Method Article

体外选择核酸适配体以区分感染性和非感染性病毒

DOI:

10.3791/64127

⸱

September 7th, 2022

 ,  ,  , 
1INQUIMAE (CONICET), Departamento de Química Inorgánica, Analítica y Química Física, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires, 2Department of Chemistry, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Department of Chemistry, University of Texas at Austin

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们提供的方案通常可以应用于选择仅与感染性病毒结合的适配体，而不应用于通过消毒方法或任何其他类似病毒变得非传染性的病毒。这为在便携式和快速检测中确定感染性状态提供了可能性。

Abstract

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病毒感染对社会有重大影响;大多数检测方法难以确定检测到的病毒是否具有传染性，导致治疗延误和病毒进一步传播。开发能够告知临床或环境样本可感染性的新型传感器将应对这一未满足的挑战。然而，很少有方法可以获得能够识别完整传染性病毒并将其与通过消毒方法变得非传染性的同一病毒区分开来的传感分子。在这里，我们描述了一种选择适配体的方案，该适配体可以通过指数富集（SELEX）对配体进行系统进化来区分感染性病毒和非感染性病毒。我们利用了SELEX的两个功能。首先，SELEX 可以量身定制，以使用计数器选择来去除竞争目标，例如非传染性病毒或其他类似病毒。此外，整个病毒可以用作SELEX的靶标，而不是例如病毒表面蛋白。全病毒SELEX允许选择与病毒天然状态特异性结合的适配体，而无需破坏病毒。因此，该方法允许基于病原体表面的功能差异获得识别剂，而不需要事先知道。

Introduction

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病毒感染在世界各地具有巨大的经济和社会影响，最近的COVID-19大流行越来越明显。及时准确的诊断对于治疗病毒感染同时防止病毒传播给健康人至关重要。虽然已经开发了许多病毒检测方法，例如PCR测试1，2和免疫测定3，但目前使用的大多数方法都无法确定检测到的病毒是否真的具有传染性。这是因为仅存在病毒成分（例如病毒核酸或蛋白质）并不表明存在完整的传染性病毒，并且这些生物标志物的水平与感染性相关性较差4，5，6。例如，通常用于当前基于 PCR 的 COVID-19 测试的病毒 RNA 在感染的早期阶段患者具有传染性时水平非常低，而当患者从感染中康复并且不再具有传染性时，RNA 水平通常仍然很高7，8.病毒蛋白或抗原生物标志物遵循类似的趋势，但通常比病毒RNA出现得更晚，因此更不能预测感染性6，9。为了解决这一限制，已经开发了一些可以告知病毒感染状态的方法，但基于细胞培养微生物学技术，需要很长时间（几天或几周）才能获得结果4，10。因此，开发新的传感器，可以告知临床或环境样本的可感染性，可以避免治疗延误和病毒的进一步传播。然而，很少有方法可以获得能够识别完整感染性病毒粒子并将其与已变得非传染性的同一病毒区分开来的传感分子。

在这种情况下，核酸适配体特别适合作为独特的生物分子工具11，12，13，14。核酸适配体是具有特定核苷酸序列的短单链DNA或RNA分子，允许它们形成特定的3D构象以识别具有高亲和力和选择性的靶标15，16。它们是通过称为指数富集配体系统进化（SELEX）的组合选择过程获得的，也称为体外选择，该过程在具有10 14-1015序列的大型随机DNA采样文库的试管中进行 17，18，19.在该迭代过程的每一轮中，首先通过在所需条件下与靶标孵育来对DNA库进行选择压力。然后删除任何未与目标结合的序列，只留下那些在给定条件下能够结合的少数序列。最后，通过PCR扩增上一步中选择的序列，用下一轮选择所需的功能序列丰富池中的群体，并重复该过程。当选择池的活性达到平台期（通常在8-15轮后）时，通过DNA测序分析文库，以确定表现出最高亲和力的获胜序列。

