本文详细介绍了对一种人源特异性抗CD19单克隆抗体进行放射性标记的方法，以及如何利用该标记抗体在多发性硬化小鼠模型中定量中枢神经系统及外周组织中的B细胞 体内 PET成像， 离体 γ计数和放射自显影方法。
方法文章
使用正电子发射断层扫描在实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型中成像 CD19+ B 细胞
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
多发性硬化症（MS）是影响青壮年人群最常见的中枢神经系统（CNS）脱髓鞘疾病，随着病情进展，常导致神经功能缺损和残疾。B淋巴细胞在MS的病理过程中发挥复杂而关键的作用，并已成为多项处于临床试验阶段治疗手段的靶点。目前尚无准确方法用于为特定抗B细胞疗法筛选适宜患者，也无法无创地量化这些治疗对中枢神经系统及外周器官中B细胞负荷的影响。正电子发射断层扫描（PET）成像技术具有巨大潜力，可提供关于 体内 活体受试者中B细胞的空间-时间分布与负荷
本文报道了针对人CD19的PET示踪剂的合成与应用方法+ 在已建立的由B细胞驱动的多发性硬化症（MS）小鼠模型——实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）中，该模型通过使用人重组髓鞘少突胶质细胞糖蛋白1-125（human recombinant myelin oligodendrocyte glycoprotein 1-125）诱导产生。本文所述为检测和定量CD19的优化技术+ 使用B细胞研究脑和脊髓 体内 PET成像。此外，本文还报道了简化的实验方法 离体 对疾病相关器官（包括骨髓、脊髓和脾脏）进行γ计数，以及对中枢神经系统组织中CD19示踪剂结合进行高分辨率放射自显影。
引言
多发性硬化症是一种免疫介导的神经系统疾病；每位患者的临床表现具有独特性，这给患者和临床医生的管理带来了挑战1该疾病本身的特征是脑和脊髓中出现脱髓鞘病灶及免疫细胞浸润，导致身体功能和认知能力受损2. 多发性硬化是一种T细胞介导疾病的传统范式，首次在一项利妥昔单抗的II期关键性临床试验中受到挑战3，一种靶向CD20的疗法+ B细胞亚群。此后又开发出更多靶向CD19的B细胞疗法4，一种在更广泛范围的B细胞上表达的泛B细胞生物标志物，在诊断和治疗上均具有优势。此外，现有的评估治疗效果的方法（即监测复发次数和磁共振成像[MRI]活动性）无法提供早期疗效反应指标，从而使患者因治疗方案选择和优化不足而面临中枢神经系统损伤的重大风险。因此，迫切需要开发能够监测特定免疫细胞（如CD19）的策略+ B细胞在多发性硬化症患者中枢神经系统和外周的实时动态。
PET成像是一种强大的成像技术，能够 体内 特定目标（如CD19）的全身体内可视化，以及血液采样、复发率记录和病灶监测 通过 MRI可提供治疗效果的快照，而PET成像则使研究人员和临床医生能够监测疗法在整个身体范围内的有效性。这种主动式的治疗监测方法使临床医生能够实时评估药物疗效，并根据需要迅速调整治疗方案。通过监测与疾病相关的细胞群体的位置和密度，还可利用患者特异性的解剖信息进行疾病严重程度的纵向评估。因此，建立可重复的分析方法，以在临床和临床前环境中可靠地发挥PET成像的全部潜力，显得至关重要。
本文描述了方法（图1进行 PET 成像， 离体 γ计数和CD19的放射自显影（ARG）+ B细胞与一种 64铜标记的抗人CD19单克隆抗体（mAb），称为16C4-TM（64Cu-hCD19-mAb) 在表达人源 CD19（hCD19）的转基因小鼠中，利用人重组髓鞘少突胶质细胞糖蛋白 1-125（MOG）诱导的多发性硬化实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）小鼠模型中的应用1-125我们还提供了在脑和脊髓中准确且可重复地评估放射性示踪剂结合的方法，这两个部位是疾病发病机制的关键区域，在此及其他神经退行性疾病模型中常受到严重影响。这些技术可实现对B细胞在疾病病理过程中作用的无创性研究，并具有临床转化潜力，可用于评估多发性硬化症中抗B细胞疗法的疗效。
方案
图 1：研究设计。 本文关键实验技术的概览。 （A）将小鼠仰卧置于扫描床上，以减少脊柱运动。（B） 小鼠的PET/CT成像。（C） 沿动物背部正中线做切口，暴露脊柱。（D） 将脊柱分为颈段/胸段和腰段，并根据所示五个标记切口移除相应节段。（E） 使用注射器，通过在注射器与脊柱之间形成密封，从脊柱的头端和尾端冲洗，以取出脊髓。（F） 分离得到的颈段/胸段和腰段脊髓组织。缩写：PET/CT = 正电子发射断层扫描/计算机断层扫描。 请点击此处查看该图的放大版本。
所有动物实验均按照斯坦福大学实验动物护理管理小组（APLAC）的规定进行，该机构由实验动物护理与使用评估认证协会（AAALAC International）认证。小鼠在开始实验前至少在动物饲养室适应环境7天，以尽量减少小鼠的应激反应，因为应激可能影响实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的诱导。
1. 在雌性人源化 CD19 小鼠中诱导 EAE
- 使用MOG1-125按照先前所述方法5诱导9-13周龄的人源化CD19 C57BL/6J雌性小鼠产生实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）。
EAE 小鼠模型中的动物护理与评分
- 按照先前所述方法评估小鼠疾病进展并进行护理5。简言之，本模型评分标准为1-5分：1分为尾巴无力或瘫软，2分为后肢力量减弱，3分为后肢瘫痪，4分为后肢瘫痪伴前肢无力，5分为濒死状态。
3. 单克隆抗体的偶联、放射性标记及表征
- 将双功能螯合剂1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸单酯偶联N-羟基琥珀酰亚胺酯（DOTA-NHS-酯）与人CD19单克隆抗体（hCD19-mAb）偶联以进行放射性标记 64Cu
- 使用脱盐柱将hCD19-mAb储存缓冲液置换为HEPES缓冲液（pH 8.5–9）：用HEPES缓冲液预处理脱盐柱；根据脱盐柱的样品体积载量和所需mAb体积计算所需柱的数量：0.5 mL离心管：30–130 µL 样品体积 300 µL 洗涤；2 mL 管：200-700 µL 样品体积，1 mL 洗涤液。
- 将离心机冷却至 4 °C 用于缓冲液置换 通过 脱盐柱
- 从冰箱中取出脱盐柱，移除脱盐柱底部，松开盖子，并将脱盐柱放入收集管中。
