器中的非特异性结合位点。在等待步骤5.2完成的同时，为后续步骤准备离心过滤器。通常使用两个离心过滤器，一个截留分子量为100 kDa，另一个为10 kDa。操作步骤与4.3相同。
  4. 洗去与非靶标病毒结合的序列。将步骤5.2中孵育后的混合液加入已封闭的100 kDa离心过滤器中，在14,000 × g 条件下离心10分钟，收集滤过液。重复洗涤两次，每次加入100 µL SELEX缓冲液，并在14,000 × g 条件下离心10分钟。保留滤过液部分。
  5. 将单链DNA文库与致病性病毒孵育（正向筛选步骤）。取步骤5.4中获得的300 µL滤过液，加入50 µL致病性病毒（1 × 108 拷贝/mL），在室温下孵育2小时。随后按照步骤4.4至4.11进行操作。

6. 监测SELEX过程

注意：为监测文库的富集情况，qPCR 以两种方式使用。首先，通过绝对定量，可以检测文库的富集程度（洗脱产量）。其次，通过监测熔解曲线，可评估文库的多样性（适配体物种的趋同情况）30。

  1. 在专用于 qPCR 的 96 孔板中，以 10 µL 反应体积进行所有 qPCR 检测。
  2. 配制标准 qPCR 混合液，包含 5 µL 预混液、每种未标记引物（500 nM）0.3 µL、3.4 µL H2O 和 1 µL DNA 模板。
    1. 对纯化的单链 DNA 文库（步骤 2.3）进行系列稀释，用于运行标准曲线。
    2. 稀释 DNA 样品，使其浓度落在标准曲线范围内。对于 Ria 样品，向 qPCR 混合液中加入 1 µL 未稀释样品和 1 µL 1:10 稀释样品。对于 Rix 样品，使用 1:10 或 1:100 的稀释度。
  3. 按照以下程序运行 qPCR：首先在 98 °C 下进行 2 分钟的初始变性；然后进行 40 个循环，每个循环包括在 98 °C 下变性 5 秒，以及在 52 °C 下退火和延伸 10 秒；最后进行熔解曲线分析，温度从 65 °C 升至 95 °C。通过自动阈值分析确定阈值循环（Ct）值。
  4. 利用标准曲线定量 Ria 和 Rix 样品中单链 DNA 的含量。
  5. 计算洗脱产率，即结合的 DNA 量（Ria 中的摩尔数）除以初始 DNA 量（Ri-1x 中的摩尔数）。绘制洗脱产率随轮次变化的曲线，以观察是否出现随轮次增加的富集效应。
  6. 绘制不同轮次的熔解曲线。随着轮次增加，预期在 75/85 °C 附近的峰向更高熔解温度偏移，表明文库的多样性降低。

7. 高通量测序

  1. 与高通量测序机构协商，确定可提供的测序类型和测序规模，这将决定文库制备方法。
    注意：此决策需同时考虑待测序文库片段的长度（包括引物）以及提交的文库数量（通常每文库至少需获得 1 × 105–106 条序列）。若特定测序规模无法读取文库的全长序列，可采用双端测序（paired-end sequencing）从序列两端进行读取，而非常规的仅从一端读取的单端测序（single-end sequencing）。
  2. 根据测序类型，并在与测序机构协商后，选择合适的商业化试剂盒。制备代表高、中、低富集程度以及最终轮次的多个文库，并为每个文库在接头中使用不同的索引对，从而允许在同一个测序通道中对所有轮次的样本进行分析。
    注意：也可通过PCR扩增来引入高通量测序所需的接头和索引，但其成本通常与商业化试剂盒相近，且性能并无优势。
    1. 按照以下步骤进行文库制备：对断裂的DNA进行末端修复、接头连接，以及PCR扩增，以生成最终文库。
    2. 根据制造商说明书，使用磁性DNA纯化 beads 对PCR产物进行纯化。
    3. 使用基于荧光的定量试剂盒对DNA进行定量。避免使用准确性较低的方法，如微量紫外吸光度测定。
    4. 将含有特定索引的各个文库按DNA量（而非体积）大致等量混合。
    5. 使用qPCR定量和DNA片段分析仪检测最终文库的质量。此步骤通常由测序机构完成。
      注意：测序机构的技术人员可提供有关文库制备方法及推荐质量控制措施的有用信息。在文库制备前，必须与他们进行沟通讨论。
  3. 按照测序机构的要求，将制备好的最终文库送至测序机构。