SELEX具有独特的优势，可以利用这些优势来提高对其他类似靶标20，21的选择性，例如病毒22的感染性状态。首先，可以使用多种不同类型的靶标进行选择，从小分子和蛋白质到整个病原体和细胞16。因此，为了获得与感染性病毒结合的适配体，可以使用完整的病毒作为靶标，而不是病毒表面蛋白19。全病毒SELEX允许选择与病毒天然状态特异性结合的适配体，而无需破坏病毒。其次，SELEX可以定制以去除竞争靶标21，23，例如其他类似病毒或非传染性灭活病毒，使用每轮选择22中的计数器选择步骤。在计数器选择步骤中，DNA库暴露于不需要结合的靶标，并且任何结合的序列都被丢弃。

在这项工作中，我们提供了一种协议，该协议通常可用于选择与感染性病毒结合的适配体，但不能与通过特定消毒方法或另一种相关病毒结合的同一病毒结合。该方法允许基于病毒表面的功能差异获得识别剂，不需要事先知道，因此为检测新出现的病原体或研究不足的疾病提供了额外的优势。

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Protocol

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1. 试剂和缓冲液的制备

  1. 通过加入 0.9 M 三硼碱、0.9 M 硼酸、20 mM EDTA（二钠盐）和去离子水至最终体积为 1 L 来制备 10x 三硼酸盐 EDTA（10x TBE）。
  2. 制备10%变性聚丙烯酰胺储备溶液，如下所示。在 250 mL 玻璃瓶中，加入 120 g 尿素 （8 M）、25 mL 10x TBE、62.5 mL 40% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺 （29:1） 溶液和足够的蒸馏水以达到 250 mL 的最终体积。混合直至所有成分溶解。
  3. 准备2x上样缓冲液，如下所示。在 50 mL 管中，加入 21.636 g 尿素 （8 M）、1.675 g EDTA （1 mM） 和 4.5 mL 10x TBE。用蒸馏水填充至 45 mL 并混合直至所有组分溶解。
  4. 通过加入100mM乙酸钠和1mM EDTA（二钠盐）制备提取缓冲液。将最终pH值设置为5。
  5. 按如下方式制备乙醇沉淀溶液。制备3 M乙酸钠，调节至pH 5.2，并储存在4°C。 制备70%乙醇v / v并储存在-20°C。 制备100%乙醇并储存在-20°C。
  6. 制备 500 mL 含有 1x PBS、2.5 mM 氯化镁 2 和 0.5 mM 氯化钙2 的 SELEX 缓冲液。调节至 pH 7.4。通过添加 1x PBS、2.5 mM 氯化镁 2、0.5 mM 氯化钙2 和 8 M 尿素，制备 100 mL 含有 8 M 尿素的 SELEX 缓冲液。调节至 pH 7.4。
    注意:SELEX缓冲液的选择对于确保所选适配体适用于将应用适配体的最终样品至关重要。例如，SARS-CoV-2特异性适配体将用于生物样本（例如唾液或鼻咽拭子）。因此，选择与目标生物样品中的这些条件非常相似的离子浓度、pH和缓冲液非常重要。
  7. 按如下方式制备结合和洗涤缓冲液。在 50 mL 管中，制备 5 mM Tris、0.5 mM EDTA（二钠盐）和 2 M NaCl。调节至 pH 7.5。

2. DNA文库和引物的设计与合成

  1. 使用以下标准设计初始ssDNA文库和引物（参见 表1 示例ssDNA文库和引物集，其中N表示随机核苷酸位置）。
    1. 确保文库包含一个由 35 至 60 个核苷酸组成的中心随机区域，两侧是 3' 和 5' 端的两个恒定序列，作为扩增的引物区域。典型的文库长度为45个随机核苷酸。
    2. 确保反向引物含有生物素修饰，以在 体外 选择过程中使用链霉亲和素包被的磁珠从扩增的双链PCR产物中分离ssDNA。
  2. 通过标准脱盐纯化从商业来源购买DNA寡核苷酸。通过10%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（dPAGE）纯化ssDNA文库和引物，然后根据标准程序进行乙醇沉淀24。
    注意:丙烯酰胺单体和溴化乙锭是危险化学品（人类致癌物），因此在进行PAGE时请使用适当的个人防护设备（实验室外套，手套和护目镜）。如果可能，避免使用溴化乙锭，并用更安全的染料代替。
    注意:可以使用HPLC纯化订购寡核苷酸以避免执行此纯化步骤，尽管这不会有效地去除短寡核苷酸。
  3. 加入无核酸酶的水，在乙醇沉淀至所需浓度（100μM）后重悬ssDNA。通过λ = 260nm处的紫外吸收确定ssDNA文库和引物的浓度。储存在-20°C。
  4. 购买未修饰的逆转录引物，用于高通量测序文库制备和qPCR定量。