- 在1,500离心 × g 2分钟，以去除保存液；弃去含有保存液的穿流液，并重复使用收集管。在柱子上标记脱盐树脂压缩层最高点向上倾斜处的水平线。
- 向脱盐柱的下部加入HEPES缓冲液。将脱盐柱放入离心机中，使标记线朝外；在1,500 ×g下离心 × g 孵育2分钟。弃去穿流液，并重复使用收集管。
- 重复步骤 3.1.4 和 3.1.5 两次，使用同一收集管，并在各步骤间弃去穿流液。
- 将已处理的脱盐柱放入新的收集管中并标记；此收集管将含有hCD19-mAb。
- 将 hCD19-mAb 加入预处理的脱盐柱顶部，并用 HEPES 缓冲液冲洗空的 mAb 小瓶；将冲洗液也加入脱盐柱顶部（总体积按制造商推荐量）。在 1,500 × g 条件下离心 × g 孵育2分钟以洗脱hCD19-mAb。收集含有hCD19-mAb的穿流液。
- 使用紫外/可见光分光光度计测定hCD19-mAb的浓度，并调整至 0.5 µg/µL 必要时用 HEPES 缓冲液。
- 向 hCD19-mAb 溶液中加入 1/50th 将0.5 M EDTA的单克隆抗体溶液调节体积，使hCD19-mAb溶液中EDTA的终浓度为0.01 M。将hCD19-mAb-EDTA溶液在室温下静置15分钟。
- 从冷冻箱中取出 DOTA-NHS-酯，置于室温下平衡 10–15 分钟。计算所需加入 DOTA-NHS-酯的 DMSO 体积，使 DOTA 的浓度能够实现目标 DOTA/mAb 摩尔比（通常为 1–2 DOTA/mAb）。
注意：添加至hCD19-mAb的DMSO-DOTA-NHS-酯体积不应超过mAb体积的10%。此步骤应使用电子表格进行计算，以便快速且重复操作。 - 根据 DOTA 与 hCD19-mAb 的预期摩尔比，计算需加入 hCD19-mAb 的 DOTA-NHS-酯的用量。
nmol 单克隆抗体 × 10 DOTA/单克隆抗体 → nmol DOTA → mg DOTA → mg/mL DOTA/DMSO → mL DMSO → DOTA/DMSO 溶液的稀释倍数 - 称取 1–2 mg DOTA-NHS-酯，并小心加入步骤 3.1.11 中计算所得的 DMSO 体积；混匀后离心。
- 将计算体积的DOTA-NHS-酯溶液（步骤3.1.12）用移液器加入hCD19-mAb溶液中；在加入前擦拭移液器吸头外壁，以确保不会额外带入DOTA-NHS-酯（不改变移液器内的液体量）。轻轻混匀后离心。
- 放入冰箱（4 °C）过夜反应（12–16 小时）。
- 纯化与浓缩
- 将离心机冷却至 4 °C 用于离心浓缩仪的缓冲液置换步骤；将金属PCR管架置于干冰上，以快速冷冻结合物。
- 从冰箱中取出 DOTA-hCD19-mAb 反应液，加入生物级 TRIS 缓冲液淬灭反应：缓冲液体积为总反应体积的 10%。取出 10-20 µg 用于质谱分析的样品制备。
- 按照上述方法（步骤3.1.1–3.1.5），使用0.1 M醋酸铵缓冲液（pH 5.5）平衡脱盐柱。
- 将 DOTA-hCD19-mAb 溶液置换至醋酸铵缓冲液（步骤 3.1.1–3.1.8）。
- 浓缩DOTA-hCD19-mAb溶液：按照制造商推荐的体积，将溶液加入50 kDa截留分子量的离心浓缩器中。在4,000 × g条件下离心 × g 10 分钟（或直至体积减少 80%–90%）；弃去穿流液。
- 重复上述步骤九次（共10次）：加入足量乙酸铵，使体积恢复至推荐的最大体积。
注意：总量应为最初加入的体积，包括仍留在柱中的液体，通常为 400-450 µL 用于一个 500 µL 容量离心浓缩器- 用醋酸铵缓冲液冲洗反应小瓶，以回收残留的 DOTA-hCD19-mAb；将洗涤液加入离心浓缩器中。
- 在 4,000 离心 × g 10 分钟
注意：如果在较短时间内将体积减少至80%–90%，则后续离心时间可相应缩短。
- 从离心浓缩器中取出蛋白质溶液。记录 DOTA-hCD19-mAb 的总体积。
- 在离心浓缩仪 2 中，加入足量的醋酸铵缓冲液，使总体积达到 100 µL 用移液器混匀。盖紧离心浓缩柱管盖，倒置。在4,000 × g条件下离心 × g 孵育2分钟以收集溶液，转移至新管中。
- 在离心浓缩器500中，使用移液器收集单克隆抗体溶液，并转移至新管中。
- 使用紫外-可见分光光度计测定浓度。若浓度超过 2 mg/mL，用乙酸铵稀释至 2 mg/mL。
- 等分试样 100 µg 每PCR管（约 50 µL）；用DOTA-hCD19-mAb、日期、质量及浓度标记离心管。离心收集管内物质。
- 将DOTA-hCD19-mAb在预冷的PCR仪模块上置于干冰中速冻（或直接在干冰中冷冻）。所有样品完全冻结后，将其转移至-80 °C冰箱中保存。80 °C 冰箱
- 通过质谱法测定每分子hCD19单克隆抗体所连接的DOTA数量。保留每次偶联反应中未偶联的（纯）抗体样品，用于计算比率。使用公式（1）如下所示；分子量缩写为 MW。
(1)
- 放射性标记
注意：操作放射性物质时，应穿戴适当的个人防护装备（PPE），包括实验服、手套、个人全身剂量计和指环剂量计，并遵守所在机构的相关规定。应定期进行表面污染检测并及时更换手套，以防止放射性污染。尽可能使用镊子操作，以增加与放射源的距离，并使用铅屏蔽进行防护。- 使用移液器将放射性物质从运输瓶转移至新瓶。测量放射性活度。
- 移取一份等分试样用于第一次放射性标记反应。加入 50 µL 每1 mCi的醋酸铵（pH 5.5） 64Cu-CuCl3用移液管测量pH值 1 µL 使用 pH 范围涵盖 5.5 且能清晰区分 5 至 6 之间的 pH 试纸。
- 如果pH不在4-5.5范围内，使用1 M NaOH或0.1 M HCl调节。每次加入少量，1-5 µL，若pH低于4，则加入1 M NaOH；若pH高于5.5，则加入0.1 M HCl，直至达到目标pH值。每次添加后需充分混匀，离心沉淀，并按上述方法测定pH值。记录所有溶液的添加与移除操作（包括用于检测pH的取样），以便计算最终体积。
- 当达到最佳pH值后，加入 10 µg 每1 mCi的DOTA-hCD19-mAb 64Cu-CuCl3轻轻混匀，短暂离心。
- 将反应小管置于设定温度的恒温混匀仪上 37 °C 400 转/分钟（rpm）。
- 反应30分钟后终止反应：将总体积除以50，加入相应体积的0.5 M EDTA至反应混合物中。
- 使用瞬时薄层色谱法（ITLC）测定标记效率，以测量溶液中结合态与游离态铜的百分比。