8. 测序分析

  1. 目前大多数可用于测序分析的软件均设计为在 Linux 操作系统下的命令行环境中运行。对于小型数据集，可在个人计算机上设置所需的 Linux 操作系统并安装必要的程序；对于大型数据集，建议在高性能计算资源或超级计算机上运行高通量测序（HTS）分析。
    注意：使用高性能计算资源需要申请访问权限并接受相关培训，获取这些权限可能需要一定时间。此外，还需具备基本的 UNIX 命令行使用知识。网上有许多关于命令行基础操作的免费资源，而计算资源提供方通常也会为其系统使用提供额外的指导信息。
  2. 根据测序机构提供的信息，获取测序文件，这些文件通常为压缩的 FastQ 格式。
    1. 使用 FTP 客户端将文件传输至您自己的计算机和/或高性能计算资源。许多测序分析程序可直接使用压缩文件，因此在可能的情况下应保持文件的压缩状态，以减小文件体积（例如，包含 5000 万条以上序列的测序数据在解压后可能占用超过 100 GB 的存储空间）。
    2. 如果需要解压序列文件，请使用大多数 Linux 系统中标准配备的 gzip 工具。通过在命令行中输入 "man gzip" 命令，可从系统手册中获取有关 gzip 及其选项的详细信息。
  3. 在分析前对序列进行清理，包括去多重化（demultiplexing）、去除测序接头、剔除低质量读段，并整合正向和反向读段。
    1. 在完成以下每一步操作后，使用 FastQC 程序31对序列进行基本的质量控制评估，以判断每步清理步骤的效果。
    2. 对序列进行去多重化处理，根据测序接头中包含的索引（indexes），将单个读段文件中的所有序列划分为不同的样本池。此步骤通常由测序机构完成，建议咨询测序机构，因为具体操作流程取决于所使用的测序仪器。
    3. 使用命令行程序 Cutadapt32 去除测序接头。在“Linked Adapter”模式下，应使用选择引物（而非测序接头）作为输入。使用 --discard-untrimmed 选项以剔除不含选择引物的序列。
    4. 设置适配子匹配的最大错误率，以及可接受序列的最小和最大长度。若使用双端测序数据，需输入相应的参数，并提供 Read 1 和 Read 2 两个测序文件。根据需要参考 Cutadapt 手册32 设置其他参数。
      注意：测序接头与文库的连接是方向无关的，因此大约 50% 的序列将以正向插入，另外 50% 以反向插入。为避免丢失反向插入的 50% 序列，可使用选择引物的反向互补序列作为输入，再次运行 Cutadapt。
    5. （可选）若使用双端测序，可使用 PEAR33 程序将 Read 1 和 Read 2 文件合并。
    6. 使用 FASTX-Toolkit 程序34 剔除在任一核苷酸位置质量低于设定阈值的低质量序列。质量截断值设为 30 是一个良好的起始点。如果整体测序质量较高，此步骤可跳过。
    7. 为将反向序列文件与正向序列文件合并，首先使用 FASTX-Toolkit 中的 fastx_reverse_complement 功能对反向序列文件进行反向互补处理，然后使用 Linux 系统内置的 cat 程序（大多数 Linux 系统均具备）将正向序列文件与反向互补后的反向序列文件合并为一个单一文件。
  4. 为分析不同筛选文库中序列的富集情况，使用 FASTAptamer 分析工具包35。
    1. 使用 FASTAptamer-Count 统计每条序列出现的次数，然后按丰度对序列进行排序和分级。该计数输出文件是所有其他 FASTAptamer 程序所必需的输入文件。
    2. 使用 FASTAptamer-Clust 将文件中的所有序列按相似性聚类为若干簇。使用 "distance" 参数定义允许的单核苷酸突变或插入/缺失（indel）数量，以决定序列是否归入同一簇。
      注意：若序列中存在大量唯一序列（尤其在筛选早期轮次中），FASTAptamer-Clust 程序的计算开销可能极高，完全运行可能需要数天甚至数周。可使用截断过滤参数排除低丰度序列，以减少聚类计算量。通常建议从较高的截断值开始（如每百万读段中 10 或 5 次），若程序运行较快，可逐步降低该值。若文库高度异质，则可能无法在合理时间内完成序列聚类。
    3. 使用 FASTAptamer-Enrich 计算在多轮筛选中出现的每条序列的富集倍数。通过比较某序列在一个群体中的 RPM 值与其在另一群体中的 RPM 值来实现。Enrich 程序可作用于 Count 文件或 Cluster 文件。输出为制表符分隔值（.tsv）文件，可在任意电子表格软件中打开，便于进一步分析和排序。
      注意：若存在大量唯一序列，FASTAptamer-Enrich 程序也可能具有很高的计算开销。可使用截断过滤参数排除低丰度序列，以避免生成过大文件导致无法在电子表格软件中打开。
    4. （可选）若多个文库高度异质（即唯一序列多而重复序列少），则可能无法有效使用 Clust 或 Enrich 程序。此时，可使用 Count 输出文件进行手动富集分析。该文件按序列丰度排序（丰度最高者在前），并重命名序列标识符以包含 RPM 等关键信息。
      1. 在 Count 文件上使用标准 Linux "head" 命令获取丰度最高的序列列表，然后使用标准 Linux "grep" 命令在所有其他相关文库的 Count 文件中搜索这些高丰度序列。若发现匹配项，可通过修改后的序列标识符确定其在该文库中的 RPM 值，从而手动构建富集信息。
        注意：所有测序分析步骤的脚本均可在 补充代码文件 1-11 中找到。