3. 传染性和非传染性病毒样本

注意:传染性和非传染性病毒样本是生物安全2级（BSL2）样本，需要格外小心才能安全适当地处理。包含这些样品的程序的所有步骤必须在生物安全柜中进行，或者病毒溶液必须在密封容器中（例如，带盖的塑料管）中进行。

  1. 按照每种病毒的相应方案获取传染性病毒的储备溶液或制备它们。这里使用的SARS-CoV-2、SARS-CoV-1和H5N1假病毒由容丽君教授的实验室（UIC）在PBS缓冲液中提供，并按照报告的协议22，25，26制备。
    注意:对于需要生物安全3级设施来处理完整传染性病毒的病毒，可以使用假病毒。假型病毒是由慢病毒（HIV）产生的，该病毒在病毒包膜内显示病毒的表面蛋白，因此与病毒的表面和进入机制非常相似，但在连续病毒复制中存在缺陷。
  2. 获取非传染性病毒储备溶液或按照消毒程序制备。这里使用的紫外线灭活SARS-CoV-2假病毒（p-SARS-CoV-2）储备液由荣教授实验室（UIC）在PBS缓冲液中提供，先前报道的方案用于紫外线灭活22。
    注意:如果可能，请进行检测以测试病毒的传染性，以确保病毒已完全灭活。
  3. 量化病毒库存
    1. 根据标准程序27，28，29使用斑块测定法定量病毒。该测定不仅可以量化病毒，还可以指示病毒的传染性状态，确认传染性病毒的浓度。
    2. 对于假病毒或无法进行斑块检测的病毒，使用市售的定量慢病毒 ELISA 试剂盒对病毒进行定量分析。
    3. 制备 1 x 108 拷贝/mL 的 p-SARS-CoV-2、p-SARS-CoV-1 和 p-H5N1 储备溶液。将每种储备溶液以含有 50 μL 的等分试样分离，并保持在 -80 °C。 在每次实验前解冻新的等分试样。