- 裁剪1 cm宽的薄层色谱纸条，在纸条顶端和底端1 cm处做标记，并准备一个装有流动相的50 mL锥形瓶，流动相为0.1 M柠檬酸，液面高度低于1 cm（当纸条放入瓶中时，流动相液面应低于纸条底部1 cm标记处）。
- 移液器 1 µL 在试纸底部1 cm标记处（溶剂前沿）点加反应溶液，然后将试纸放入试管中。观察至溶剂前沿到达顶部1 cm标记处，取出试纸，并用保鲜膜包裹。
- 将条带置于平台上，用放射性薄层色谱成像扫描仪进行扫描。观察原点处的放射性标记单克隆抗体以及游离的放射性物质 64随流动相前沿移动的 Cu图2）。如果游离铜的比例小于5%（标记效率为95%），则进行动物注射；如果游离铜的比例大于5%，则进行纯化。
注意：游离铜的百分比通常取决于 DOTA-mAb 与 64铜、反应时间、pH 和温度。每位用户应针对每种新的单克隆抗体优化反应条件，以确保结果的一致性。
- 纯化 通过 一次性DNA纯度重力柱
- 根据制造商说明，对一次性DNA级重力流层析柱（脱盐/缓冲液置换柱）进行预处理。将一次性DNA级重力流层析柱置于装有足够铅屏蔽的铁架台或其他支架上，确保装置稳定且便于移动。在层析柱下方放置收集管。
- 将粗反应混合物用移液器加到重力流柱树脂上。等待所有液体流入树脂。加入足量 PBS，使总体积（粗产物加 PBS）达到 500 µL弃去穿流液。
- 将柱子置于标记为1-10的1.5 mL离心管上方。向柱中加入1 mL PBS，每管收集五滴，直至流尽。
注：可能需要少于 10 根试管。 - 盖上层析柱底部并测量残留放射性。用流穿液分别测量每个小瓶。对于每个放射性高于设定阈值的小瓶 50 µCi，按照步骤 3.3.7 制备 ITLC，以测定各组分中结合铜的百分比。
注意：前一至两管馏分仅含流动相；放射性标记的单克隆抗体将首先洗脱（通常为第2或3管至第5或6管），游离的 64铜将最后洗脱（部分会吸附在柱上）。结合百分比 64Cu 在不同组分间可能有所差异。 - 合并结合率大于95%（游离铜小于5%）的组分；将该溶液用于注射。如需确认放射性标记效果，可进行尺寸排阻高效液相色谱分析5 并计算摩尔活度。保存一份等分试样，待其衰变10个半衰期（127小时或5.3天）后，用紫外-可见分光光度计测量其浓度。
4. 剂量配制
注意：在处理剂量前，应穿戴适当的个人防护装备（PPE），包括实验服、身体和手指剂量计以及手套。
- 注射 64注射Cu-DOTA-hCD19-mAb后18–24小时再进行PET扫描，以确保放射性示踪剂在体内充分循环。
- 立即放置装有铅容器的 64Cu-DOTA-hCD19-mAb 置于铅屏蔽后。打开盖革计数器以监测潜在污染。
注意：操作放射性物质时应频繁更换手套。抽取剂量时建议佩戴双层手套，以便快速更换。被污染的锐器和废弃物必须始终置于指定的屏蔽废弃物区域。 - 稀释 64在低吸附的1.5 mL塑料离心管中，将Cu-DOTA-hCD19-mAb配制成适当浓度。
注意： 64若非低吸附型塑料，Cu-DOTA-hCD19-mAb 将会结合于塑料表面。 64铜会与玻璃结合。- 用生理盐水稀释放射性示踪剂，以防止辐射分解并便于准确抽取一致的剂量。
- 准备给药剂量，使其介于 75 至 150 µCi 在 100 µL，如果可能的话。确保最大总注射体积不超过小鼠体重的10%。
- 使用一个 500 µL 使用（50 cc）胰岛素注射器从低吸附塑料管中抽取药液。确保注射器内无气泡，因药液将经静脉注射。
- 用相应的动物编号预先标记注射器。
- 在实验记录本中记录剂量活性及时间，用于数据分析。
- 动物插管后应立即准备好注射剂量，以减少麻醉时间。
- 在完成剂量配制后，准备一个标准（模体）进行扫描，以生成校准因子。
- 用15 mL离心管装入50-75 µCi 活性稀释于水（或 PBS）中。
注意：确保溶液充分混匀。该标准品可为无载体 64标记后剩余的 Cu- 测量标准品中的活性量并记录时间。
- 用15 mL离心管装入50-75 µCi 活性稀释于水（或 PBS）中。
5. 插管与注射
注意：有关小鼠静脉插管以注射放射性示踪剂的方法，请参见先前描述的方法66。
- 在将小鼠置于充满1.5-3%异氟烷的麻醉诱导箱中进行麻醉前，按照第2.1节所述方法称重并评估其疾病严重程度，以准备给予放射性示踪剂。
注意：这些小鼠将在实验台面上注射，而非如前所述在PET扫描仪上进行。由于在插管和注射之间小鼠不会移动，因此无需将导管固定在原位。 - 小鼠插管完成后，将针头插入导管末端并缓慢注射。注射后，通过导管推注少量生理盐水，以确保全部剂量均已注入。
注意：推注的生理盐水体积应大致等于导管的死体积，本研究作者所用导管的死体积为50 µL。- 在一张实验室擦拭纸上进行注射，以收集任何可能滴落的放射性示踪剂；测量残余剂量时应将此部分计入。
- 在实验记录本中记录注射时间。
- 注射完成后立即拔除导管。使用剂量校准仪测量导管、注射器及擦拭用组织，以确定未注入小鼠体内的残余剂量。
- 在实验记录本中记录放射性活度及测量时间。
- 小鼠完成注射后，使用笼卡标记其笼具，标明小鼠具有放射性，并根据机构规定进行笼具记录与登记。随后，将小鼠安置于指定的放射性动物暂存区域。
6. PET/CT 成像
- 在注射 64Cu-DOTA-hCD19-mAb 后 18–24 小时内进行 PET 成像。扫描前对小鼠称重并评分。
注意：PET/CT 扫描仪的 X 射线组件需预热并准备就绪，方可进行数据采集。- 确保 PET/CT 扫描仪的 X 射线组件已预热并准备就绪。
- 在计算机上打开 PET 扫描仪采集软件。
- 在研究者登录下拉菜单中，点击相应的实验室信息。
- 在项目页面，从下拉菜单中创建一个新项目或选择一个已有项目。
- 当屏幕上自动弹出初始化提示时，点击归位床板，等待床板归位后，点击CT 预热。
- 确保 CT 防护门已关闭，以允许 CT 完成预热。
- 扫描仪预热期间，对实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）小鼠进行评分，并在侧腹部皮下注射 0.2–0.4 mL 温热生理盐水以补充水分。
- 扫描仪预热完成后，返回计算机设置本研究的 PET 扫描。
注意：这些设置可提前在扫描日之前完成。- 在近期研究标题下，点击创建新研究。填写研究名称、方案、化合物和受试者信息。
- 若进行 PET/CT 扫描，先选择PET 方案，再选择CT 方案。