9. 适配体结合验证与检测

  1. 根据序列分析获得的富集信息，基于在后续筛选轮次中富集程度最高和/或在最终筛选轮次中丰度最高的序列，确定候选适配体序列。选择多个不同的候选序列（至少10-20个）进行进一步测试，因为富集程度最高的序列未必是性能最佳的适配体。
  2. 使用可对多个样本快速进行的结合实验对候选适配体进行初步筛选。基于色谱柱的超滤结合实验36或酶联寡核苷酸检测（ELONA）是适用于此初步筛选的良好方法。
  3. 对在初步筛选中表现出最佳结合活性的序列，使用至少两种独立的结合实验方法分析其特异性和亲和力（例如：微量热泳动技术（MST）37,38、酶联寡核苷酸检测（ELONA）39、表面等离子共振40或生物膜干涉技术（BLI）41）。

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结果

由于DNA适配体可以在试管中通过SELEX技术获得15，因此本SELEX策略经过精心设计，既包含针对完整且具有感染性的完整病毒的正向筛选步骤（即保留能够与感染性病毒结合的DNA分子），也包含针对经特定消毒方法（特别是紫外线处理）灭活后的同种病毒的反向筛选步骤，通过剔除能与非感染性病毒结合的DNA序列来实现特异性富集。该筛选过程的示意图如图1所示。

作为本实验方案的代表性结果，我们选择了针对具有感染性的SARS-CoV-2病毒的适配体筛选。由于操作完整且具有感染性的SARS-CoV-2病毒需要在生物安全三级（BSL3）条件下进行，因此我们转而采用假病毒系统。假病毒是基于一种相对无害的骨架病毒（本研究中为慢病毒HIV）构建而成，通过在其病毒包膜中表达目标病毒的表面蛋白，使其能够模拟目标病毒的表面结构和入侵机制，同时避免操作高致病性人类病原体所带来的风险。重要的是，这些假病毒经过改造，无法持续进行病毒复制25, ...

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讨论

SELEX技术不仅能够筛选出具有高亲和力（pM至nM范围）22,43,44,45的适配体，还能获得具有高选择性且可调控选择性的适配体。通过利用反向筛选策略，可以获得具有挑战性区分能力的适配体。例如，Li研究组已证明能够获得可区分致病性与非致病性细菌菌株的序列21。此外，Le等人鉴定出一种能够区分化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes）不同血清型的适配体46。这为将具有独特选择性的适配体分子整合到不同的功能化DNA传感器12,47,48,