4. 体外 筛选或SELEX工艺:首轮

注:对于使用传染性病毒的所有步骤，请在BSL2机柜中工作。

  1. 使ssDNA文库变性。取 10 μL 的 100 μM ssDNA 文库 （1 nmol），与 240 μL SELEX 缓冲液混合。在干浴中以95°C加热15分钟，然后将管放在冰上15分钟。
  2. 将ssDNA文库与感染性病毒孵育（阳性选择步骤），如下所示。将步骤 4.1 中的 SELEX 缓冲液中的 250 μL ssDNA 文库与 50 μL 感染性病毒（1 x 108 拷贝/mL）混合。在室温下孵育2小时。
  3. 按如下方式阻塞离心过滤器中的非特异性位点。在等待步骤4.2时，准备离心机过滤器以进行后续步骤。
    1. 向将使用的每个 0.5 mL 离心过滤器中加入 400 μL 1 mM T20 序列（表 1），一个离心过滤器的截止值为 100 kDa，一个截止值为 10 kDa。
    2. 在室温下孵育30分钟，并以14，000× g 离心10分钟以除去过滤器中的T20溶液。用 SELEX 缓冲液洗涤 3 次以去除多余的 T20 序列。
  4. 按如下方式洗涤未绑定的序列。将步骤4.2中孵育的混合物加入阻塞的100kDa离心机过滤器中，并以14，000× g 离心10分钟。洗涤 3 次，加入 400 μL SELEX 缓冲液，并以 14，000 x g 离心 10 分钟。将馏分保留在过滤器中并丢弃流出物。
  5. 洗脱结合序列如下所述。
    1. 更换离心过滤器的收集管，并在步骤 4.4 中向离心机过滤器中加入 300 μL 含有 8 M 尿素的 SELEX 缓冲液。在干浴中将离心机过滤器在95°C下加热15分钟，然后以14，000× g 离心10分钟。
    2. 收集流过含有洗脱序列的过滤器的馏分。再重复三次。在BSL2机柜中工作，用10%漂白剂清洗所有材料以灭活病毒，然后再丢弃材料。
  6. 浓缩和脱盐如下。将4.5中收集的溶液添加到封闭的10 kDa离心机过滤器中。以14，000 x g 离心15分钟。丢弃流过过滤器的馏分。
    注意:由于在上一步中过滤器中用8 M尿素保留和灭活病毒，因此无需在生物安全柜中执行此步骤和以下步骤。如果使用 0.5 mL 离心管，则需要重复此过程，直到按照步骤 4.5 收集所有溶液，1.2 mL 流过过滤器。
  7. 用 300 μL SELEX 缓冲液洗涤 3 次，以 14，000 x g 离心 15 分钟以除去尿素。丢弃流过过滤器的馏分。通过在干净的收集管中将其倒置并离心5分钟来回收过滤器中的溶液。
  8. 使用塑料管中的移液器测量从4.7开始的回收溶液的最终体积。此解决方案命名为 Ri a，其中 i 对应于整数。通常，获得 30 μL 至 50 μL 的体积。取 1 μL 洗脱的 ssDNA 通过 qPCR 定量 DNA 的量。
    注意:这是一个可能的暂停点，其中R1a样品可以保持在-20°C以在另一个时间继续。
  9. 如下所述进行PCR扩增。
    1. 在第一轮中，取 R1样品的 90% 作为 PCR 模板。在接下来的几轮中，取步骤4.8中总体积的60%进行PCR并将其他级分储存在-20°C。
    2. 设置具有指定终浓度的以下 50 μL PCR 反应:1x PCR 反应缓冲液、200 μM dNTP、10 μL DNA 模板（R 1 个样品）、每个引物 200 nM 和1.25U 聚合酶（2.5 U/μL 储备液）。
    3. 优化PCR条件，包括每组引物和ssDNA文库的循环次数和退火温度。避免使用过多的循环，这将产生不需要的PCR副产物，例如引物二聚体。根据底漆的熔解温度测试不同的退火温度。
    4. 使用优化条件在95°C下运行PCR5分钟，然后在95°C下运行18个循环，在52°C下30秒，在72°C下1分钟，最后延伸步骤在72°C下10分钟，以获得dsDNA库。
      注意:这是另一个可能的暂停点，PCR产物可以保持在-20°C以在另一个时间继续。
  10. 使用链霉亲和素修饰的磁珠回收ssDNA。
    1. 取80%的PCR产物。将剩余的馏分储存在-20°C。
    2. 将 PCR 产物分成 50 μL 的等分试样，并将它们添加到含有 50 μL 链霉亲和素修饰磁珠 （MB） 的微量离心管中。在室温下温和搅拌（例如，使用旋转摇床）孵育30分钟。然后，将微量离心管放在磁性架上以分离MB并通过移液除去上清液（必须是澄清溶液）。
    3. 通过向管中加入 200 μL 结合和洗涤缓冲液进行洗涤。从磁性管架上取下试管，敲击试管，然后通过移液将MB重悬到均匀的溶液中。将微量离心管放回磁性架上以分离MB并通过移液除去上清液。重复此洗涤步骤两次。
    4. 洗涤完成后，将MB重悬于总共100μL的SELEX缓冲液中，并将溶液加热至95°C10分钟。在试管冷却之前立即将试管放入磁性架中，并取含有ssDNA池的上清液。重复此恢复步骤，加入 50 μL SELEX 缓冲液。
  11. 使用移液管测量从4.10开始的回收馏分的最终体积。这个分数被命名为 Ri x，其中 i 对应于整数。通常，获得的体积在 140 至 150 μL 之间。取 1 μL R1x 通过 qPCR 定量 DNA 的量。