注意：通常，标准 CT 即可满足 EAE 小鼠模型的扫描需求。CT 扫描持续 1 分钟，采集参数为 2 × 2 像素合并，电压 80 kVp，电流 150 µA，共 720 个投影。CT 图像采用改进的 Feldkamp 算法进行重建。 - 对于 PET 方案，选择 10–15 分钟的静态 64-铜扫描。若该扫描方案未列于可用方案中，可通过点击标准菜单中的方案标签，再点击创建新方案 | 同位素下拉菜单进行添加。若所需同位素未列出，点击更多 | 从库中添加，并添加所需同位素。定义扫描时长，选择静态扫描单选按钮，命名该方案并点击保存。
- 返回研究标签页，继续命名并设置当天所需的所有扫描。
注意：建议额外设置一个仅使用标准 CT 的“CT 测试”扫描，用于检查首次扫描时床板的位置，以确保最佳放置。该扫描应作为研究中的首个扫描执行。
- 若进行 PET/CT 扫描，先选择PET 方案，再选择CT 方案。
- 在近期研究标题下，点击创建新研究。填写研究名称、方案、化合物和受试者信息。
- 扫描仪准备就绪后，将小鼠置于麻醉诱导箱中进行麻醉，以准备扫描。
注意：此时小鼠可能病情严重，应尽量减少其处于麻醉状态的时间。- 涂抹眼用凝胶。
- 确保四只小鼠用的扫描床配备加热元件（如加热垫或热空气），异氟烷浓度设为 1.5%–2%，并开启加热垫（图 3）。将小鼠以仰卧位放置于扫描床上。
- 随着 EAE 疾病进展，小鼠脊柱严重弯曲。将小鼠以仰卧位扫描，可最大程度拉直脊柱，有利于后续分析。可轻拉小鼠尾巴以辅助脊柱拉直。
- 小鼠置于仰卧位后，使用软质显微镜胶带将其牢固固定。在头部上方贴一条胶带，在腹部轻贴另一条胶带，以减少呼吸引起的运动。
- 在实验记录本中记录每只小鼠在扫描床上的位置。
- 小鼠固定完成后，返回扫描计算机操作扫描仪。
- 打开运动控制器菜单。点击PET 中心视野（FOV），将扫描床上的小鼠移入 PET 环内。当天首次扫描时，点击CT 中心视野（FOV）。到位后运行 CT 测试扫描以确认位置正确；重复调整直至床板位置满意。
- 在扫描床上贴一小块白色胶带，标记本研究剩余扫描的正确床板位置。
- PET 扫描床位置确定后，点击运行启动扫描序列。
- 等待扫描仪自动从 PET 环移动至 CT 位置。
- 始终通过目视检查确认动物是否已正确进入 PET 和 CT 的扫描位置。
- 在实验记录本中记录扫描开始时间，用于数据分析时对注射剂量进行衰减校正。
- 扫描完成后，允许图像进行重建。在移走动物前检查数据。
注意：静态扫描的三维有序子集最大期望值（OSEM）重建过程约需 5 分钟。 - 目视检查并确认数据，以脾脏作为阳性对照，因该组织含有大量 B 细胞。 将动物从扫描床上移下，并放入含异氟烷的麻醉诱导箱中，准备灌注及后续解剖。
- 对研究中剩余的小鼠重复步骤 6.5–6.12。
- 当所有小鼠完成扫描，或扫描一组在扫描床上留有空位的小鼠时，扫描步骤 4.6 中制备的标准品。
7. 解剖以用于 离体 γ计数与放射自显影
- 解剖前，确保所有用于γ计数和离心的试管均已预先称重。
- 通过灌注实施安乐死，方法如前所述6，用 PBS 灌注并进行胸廓切开术，同时使小鼠处于深度麻醉状态（持续吸入 4% 异氟烷，2 L/min 100% 氧气）2).
- 为去除骨髓，从膝关节和骨盆处切断两侧股骨，确保将股骨两端的骨骺完全去除。
- 将两根股骨放入一个底部带孔（使用20 G针头打孔）且已切去管盖的0.5 mL离心管中。
- 将装有股骨的0.5 mL离心管放入一个已切去管盖的1.5 mL离心管中。
- 将整个试管装置放入小型离心机中，在4,500 ×g条件下离心4分钟 × g.
注意：骨髓应通过0.5 mL离心管上的孔洞被推出，并沉降在1.5 mL离心管底部。- 分离试管。将空股骨置于0.5 mL离心管中称重。将骨髓置于1.5 mL离心管中称重。将每个离心管放入γ计数管中。
- 使用镊子和剪刀取出脑组织，注意保持脑干完整。将脑组织放入γ计数管中，记录干重，用PBS冲洗后置于冰上，待测时进行计数。
- 为取出脊髓，执行以下步骤。
- 通过在动物背部侧面做切口，去除皮肤和毛发，以暴露脊柱图1).
- 通过在脊柱周围和内部沿三个横切面进行切割，将腰椎（L）与颈椎（C）和胸椎区域分离开：第一个切口位于颈部基底（寰椎 C1）处（图1D，第1期）；肋骨下缘（L1 椎体）（图1D，第2期骨盆底部（L5 椎骨）图1D第3期).
- 在肋骨下方切开图1D，第2期).
- 在骶骨上方直接剪切，以分离腰段脊髓区域。从骨盆端小心修剪脊柱，直至腰段脊髓可见（图1D第3期）。修剪掉周围组织，以分离脊柱的腰段和颈/胸段图1D，第4和第5号).
- 使用带有滑动尖端的注射器（3–10 mL）吸取 PBS，用于排出脊髓。用拇指和食指在注射器与脊柱之间形成密封。
- 轻轻推动 PBS 通过注射器，将脊髓排出至吸水垫上（图1E）；对两个脊髓区域重复此操作。将脊髓组织放入γ计数管中。
- 记录干重，并加入PBS以确保组织位于管底，避免干燥。将管子置于冰上，待计数时取出。
- 从脊柱的颅端推出颈段/胸段脊髓，从尾端推出腰段脊髓（图1E).
8. 离体 γ计数
- 打开伽马计数器软件。进入工作列表并选择所需的检测程序，例如用于 64Cu 的 30 秒计数程序。
- 在不同的试管中至少制备三个标准品。立即运行这些标准品以用于后续分析（步骤 10.2）。建议在三个独立的试管中制备三份重复的体积和放射性活度。
注：体积为 500 µL 时结果较佳。虽然放射性活度取决于所使用的仪器，但通常 10 µCi 的活度效果良好。 - 将标准品放入试管架中，并用与待运行程序相对应的条形码标记试管架。将该试管架放置在伽马计数器上。
- 记录完器官重量后，将装有器官的试管依次放置在装有标准品的试管之后，置于伽马计数架上。
注：本模型中可能关注的器官包括轴向淋巴结、血液、骨髓、脑、颈淋巴结、股骨、心脏、肝脏、腰段脊髓、肌肉、脾脏、尾部以及颈胸段脊髓。 - 在伽马计数器后部放入一个带有终止条形码的试管架。
- 点击计算机上的 播放 按钮。若条件允许，应等到有多个试管架或多个器官需要检测时再点击 播放 ，以便所有试管能在同一个文件中连续完成计数。确保每次运行时，伽马计数器后部均放置了一个带有终止条形码的试管架。
- 持续运行直至所有样品完成计数。保存并导出数据文件。
9. 离体 中枢神经系统组织的放射自显影（ARG）
- 按照已发表的文献步骤进行脑和脊髓的ARG操作（但需排除Chaney等描述的步骤2-6，因为小鼠已通过PET扫描注射了放射性示踪剂）6。
注意：脊髓ARG胶片盒制备的具体说明见此处6。 - 完成腰段及颈胸段脊髓的γ计数后，立即将试管置于冰上，直至所有中枢神经系统组织完成计数。
注意：请参考已发表的脑组织ARG方法6。 - 轻轻倾斜试管，使脊髓自然滑落到吸水纸上。若脊髓粘附在试管壁上，可用冷PBS轻轻冲洗，并再次倾斜试管。用实验室纸巾轻压，小心吸干每一段脊髓。将干燥后的脊髓有序地放置在一张厚的黑色纸张上。