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们希望感谢来自芝加哥伊利诺伊大学的劳拉·M·库珀女士（Ms. Laura M. Cooper）和龙立军博士（Dr. Lijun Rong），他们为本实验方案提供了所用的假病毒样本（SARS-CoV-2、SARS-CoV-1、H5N1）；同时感谢来自厄巴纳-香槟伊利诺伊大学罗伊·J·卡弗生物技术中心DNA服务设施的阿尔瓦罗·埃尔南德斯博士（Dr. Alvaro Hernandez）和克里斯·赖特博士（Dr. Chris Wright）在高通量测序方面给予的协助；并感谢卢课题组众多成员在本研究中提供的帮助 体外 筛选与适体表征技术。本研究得到了美国国家科学基金会快速响应研究计划（CBET 20-29215）以及伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校可持续性、能源与环境研究所和伊利诺伊-江苏产业技术研究院（JITRI 23965）种子基金的资助。A.S.P. 感谢PEW拉丁美洲研究员项目提供的经费支持。我们还感谢罗伯特·A·韦尔奇基金会（Grant F-0020）对德克萨斯大学奥斯汀分校Lu课题组研究项目的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10% 过硫酸铵（APS）伯乐（BioRad）1610700
100% 乙醇Sigma-AldrichE7023
不含钙的1x PBS &和镁康宁21-040-CM
40% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺（29:1）溶液伯乐（BioRad）1610146
Agencourt AMPure XP 磁珠贝克曼库尔特A63880DNA 纯化磁珠 - 第 7.2.2 节
Amicon Ultra-0.5 离心滤过装置默克UFC501024截留分子量 10 kDa
Amicon Ultra-0.5 离心滤过装置默克UFC510024截留分子量 100 kDa
硼酸Sigma-Aldrich100165
C1000 Touch 双 48/48 快速反应模块热循环仪伯乐（BioRad）1851148
氯化钙Sigma-AldrichC4901
CFX Connect 实时荧光定量 PCR 检测系统伯乐（BioRad）1855201
数字干浴器/金属浴加热器赛默飞世尔科技88870001
Dynabeads MyOne Streptavidin C1赛默飞世尔科技65001链霉亲和素修饰的磁珠 - 第4.9节
EDTA 二钠盐Sigma-Aldrich324503
Eppendorf Safe-Lock 微量离心管Sigma-AldrichT96611.5 mL
Lenti-X p24 快速滴定试剂盒Takara Bio USA, Inc.632200慢病毒定量试剂盒 - 第 3.3.2.1 节
MagJET 分离架，12 × 1.5 mL 管赛默飞世尔科技MR02
氯化镁Sigma-AldrichM8266
Microseal 'B' PCR板密封膜，带粘合剂，光学级BioRadMSB1001非紫外吸收
用于 Ready Gel 预制胶的 Mini-PROTEAN Tetra 电泳槽BioRad1658004EDU
Mini-PROTEAN 短板BioRad1653308
带有0.75 mm一体式垫片的Mini-PROTEAN间隔板伯乐（BioRad）1653310
分子生物学级水Lonza51200
96孔PCR板，高型，无裙边，透明伯乐（BioRad）MLP9611
Nanodrop One赛默飞世尔科技ND-ONE-W
OneTaq DNA聚合酶新英格兰生物实验室M0480S
Ovation Ultralow v2 + UDITecan0344NB-A01高通量测序文库制备试剂盒 - 第7.2节
PIPETMAN G（100-1000） µ升，20-200 µL，2-20 µL 和 0.2-2 µLGilsonF144059M, F144058M, F144056M, F144054M
Purifier Logic+ II级A2型生物安全柜Labconco4261
Qubit dsDNA BR 测定试剂盒InvitrogenQ32850基于荧光的  dsDNA 定量  试剂盒 - 第7.2.3节
SHARP Classic 低吸附移液器吸头（10 μL，200 μL，1000 μL）托马斯科学公司1158U43, 1159M44, 1158U40
乙酸钠Sigma-AldrichS2889
氯化钠Sigma-AldrichS7653
Sorvall Legend Micro 17R 微型离心机赛默飞世尔科技75002440
SsoFast EvaGreen Supermix伯乐（BioRad）1725201qPCR预混液 - 第6.2节
三(羟甲基)氨基甲烷Sigma-AldrichT1503
管子和超透明盖，8个一排的连排管美国科学AB1183PCR管
尿素Sigma-AldrichU5128

参考文献

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SELEX DNA qPCR

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