5. 后续选拔轮次

  1. 使ssDNA库变性。取 60% 的样品 R1x 并与 50 μL SELEX 缓冲液混合。在干浴中在95°C下加热15分钟。将试管放在冰上15分钟。
  2. 将ssDNA库与非感染性病毒和其他潜在的干扰病毒一起孵育（计数器选择步骤）。将变性 ssDNA 库与 5.1 的 SELEX 缓冲液中与每种病毒 50 μL （5 x 109 拷贝/mL;例如，非感染性 p-SARS-CoV-2、p-SARS-CoV-1 和 p-H5N1）混合。在室温下孵育1小时。
  3. 阻断离心过滤器中的非特异性位点。在等待步骤5.2.时，准备离心机过滤器以进行后续步骤。通常，使用两个离心机过滤器，一个截止值为100 kDa，另一个截止值为10 kDa。遵循与 4.3 中相同的过程。
  4. 洗去与非目标病毒结合的序列。将步骤5.2中孵育的混合物添加到封闭的100 kDa离心机过滤器中。以14，000× g 离心10分钟，并回收流经离心机过滤器的部分。洗涤 2 次，加入 100 μL SELEX 缓冲液，并以 14，000 x g 离心 10 分钟。保留流过过滤器的分数。
  5. 用传染性病毒孵育ssDNA库（阳性选择步骤）。取步骤 5.4 中的 300 μL 级分，与 50 μL 感染性病毒（1 x 108 拷贝/mL）混合。在室温下孵育2小时。按照步骤 4.4 到 4.11 操作。

6. 监控 SELEX 流程

注意:为了监测池的富集，qPCR以两种方式使用。首先，通过绝对定量，可以测试储液池的富集度（洗脱产率）。其次，通过监测熔融曲线，可以评估池的多样性（适配体种类的收敛性）30。

  1. 在专为 qPCR 设计的 96 孔板中以 10 μL 反应体积执行所有 qPCR 测定。
  2. 制备含有 5 μL 预混液、0.3 μL 500 nM 每种未标记引物、3.4 μL H2O 和 1 μL DNA 模板的标准 qPCR 混合物。
    1. 准备纯化的ssDNA文库的稀释液（步骤2.3）以运行标准曲线。
    2. 稀释DNA样品，使其浓度适合标准曲线。对于 Ria 样品，向 qPCR 混合物中加入 1 μL 不稀释的样品和 1 μL 1:10 稀释液。对于 Rix 样品，包括 1:10 或 1:100 稀释液。
  3. 通过设置以下协议运行 qPCR。首先，在98°C下设置初始变性步骤2分钟。然后，在98°C下设置40个变性循环5秒，在52°C下退火和延伸10秒。最后，设置65至95°C的熔解曲线分析。 通过自动阈值分析确定阈值周期 （Ct） 值。
  4. 使用标准曲线，量化R i a和Rix样品中ssDNA的量。
  5. 洗脱产量计算为结合的DNA量（R i a中的摩尔数）除以初始DNA的量（Ri-1x中的摩尔数）。绘制洗脱产率与轮数的关系图，以查看是否观察到各轮的富集。
  6. 绘制不同轮次的熔化曲线。随着轮数的增加，预计在接近75/85°C的峰值处将转向更高的熔化温度。这意味着池的多样性减少。

7. 高通量测序

  1. 请咨询高通量测序机构，了解可用的测序类型和规模，这将决定文库制备方法。
    注意:该决定将考虑要测序的池的长度（包括引物）和要提交的池的数量（通常，每个池至少针对1 x 105-10 6个序列）。如果特定的测序量表无法读取池的整个长度，则可以使用配对端测序从序列的两端读取，而不是仅从一端读取的单端。
  2. 与测序机构协商，根据测序类型选择合适的市售试剂盒。准备代表高、中和低富集的多个选择轮次池，以及最终池，在每个池的适配器中使用不同的索引对，允许使用一个通道对所有轮次进行样本分析。
    注意:PCR扩增也可用于整合高通量测序所需的适配器和索引，但这通常成本与商业试剂盒相似，并且性能不会更好。
    1. 按照以下步骤进行文库制备:片段DNA的末端修复、衔接子连接和PCR扩增以产生最终文库。
    2. 按照制造商的说明，用磁性DNA净化微球纯化PCR产物。
    3. 使用基于荧光的定量试剂盒定量 DNA。避免使用不太准确的方法，例如小体积紫外线测量。
    4. 混合包含特定索引的每个池文库的大约相等量（按DNA量，而不是体积）。
    5. 使用qPCR定量和DNA片段分析仪检查最终文库的质量。此步骤通常由测序工具执行。
      注意:测序设施人员可以提供有关如何准备文库以及建议进行哪些质量控制的有用信息。在准备库之前，需要与他们讨论。
  3. 按照他们的要求将准备好的最终文库发送到测序设施。