- 使用白色记号笔在脊髓旁进行标记，以便于识别。
- 在黑色纸张的角落和中央留出空间，放置由三片显微镜载玻片叠成的支架，作为间隔物，防止ARG胶片盒闭合时压碎脊髓。共使用5-7组支架。
- 当所有腰段及颈胸段脊髓均已放置在黑色纸张上并完成标记后，小心将纸张放入ARG胶片盒中。将打开的胶片盒置于干冰托盘上，使脊髓迅速冷冻。
- 待脊髓完全冻结后，在数字磷光存储屏与样品之间轻轻覆盖一层塑料薄膜，然后将磷光屏盖在样品上方。立即关闭胶片盒，并放入-20 °C冰箱中曝光约10个半衰期（约127小时）。
- 曝光完成后，使用磷光成像仪扫描屏幕。分析所得的数字图像（操作说明见第12节）。
10. 生物分布数据分析
- 建立一个“剂量校正”电子表格，通过数学方法确定放射性衰变的时间校正，从而标准化辐射剂量，并实现受试者之间的比较。
- 将所有剂量衰变校正至注射时刻，同时考虑注射后残留在注射器和导管中的残留放射性活度。
- 利用步骤8.2中制备的标准样品，计算其平均放射性活度（µCi）和标准化的每分钟计数（CPM）。将平均CPM除以平均标准活度，得到CPM/µCi。
注意：确保每个标准样品的活度值均已衰变校正至伽马计数器测量其CPM的时间点。伽马计数器应将所有CPM值归一化至实验方案的起始时间。
- 建立“结果”电子表格，用于计算每个样品的每克组织注射剂量百分比（%ID/g）。
- 将伽马计数器测得的每个样品的标准化CPM值，衰变校正至该动物的注射时间。
注意：衰变校正可针对任意时间点进行；需确保所有剂量和CPM值均校正至同一时间点。 - 将衰变校正后的CPM值按每个样品的质量进行归一化，以确定每份样品的CPM。通过从计算得到的注入总CPM中减去尾部残留的CPM，得到实际注入的总CPM。
注意：尾部样品无需进行质量归一化，因其CPM值仅用于从总注入CPM中扣除注射过程中可能外渗的示踪剂贡献。 - 将单位质量的CPM除以实际注入的总CPM，计算%ID/g。
- 将伽马计数器测得的每个样品的标准化CPM值，衰变校正至该动物的注射时间。
- 建立“汇总”电子表格，用于展示最终结果，以便输入图形软件进行数据可视化和后续统计分析。
11. PET 图像分析
- 打开 PET 分析软件。点击 文件 | 打开本地数据 | DICOM. 找到目标文件（DICOM 格式）。同时打开 PET 和 CT 文件。
- 在 数据管理员，调节 正电子发射断层扫描 和 CT对比剂 至所需水平。
- 注册并裁剪单个鼠只。
- 在 导航 菜单，选择 重新定位/配准 表。
- 前往 刚性 此标签页内的菜单。指定 CT扫描（0） 作为 固定 扫描与 PET 扫描 (1) 作为 移动 扫描
- 选择 刚性 转化与 快速 质量。点击 注册.
- 注册完成后（5-10 分钟），点击 检查 标记以保存注册信息。
- 目视检查数据以确保配准成功。通过点击导出会话 文件 | 会话 | 导出.
- 接下来，对每只小鼠进行全身裁剪：前往 导航 菜单并点击 裁剪. 从每个横截面的外边缘向内拖动其侧边。
- 当所需的小鼠被紧密裁剪后，点击 检查 标记并导出会话以保存。
- 接下来，使用手动方法对每只小鼠的头部进行裁剪和校正，以用于脑组织分析 翻译, 旋转，以及 翻转 在 注册/重定向 菜单。导出以保存。
- 分析脊髓。
- 要开始分析脊髓中的感兴趣区域（ROIs），请打开 3D ROI 工具 从 导航 菜单。
- 在……之下 感兴趣区域 页眉，使用 加 在菜单底部签名以创建六个感兴趣区域（ROI）： 腰椎感兴趣区域，颈椎/胸椎感兴趣区域，腰椎骨骼，胸椎骨骼，腰髓，胸髓.
注意：腰椎和颈椎/胸椎感兴趣区域（ROI）是广义的大范围感兴趣区域，将用于生成骨骼感兴趣区域（ROI）图4). - 为避免PET信号在此步骤中产生视觉干扰，请点击 F3 关闭 PET。
- 前往顶部 3D ROI 工具操作员. 点击 实心圆点 光标符号右侧以打开 3D 绘画模式与侵蚀/膨胀 菜单
- 选择 球体 并更换 大小 至 20 像素设置 稀释 到 +5.
- 在继续之前，请前往 菜单底部确保 腰椎感兴趣区域 被选中，因为这是首个绘制的感兴趣区域。
- 在CT上找到脊柱的L6椎骨（脊柱与髋部相接处）。从L6上方一个椎骨开始，绘制一个大致的ROI 腰椎感兴趣区域 髋部上方的五个椎体（L1-L5 椎体）水平。然后，切换至 颈椎/胸椎感兴趣区域 并追踪脊柱其余部分至颅底。
注意：此处无需精确，仅用于指示步骤 11.4.8 中 Otsu 阈值分割的实施位置。 - 绘制完广义的感兴趣区域（ROIs）后，转到 操作员上方位置. 选择 分割算法 菜单
- 从下拉菜单中选择 大津阈值法对于输入，选择 腰椎感兴趣区域在菜单底部，确保 腰椎骨骼 被选中。在旁边的下拉菜单中 图像，确保 CT 扫描 被选中，然后单击 应用. 重复上述步骤 颈椎/胸椎感兴趣区域 和 胸廓骨骼.
- 如果大津阈值法未能充分突出脊柱，则使用 全局阈值分割 并改变 分钟 值 350 以及 Max 到 3,500 进行手动阈值分割，并根据需要进行调整以分离椎骨。
- 在使用 Otsu 阈值法创建骨架 ROI 后，返回到 导航 菜单（光标图标）。或者 删除 或 ✔️ 的 H （隐藏）用于粗略估算的列 腰椎 和 颈椎/胸椎感兴趣区域 以隐藏它们。 对勾标记 的 I （不可更改）列，用于两个骨架 ROI，以防止其被编辑。
- 最后，返回至顶部 3D ROI 工具操作员 并前往 3D 绘图菜单 绘制 脊髓感兴趣区域.
- 选择 球体 再次使用工具，在骨骼内描记脊髓 腰椎 和 胸部确保在菜单底部选择正确的 ROI。
- 为了 清除 任意感兴趣区域，点击 指挥/控制 并覆盖需要擦除的部分。
- 从三个平面检查脊髓 ROI，确保没有在脊柱外绘制 ROI。
- 导出脊髓分析结果。
- 如果在步骤 11.4.3 中关闭了 PET 信号，则按下 F3 在绘制完脊髓 ROI 后，重新开启 PET 或进行选择 视觉控制器（VC） 并点击 PET 条形图.
- 返回到 导航 菜单（光标图标）。单击 网格 图标到 显示表格将表格复制到电子表格软件中并保存。
- 最后，按照上述方法在PET分析软件中将绘制的ROI保存并导出文件。
- 使用半自动化的三维图谱分析大脑。
- 打开头部裁剪文件。通过以下步骤导入小鼠脑图谱： 高级模块 菜单并选择 3D大脑图谱工具. 确保 参考文献 设定为 CT 以及 裁剪 选项是 未检查. 设定一条通路 用于输出目录。
- 在 高级设置，更换 转化 到 Versor-Affine。保留所有其他默认设置。点击 运行.