8. 测序分析

  1. 大多数可用于测序分析的软件都设计为在 Linux 操作系统的命令行上运行。对于小型数据集，设置所需的Linux操作系统并在个人计算机上安装所需的程序;对于较大的数据集，HTS 分析在高性能计算资源或超级计算机上运行（推荐）。
    注意:使用高性能计算资源需要访问和培训，这可能需要一些时间才能获得。此外，还需要具备 UNIX 命令行用法的基本知识。许多有关基本命令行用法的免费资源都可以在线获得，计算资源可能会为使用其系统提供其他信息。
  2. 使用测序工具提供的信息访问测序文件，通常采用压缩的 FastQ 文件格式。
    1. 使用 FTP 客户端将文件传输到您自己的计算机和/或高性能计算资源。许多序列分析程序可以直接使用压缩文件，因此请尽可能保持文件压缩以限制其文件大小（50 M+ 序列的大序列读取在未压缩时可能会占用 100 Gb+ 的文件空间）。
    2. 如果需要解压缩序列文件，请使用大多数 Linux 安装中标配的 gzip 函数。通过在命令行上键入"man gzip"，从已安装的手册中获取有关 gzip 及其选项的其他信息。
  3. 在分析之前，通过解复用、删除排序适配器、删除低质量读取以及包括正向和反向读取来清理序列。
    1. 在完成以下每个步骤后，使用FastQC程序31 获取有关序列的基本质量控制信息，以评估每个净化步骤的有效性。
    2. 解复用序列，以根据排序适配器中包含的索引将所有序列从单个读取文件分离到不同的池中。此步骤通常由测序机构执行，应咨询他们，因为确切的程序将取决于所使用的测序机。
    3. 使用命令行程序 Cutadapt32 删除排序适配器。在链接适配器模式下使用选择引物（而不是排序适配器）作为输入。使用 --discard-untrimmed 选项可丢弃不包含选择引物的任何序列。
    4. 设置最大错误率选项以匹配适配器，以及要接受的序列的最小和最大长度。如果使用配对结束读取，请输入可用的特定参数，并提供读取 1 和读取 2 排序文件。根据需要，参考 Cutadapt 手册32 设置其他参数。
      注意:测序适配器与池的连接与方向无关，将包含大约 50% 的正向序列和 50% 的反向序列。为了避免在相反方向上丢失50%的序列，可以使用选择引物的反向补码作为输入，第二次运行Cutadapt。
    5. （可选）如果使用配对端排序，请将读取 1 和读取 2 文件与程序 PEAR33 合并。
    6. 使用 FASTX-Toolkit 程序34 去除任何核苷酸质量低于特定阈值的低质量序列。质量截止分数 30 是一个很好的起点。如果整体质量总体良好，则可以跳过此步骤。
    7. 要将反向序列文件与正向序列文件合并，请对反向文件使用 FASTX-Toolkit fastx_reverse_complement 功能。然后使用内置的 cat 程序（大多数 Linux 安装的标准）将正向和反向补码 - 反向文件合并为单个文件。
  4. 要分析不同选择池中的序列富集，请使用 FASTAptamer 分析工具包35。
    1. 使用"快速计数"来计算每个序列出现的次数。然后，按丰度对序列进行排名和排序。计数输出文件是所有其他 FASTAptamer 程序的输入所必需的。
    2. 使用 FASTAptamer-Clust 将文件中的所有序列分组到密切相关序列的簇中。使用"距离"参数定义允许分组到簇中的单个核苷酸突变或插入缺失的数量。
      注意:如果存在大量唯一序列（特别是对于早期轮次），则 FASTAptamer-Clust 程序的计算成本可能非常高，这可能需要几天甚至几周才能完全完成。截止滤波器参数可用于从聚类中排除低丰度序列。通常，最好从较高的截止值开始，例如百万分之 10 或 5 次读取 （RPM），如果程序快速完成，则降低截止值。如果池非常异构，则在合理的时间范围内对序列进行聚类可能不可行。
    3. 使用 FASTAptamer-Rich 计算多轮选择中存在的每个序列的富集。将一个总体序列的 RPM 与另一个总体中的 RPM 进行比较。对"计数"或"群集"文件使用扩充程序。输出是一个制表符分隔值 （.tsv） 文件，可以在任何电子表格软件中打开，以便进一步分析和轻松排序。
      注意:如果存在大量唯一序列，则 FASTAptamer-Rich 程序的计算成本也可能非常高。截止过滤器参数可用于从输出中排除低丰度序列，以避免文件太大而无法在电子表格软件中打开。
    4. （可选）如果许多池过于异构（许多唯一序列和很少重复序列），则可能同时使用 Clust 或 Enrich 程序是不可行的。在这种情况下，请使用 Count 输出文件执行手动富集检查，该文件按丰度（最丰富的在顶部）对序列进行排序，并重命名序列标识符以包含重要信息，例如 RPM。
      1. 在 Count 文件上使用标准的 Linux "head" 程序来获取最丰富的序列列表。然后使用标准的 Linux"grep"程序在所有其他相关池的 Count 文件中搜索每个最丰富的序列。如果有任何匹配项，请使用修改后的序列标识符确定该池中的 RPM，以手动构建扩充信息。
        注意:所有测序分析步骤的脚本都可以在 补充编码文件 1-11 中找到。