- 手动调整图谱中的 重新定位/配准 菜单中使用颅骨CT作为拟合寰椎的参考指南。
- 必要时进行缩放操作需格外谨慎，因为这会显著影响脑结构体积。点击 ✔️ 调整完成后。
- 重新运行图谱，使用 导入3D ROI 选定。
- 导出文件以保存适配裁剪后头部的图谱。
- 在从目标器官绘制并导出所有感兴趣区域（ROIs）后，计算标准结合校正值。对所有数据进行衰变校正，并按前述方法转换为 %ID/g。6. 根据适合动物模型的器官进行归一化，例如用心脏归一化血液池中放射性示踪剂的含量。
12. 离体 放射自显影分析
- 使用图像分析软件打开数字图像文件（.gel）。调整亮度和对比度至所需阈值。如有需要，应用合适的颜色查找表。
注意：为便于观察，推荐使用 Royal 或 Grays 颜色模式。
结果
hCD19-mAb 经 DOTA 偶联并用放射性同位素标记 64Cu 如图所示 图2. EAE 小鼠与正常小鼠接受 PET/CT 扫描（图3注射后 18-24 小时 64Cu-DOTA-hCD19-mAb。采用PET分析软件对PET/CT图像进行配准，并通过手动勾画感兴趣区域（ROI）或半自动三维脑图谱分析中枢神经系统组织。感兴趣区域中放射性示踪剂的结合（ROI内放射性摄取）图4) 在EAE小鼠中高于在正常小鼠中。 离体 γ计数和自显影技术显示，与正常小鼠相比，EAE小鼠的脊髓（包括腰段和颈胸段）和脑部（仅自显影技术）结合信号增强图5 和 图6). 离体 灌注小鼠的γ计数也显示外周器官（包括脾脏、股骨和骨髓）中放射性示踪剂结合减少（图5)，与该EAE模型中B细胞离开外周并浸润中枢神经系统的表现一致。
图2：生成偶联及放射性标记的方案 64铜标记的人源特异性CD19单克隆抗体，16C4-TM mAb（64Cu-DOTA-hCD19-mAb），以及质量控制数据。 (ADOTA-NHS-酯与hCD19单克隆抗体反应生成hCD19-DOTA偶联物（比例非按实际）及放射性标记 64Cu-CuCl3 以生成 64Cu-DOTA-hCD19-单克隆抗体 (B) 代表性ITLC色谱图。40-60 cm处的峰为放射性标记抗体；未结合的 64Cu-CuCl3 随流动相移动，并在200至240 cm范围内存在。未检测到游离的 64Cu-CuCl3 在此色谱图中。C) 放射性标记抗体的质量控制规格。缩写：DOTA-NHS 酯 = 1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸单酯N-羟基琥珀酰亚胺酯；ITLC/HPLC = 瞬时薄层色谱/高效液相色谱；MALDI/LC-MS = 基质辅助激光解吸/电离-液相色谱-质谱；CPM = 每分钟计数 请点击此处以查看此图的放大版本。
图3：照片展示如何将小鼠固定在PET扫描仪内的3D打印床中，以实现高质量的脊髓和脑部成像，同时最大限度减少运动。（A）3D打印的四只小鼠用扫描床（也称为“小鼠旅馆”），配备加热元件和麻醉导管。（B）处于仰卧位的麻醉小鼠，以最大化脊柱的平直度；每只小鼠在床内的位置均被记录。（C）用胶带将小鼠头部牢固固定，以减少脑部运动，同时在腹部固定以减少呼吸引起的运动，但不影响正常呼吸。（D）将小鼠床置于扫描仪内，并用胶带固定于扫描床上。从扫描仪连接麻醉导管至小鼠床，并将异氟烷浓度设定为2%。在关闭扫描仪门之前，监测小鼠呼吸，以确保异氟烷浓度适当。缩写：PET = 正电子发射断层扫描。请点击此处查看该图的放大版本。
图4：使用PET分析软件进行脊髓成像、脑部分析及结果处理。 (A) i) 在脊柱上绘制感兴趣区域（粉红色和棕褐色），以区分腰椎与胸椎和颈椎，并为Otsu阈值分割准备图像。 ii) 使用Otsu阈值法对脊椎骨（青绿色和红色）进行了分割。 iii) 然后在 3D ROI 菜单中将椎骨设为不可变，并将脊髓划分为颈段/胸段（紫色）和腰段（深蓝色）ROI。 iv) 去除椎体ROI，保留脊髓ROI并应用代表性脑图谱。B) 以每只动物心脏 ROI 标准化的 %ID/g 表示的 CNS 不同区域 PET 结果的代表性分析。PET 采集采用 10 分钟静态扫描 通过 PET/CT成像。使用半自动脑图谱方法定量的脑区，如图中所示 A. iv) 代表性结果表明，示踪剂在脑部和胸段脊髓中的结合显著增加或呈显著上升趋势。统计学分析采用 Student's t-检验（*：p < 0.0332）。缩写：PET = 正电子发射断层扫描；ROIs = 感兴趣区域；CNS = 中枢神经系统；CT = 计算机断层扫描；%ID/g = 每克组织摄取的注射剂量百分比；EAE = 实验性自身免疫性脑脊髓炎。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图5：代表性定量分析结果 离体 实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）小鼠和正常小鼠各器官中的γ计数，以%ID/g表示。 PET 扫描后，用 PBS 灌注小鼠以清除血液中游离或与血液中 CD19 结合的放射性示踪剂+ B细胞，迅速解剖并称重各器官以获得准确重量。与对照小鼠相比，EAE小鼠脾脏和骨髓中的示踪剂结合显著减少。EAE小鼠腰段及颈胸段脊髓均观察到放射性示踪剂结合增加。脑组织未显示放射性示踪信号显著升高，但呈接近显著性增加的趋势。统计学分析采用Student's t-检验（*：p < 0.0332；****：p < 0.0001）。缩写：PET = 正电子发射断层扫描；%ID/g = 每克组织摄取的注射剂量百分比；EAE = 实验性自身免疫性脑脊髓炎；PBS = 磷酸盐缓冲液。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图6：离体 自显影图像显示，在实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）小鼠与正常对照小鼠相比，64Cu-DOTA-hCD19-mAb 在脑部矢状切片和完整脊髓中的结合情况。 数字化磷屏存储膜在暴露于放射性组织样本约10个半衰期（127小时或5天）后，使用磷屏成像仪进行扫描。结果图像显示，EAE小鼠脑部的信号明显高于正常小鼠脑切片，这与该模型中已知含有B细胞的区域相符5。具体而言，EAE小鼠脑切片的脑干、小脑和脑室区域显示出更高的示踪剂信号。EAE小鼠脑切片中信号的增强与上述全脑PET定量结果一致。同样地，与正常脊髓相比，EAE小鼠的颈段/胸段以及腰段脊髓均显示出放射性示踪剂结合增加，这与离体 γ计数结果相吻合。缩写：PET = 正电子发射断层扫描；EAE = 实验性自身免疫性脑脊髓炎；Vent = 脑室；Cb = 小脑；BS = 脑干；TSc = 胸段与颈段脊髓合并；LSc = 腰段脊髓。 请点击此处查看该图的放大版本。
补充图 S1：使用 CD45R/B220 对正常小鼠和 EAE 小鼠脑组织的中枢神经系统组织进行染色。 在 EAE 小鼠中可观察到脑干、脑膜和白质中的 B 细胞（n = 7 只 EAE 小鼠，n = 5 只正常小鼠，每只动物平均四张切片）。该图来自5。比例尺 = 5 mm（矢状面脑图像，低倍镜 [1x]），100 µm（脑干、脑膜和小脑白质，高倍镜 [20x]）。请点击此处下载该文件。
讨论
本文介绍了一种利用CD19-PET在多发性硬化（MS）小鼠模型中成像人源CD19+ B细胞的简化方法。由于MS的临床表现具有异质性，且患者对治疗的反应各不相同，因此在临床管理中常面临挑战，迫切需要新的治疗选择和监测手段。正电子发射断层扫描（PET）成像可作为监测疾病进展及个体对B细胞清除疗法反应的有力工具。除MS外，CD19-PET成像还可用于监测淋巴瘤和白血病亚型或其他B细胞介导疾病治疗后的B细胞清除情况。本实验方案及代表性数据展示了在神经系统疾病中进行B细胞成像的应用价值。
为了在多发性硬化症（MS）的背景下研究人类CD19+ B细胞，我们选用了B细胞依赖性的MOG1-125 EAE模型7。与其他EAE模型类似，该模型表现出进行性瘫痪症状以及免疫细胞向中枢神经系统（CNS）的浸润。然而，MOG1-125模型的独特之处在于它是一种由B细胞驱动的模型：小鼠在软脑膜的蛛网膜下腔、脑干、实质和脑室中存在数量不等的B细胞。这些淋巴细胞可零星分布于上述区域，或形成滤泡样结构，而这类结构在多发性硬化症患者中亦有观察到8,9。除了使用未处理小鼠作为对照外，还可使用仅含完全弗氏佐剂（CFA）的诱导试剂盒（即与给予EAE小鼠的诱导乳剂成分相同，但不含MOG蛋白）。在EAE小鼠模型中，血脑屏障（BBB）功能障碍，允许抗体等较大分子穿过。CD19-mAb放射性示踪剂仅在B细胞存在时才会结合并滞留在中枢神经系统内；若无B细胞存在，示踪剂将重新循环回血液中。我们已通过γ计数及在测量组织放射性水平前进行灌流的离体（ex vivo）自显影技术，在中枢神经系统组织中验证了这一现象。此外，我们在早期发表的研究中也证实了基于单克隆抗体的PET放射性示踪剂（即免疫PET成像方法）可用于检测中枢神经系统中的B细胞1,2。
由于DOTA螯合剂已用于临床PET成像中铜-64标记的多肽和抗体，我们旨在将hCD19-mAb转化为用于多发性硬化症（MS）患者临床成像的应用。DOTA对铜-64具有足够的结合亲和力 体内。该 体内 稳定性非常重要，因为游离的 64铜会进入肝脏，可能掩盖结合放射性示踪剂的信号；因此，测量肝脏中的信号以计算与其他器官相比的相对信号强度非常重要。肌肉通常被用作对照组织，但在实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）情况下，肌肉中可能存在炎症。该放射性核素的半衰期为 64Cu 的半衰期为 12.7 小时，这为 DOTA-hCD19-mAb 与其靶标结合提供了充足的时间，同时确保 PET 可检测到信号。在制备偶联物时，应先进行小规模（75–125 µg）的预实验，以确定添加至单克隆抗体（mAb）的 DOTA 用量，从而获得目标 DOTA/mAb 摩尔比（例如，每摩尔 mAb 使用 6–10 倍摩尔过量的 DOTA-NHS-酯，可能得到 1–2 个 DOTA/mAb 的偶联物）。反应时间与温度（例如，2–4 小时或 4 °C 或室温下过夜）也会影响 DOTA/mAb 比值，需进行优化。可通过非放射性铜滴定法计算每个 mAb 所偶联的 DOTA 数量；然而，我们建议采用 MALDI-MS 和/或 LC-MS 以获得更可靠和准确的结果。
计算得到的DOTA/mAb比值是特定样品的平均值，预期会存在一定变异。对于MALDI分析，每个样品需对偶联和未偶联的单克隆抗体（mAb）分别采集多个质谱信号点。随后我们计算偶联与未偶联mAb的比值，以确定每个mAb上DOTA的平均数量。DOTA/mAb比值至关重要，因为螯合剂过多会干扰抗体的结合能力，而过少则会导致放射性标记不一致和信号强度低。为了保持信号强度和结合动力学的一致性，不同批次偶联物之间的该比值应尽可能接近；理想情况下，同一项研究中的所有实验应使用同一批次的偶联物。一种有望减少因过度偶联而影响免疫反应性的技术是位点特异性偶联10，该方法使螯合剂选择性地结合于抗体重链糖链的特定位置，从而确保每个mAb上仅添加一个螯合剂分子。
应优化放射性标记反应条件，以确保最高的标记效率和产率，因为抗体、DOTA/单克隆抗体比例以及64Cu比活度等因素的差异均会影响放射性标记效果。采用最佳的64Cu与单克隆抗体结合物比例，可能使放射性示踪剂在无需纯化的条件下使用，从而缩短放射性标记所需时间，并减少因重力流柱操作和放射性衰变造成的损失。当使用相同的64Cu与单克隆抗体结合物比例时，还可获得一致且可靠的摩尔比活度，这在比较多组小鼠或多个成像研究的结果时尤为重要。ITLC条件也可根据用户需求进行调整。如果必须进行纯化，应保留一份等分试样用于HPLC和/或紫外/可见光光谱分析，以便计算摩尔比活度。
需要注意的是，使用放射性标记抗体进行成像可能具有挑战性。用于放射性示踪剂的抗体必须具有生物学惰性，以避免产生生理效应。此外，由于抗体在血液中存留时间较长，必须等待足够长的时间，以确保单克隆抗体完成循环、靶向结合及清除过程，从而在不损害图像质量的前提下获得理想的信噪比。通常情况下，对于64Cu标记的单克隆抗体，等待20至48小时已足够；但在评估一种新的单克隆抗体PET示踪剂时，应于注射后2、4、6、12、24和48小时进行成像，以确定在特定啮齿类动物模型中成像的最佳时间点。对于获取具有最高信噪比的自显影（ARG）图像，同样需要遵循这一原则。本方案中的代表性图像采集于注射后18至20小时，但具体时间点应根据所使用的放射性同位素进行调整。针对CD19不同表位结合的不同抗体将产生不同的结果，因此应对其进行严格的表征分析。
在分析脊髓信号时，将小鼠仰卧位放置于扫描床中非常重要，以减少呼吸引起的运动。此外，对于因EAE疾病进展而导致脊柱弯曲度增加的小鼠，仰卧位有助于拉直脊柱。在试图检测脊柱和脊髓信号时，另一个需要考虑的重要因素是避免在小鼠侧腹注射MOG1-125，因为注射部位可能由于局部免疫反应而结合示踪剂。注射部位与脊髓位置接近，可能干扰脊髓的分析；因此，本研究所述应用中优先选择胸部注射。
所采用的图像分析技术专用于中枢神经系统（CNS）成像。只要正电子发射断层扫描（PET）与计算机断层扫描（CT）的配准准确，图像分析软件中的脑图谱工具即可提供可重复且可靠的结果。通过使用半自动化的三维脑图谱并调整其以匹配每只小鼠的颅骨形状，可在不同动物之间实现一致的感兴趣区域（ROI）。由于目前尚无自动化或半自动化方法用于分析脊髓中的信号，因此必须手动绘制感兴趣区域。值得注意的是，在定量CD19+ B细胞（或任何同时存在于骨髓和脊髓中的细胞类型）时，必须尽可能消除来自脊柱和骨髓的信号。其原因是，已知正常小鼠骨髓中的CD19+ B细胞数量多于实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）小鼠，因为在EAE模型中，B细胞会离开外周进入中枢神经系统5,11。这种骨髓信号可能掩盖脊髓中的真实信号。
为了在最小化脊柱和骨髓信号干扰的同时明确脊髓的真实信号，可对CT图像进行大津阈值分割，以创建脊柱的固定感兴趣区域（ROI）。随后可在脊柱内部轻松绘制独立的脊髓ROI。该技术也可用于测量股骨中的骨髓。此方法对于研究示踪剂在脊髓中的结合情况具有重要价值。然而，由于PET的空间分辨率相对较低，且在扫描小鼠较小解剖区域时存在部分容积效应等问题，需结合其他方法使用。 离体 验证性技术（如γ计数、放射自显影）能够验证放射性示踪剂在脊髓中的结合，且不受血液、脑脊液或脊柱信号溢出的干扰。