9. 核酸适配体结合验证和测定

  1. 从通过序列分析获得的富集信息中，根据在后续选择轮次中富集最多的序列和/或最终选择轮中富集最多的序列来识别候选适配体序列。选择几个不同的候选序列（至少10-20个）进行进一步测试，因为富集度最高的可能不一定是性能最佳的适配体。
  2. 使用可快速对多个样品进行的结合测定对候选适配体进行初步筛选。基于柱的超滤结合测定36 或酶联寡核苷酸测定（ELONA）是进行初步筛选的良好方法。
  3. 使用至少两种独立的结合测定（例如，微尺度热泳 （MST）37，38、酶联寡核苷酸测定 （ELONA）39、表面等离子体共振40 或生物层干涉测量 （BLI）41），分析从初始筛选中显示出最佳结合活性的序列的特异性和亲和力。

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

由于DNA适配体可以在试管15中使用SELEX获得，因此该SELEX策略经过精心设计，既包括针对完整全传染性病毒的正向选择步骤（即保留与感染性病毒结合的DNA分子），也包括针对通过特定消毒方法变得无感染性的同一病毒的反选择步骤， 特别是紫外线处理，通过丢弃可以与非感染性病毒结合的DNA序列。选择过程的示意图如图 1所示。

作为该方案的代表性结果，我们选择了用于传染性SARS-CoV-2的适配体。由于生物安全等级 3 （BSL3） 工作条件要求处理完整的传染性 SARS-CoV-2，我们选择使用假型病毒。假型病毒是由相对无害的骨干病毒（在这种情况下为一种慢病毒（HIV））产生的，该病毒已被修改以在其病毒包膜内显示不同目标病毒的表面蛋白，使其能够密切模拟所需病毒的表面和进入机制，而没有与危险的人类病原体一起工作相关的风险。重要的是，这些假病毒在连续病毒复制中被修饰为有缺陷25，

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Discussion

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SELEX不仅可以鉴定pM-nM范围为22，43，44，45的高亲和力适配体，还可以鉴定具有高可调选择性的适配体。通过利用计数器选择，可以获得具有具有挑战性选择性的适配体。例如，Li小组已经证明能够获得能够区分致病性细菌菌株和非致病菌株的序列21。此外，Le等人鉴定出一种能够区分化脓性链球菌血清型的适配体46。这开启了将不同功能DNA传感器12，47，48，49，50中具有独特选择性的适配体分子与新的纳米技术22，...