在EAE小鼠中，颈段/胸段脊髓内的信号强弱通常取决于疾病的严重程度以及适应性免疫反应期间浸润的B细胞数量。由于浸润的B细胞数量存在差异，且与正常小鼠骨盆/脊柱骨髓中的B细胞相比，中枢神经系统（CNS）中的B细胞数量较少，因此在小鼠中对脊髓组织进行体内定量具有挑战性。鉴于小动物成像中PET的空间分辨率有限，骨髓的信号可能会溢出至脊髓信号区域。本研究中完成的离体生物分布分析和自显影技术有助于区分并验证椎体与脊髓组织中的PET信号。在解剖前对小鼠进行灌注，以清除血液池中未结合的示踪剂，从而确保γ计数和自显影结果反映的是实际结合于各器官内的示踪剂，而非滞留在该器官血液池中的示踪剂。
放射性示踪剂通过血液在体内循环，特别是使用抗体示踪剂时，初始注射后血液中通常会有未结合的放射性示踪剂持续存在数周。由于我们成像的目标是含有大量血管的脑和脊髓，因此有必要明确信号中有多少真正来源于示踪剂在目标脑组织或组织中的结合，而有多少来自血池中的信号。因此，需要将脑部信号除以心脏/血池信号。在临床环境中，可采用相同的图像分析技术，如对椎骨进行Otsu阈值分割以及对脊髓组织划定感兴趣区域（ROI），以实现定量分析。鉴于人类组织体积较小鼠显著更大，部分容积效应的影响应明显减小，从而提高定量准确性，并避免需要通过ex vivo技术来验证in vivo的结果。在临床中使用正电子发射断层扫描（PET）将使临床医生能够根据每位患者的B细胞负荷情况个性化制定治疗方案。
ARG 特别适用于获取高分辨率图像，从而更准确地界定示踪剂结合在脑干和小脑等小区域中的空间位置。相同的切片和/或相邻切片可保存下来用于免疫组织化学染色，以确认 B 细胞的存在。我们此前曾使用 CD45R/B220 对中枢神经系统组织进行染色（补充图 S1），以将 B 细胞数量与 PET 和 ARG 信号进行关联5,9。随后可将染色结果与 ARG 结果进行空间上的比较，以验证放射性示踪剂信号是否与染色模式一致。B 细胞可在脑干中呈簇状或弥散性分布；PET 的灵敏度足够高，能够检测到该信号，这对临床转化具有积极意义。对于脊髓 ARG 检测，将脊髓从椎骨中取出可确保所测得的信号来源于脊髓组织中的示踪剂结合，而非骨髓和/或血液，后者可能由于部分容积效应而掩盖 PET 图像。
与ARG类似， 离体 γ计数可实现对单个器官中放射性信号的定量。采用该技术时，需测量组织的湿重，并确保组织位于相应离心管底部，再将离心管放入γ计数器中。离心管必须标记小鼠编号和组织类型，以确保使用正确的样品管；随后将管子置于校准过的天平上称重，器官质量需精确至0.0001 mg（即0.1 μg）。某些组织体积极小，加样前后管子质量的差异可能仅为0.0001 mg量级。组织应在解剖后立即称重，以防止水分流失导致质量偏低。称重后，脑和脊髓样品管应加入PBS填充，以防止在冷冻用于放射自显影（ARG）前发生干燥。
披露
CD19 抗体由 Horizon Therapeutics 提供。
致谢
我们感谢斯坦福大学SCi3小动物成像中心提供的支持，以及Frezghi Habte博士在PET/CT技术方面的协助。液相色谱-质谱（LC-MS）由斯坦福大学质谱中心（SUMS）的核心技术人员完成，我们感谢该中心工作人员提供的此项服务。我们感谢Horizon Therapeutics慷慨提供hCD19-mAb，特别感谢Jodi Karnell在技术上的指导与支持。本研究由美国国立卫生研究院神经疾病与中风研究所（NIH NINDS）资助（项目编号：1 R01 NS114220-01A1）。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.5 mL 50 kDa MWCO 离心过滤器 | MiliporeSigma | UFC505008 | 离心过滤器 |
| 64Cu-CuCl3 | 圣路易斯华盛顿大学；威斯康星大学麦迪逊分校；或其他供应商 | ||
| AR-2000 放射性薄层扫描成像仪 | Eckert & Ziegler | AR-2000 | |
| 自显影暗盒 | Cole Palmer | EW-21700-34 | 铝制，8" × 10" |
| 自显影胶片 | GE Life Sciences | 28-9564-78 | 储存式磷屏 BAS-IP SR 2025 E 超高分辨率，20 × 25 cm，仅屏幕 |
| 蝶翼针导管 | SAI Infusion Technologies | BLF-24 | |
| DOTA-NHS-酯 | Macrocyclics | B-280 | |
| EAE 诱导试剂盒 | Hooke Laboratories | EK-2160 | |
| 盖革计数器 | Ludlum | 14C | |
| GNEXT PET/CT 扫描仪 | Sofie | GNEXT | |
| Hidex 自动γ计数器 | Hidex | AMG | |
| HPLC 色谱柱 | Phenomenex | 00H-2146-K0 | 5 μm SEC-s3000 400 Å，300 × 7.8 mm |
| Illustra NAP-5 柱 | Cytiva | 17085301 | DNA 重力柱 |
| Image J | NIH | ARG 分析软件 | |
| 低蛋白吸附收集管（1.5 mL） | Thermo Scientific | PI90410 | |
| NanoDrop Lite 分光光度计 | Thermo Scientific | 840281400 | 紫外-可见微/纳升分光光度计 |
| PCR 管，0.2 mL，DNA 级 | Eppendorf | 30124707 | |
| Typhoon 磷光成像仪 9410 | GE Healthcare | 8149-30-9410 | |
| VivoQuant | Invicro | Version 4 Patch 3 | PET 分析软件；需购买脑图谱附加模块 |
| Zeba 脱盐离心柱，7K MWCO，0.5 mL | Thermo Scientific | PI89882 | 脱盐柱 |
参考文献
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- Karussis, D. The diagnosis of multiple sclerosis and the various related demyelinating syndromes: A critical review. Journal of Autoimmunity. 48-49, 134-142 (2014).
- Hauser, S. L., et al. B-cell depletion with Rituximab in relapsing-remitting multiple sclerosis. The New England Journal of Medicine. 358 (7), 676-688 (2008).
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