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Disclosures

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作者没有什么可透露的。

Acknowledgements

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我们要感谢伊利诺伊大学芝加哥分校的Laura M. Cooper女士和Lijun Rong博士提供该协议中使用的假病毒样本（SARS-CoV-2，SARS-CoV-1，H5N1），以及伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校Roy J. Carver生物技术中心DNA服务设施的Alvaro Hernandez博士和Chris Wright博士在高通量测序方面的帮助， 以及Lu小组的许多成员，他们帮助我们进行 体外 选择和适配体表征技术。这项工作得到了美国国家科学基金会（CBET 20-29215）的RAPID资助以及伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校和伊利诺伊-JITRI研究所（JITRI 23965）的可持续、能源和环境研究所的种子资助。A.S.P. 感谢皮尤拉丁美洲奖学金的财政支持。我们还要感谢罗伯特·韦尔奇基金会（Grant F-0020）对德克萨斯大学奥斯汀分校Lu小组研究项目的支持。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10% 过硫酸铵 （APS）BioRad1610700
100% 乙醇Sigma-AldrichE7023
1x PBS，不含钙和镁康宁21-040-CM
40% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺 （29：1） 溶液BioRad1610146
Agencourt AMPure XP 珠子Beckman CoulterA63880DNA净化微球 - 第 7.2.2 节
Amicon Ultra-0.5 离心过滤装置MerckUFC501024截留 10 kDa
Amicon Ultra-0.5 离心过滤装置MerckUFC510024截留 100 kDa
硼酸Sigma-Aldrich100165
C1000 Touch 热循环仪，带双 48/48 快速反应模块BioRad1851148
氯化钙Sigma-AldrichC4901
CFX Connect 实时荧光定量 PCR 检测系统BioRad1855201
数字干浴/模块加热器Thermo Scientific88870001
Dynabeads MyOne 链霉亲和素 C1Thermo Fisher65001链霉亲和素修饰磁珠 - 第 4.9 节
EDTA 二钠盐Sigma-Aldrich
Eppendorf Safe-Lock 微量离心管Sigma-AldrichT96611.5 mL
Lenti-X p24 快速滴度试剂盒Takara Bio USA， Inc.632200慢病毒定量试剂盒 - 第 3.3.2.1 节
MagJET 分离架，12 x 1.5 mL 管Thermo ScientificMR02
氯化镁Sigma-AldrichM8266
Microseal 'B' PCR 板密封膜，胶粘剂，光学BioRadMSB1001非紫外线吸收型
Mini-PROTEAN Tetra Cell 用于 Ready Gel 预制凝胶BioRad1658004EDU
Mini-PROTEAN 短板BioRad1653308
Mini-PROTEAN 间隔板，带 0.75 mm 集成垫片BioRad1653310
分子生物学级水Lonza51200
多板 96 孔 PCR 板，高轮廓、无裙边、透明BioRadMLP9611
Nanodrop OneThermo ScientificND-ONE-W
OneTaq DNA 聚合酶New England BioLabM0480S
Ovation 超低 v2 + UDITecan0344NB-A01高谷值测序文库制备试剂盒 - 第 7.2 节。
PIPETMAN G （100-1000 µL， 20-200 & 微量;L、2-20 和微量;L 和 0.2-2 µL）GilsonF144059M、F144058M、F144056M、F144054M
Purifier Logic+ II 类、A2 型生物安全柜Labconco4261
量子比特 dsDNA BR 检测试剂盒InvitrogenQ32850基于荧光的  dsDNA 定量  试剂盒 - 第 7.2.3 节
SHARP 经典低吸附移液器吸头（10 μL、200 μL、1000 μL）Thomas Scientific1158U43、1159M44、1158U40
乙酸钠Sigma-AldrichS2889
氯化钠Sigma-AldrichS7653
Sorvall Legend Micro 17R 微量离心机Thermo Scientific75002440
SsoFast EvaGreen 超混合液BioRad1725201qPCR 预混液 - 第 6.2 节。
三（羟甲基）氨基甲烷Sigma-AldrichT1503
试管和超透明盖，8 条USA scientificAB1183PCR 试管
尿素Sigma-AldrichU5128
324503

References

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Aptamer SelectionInfectious Virus DetectionSELEX ProtocolDNA AptamersCounter SelectionVirus DifferentiationqPCR MonitoringBinding AssayHigh Throughput SequencingEnvironmental Virus Monitoring

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