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方法文章

从培养的人源间充质干细胞中分离、表征及治疗性应用细胞外囊泡

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DOI：

10.3791/64135

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2022年9月23日

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1College of Life Science, Northwest University, 2State Key Laboratory of Military Stomatology & National Clinical Research Center for Oral Diseases & Shaanxi International Joint Research Center for Oral Diseases, Center for Tissue Engineering, School of Stomatology, Fourth Military Medical University, 3Xi'an Institute of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, 4School of Basic Medicine, Fourth Military Medical University, 5Department of Orthodontics, School of Stomatology, Fourth Military Medical University

本文内容

摘要

本方案描述了通过差速离心法从培养的人源间充质干细胞（MSCs）中分离和表征典型细胞外囊泡（EVs，包括外泌体和微囊泡）的方法。本文还介绍了这些细胞外囊泡的进一步应用。

摘要

细胞外囊泡（EVs）是一类由大多数细胞类型释放的异质性膜性纳米颗粒，其作为机体稳态的生理调节因子以及病理状态的重要指示标志，正受到越来越多的关注；同时，它们在建立可及且可控的疾病治疗手段方面也展现出巨大潜力。间充质干细胞（MSCs）在培养过程中可释放大量EVs，这些囊泡在有效启动组织再生及实现广泛治疗应用方面表现出良好前景，且具有较高的可扩展性和可重复性。目前对简单、高效的MSC-EVs收集与应用方案的需求日益增长。本文提供了一种基于差速离心法的详细实验流程，用于从培养的人源间充质干细胞中分离和表征具有代表性的EVs，包括外泌体（exosomes）和微囊泡（microvesicles），以供后续应用。本方法适用于一系列下游操作，如标记、局部移植和系统性注射。该实验流程的实施将满足转化医学研究中对简单、可靠地获取和使用MSC-EVs的需求。

引言

干细胞是一类具有自我更新能力和多向分化潜能的未分化多能细胞1。间充质干细胞（MSCs）在实验室中易于分离、培养、扩增和纯化，即使经过多次传代后仍能保持干细胞的特性。近年来，越来越多的证据支持MSCs在治疗应用中主要通过旁分泌方式发挥作用2,3。尤其是间充质干细胞分泌的细胞外囊泡（EVs）在介导其生物学功能中起着关键作用。EVs是一类由大多数细胞类型释放的异质性膜性纳米颗粒，包括外泌体（Exos）、微囊泡（MVs）以及更大的凋亡小体等亚类4,5。其中，外泌体是最受广泛研究的一类EV，大小为40–150 nm，起源于内体系统，在生理条件下主动分泌。微囊泡则是通过细胞质膜表面直接出芽脱落形成，直径为100–1,000 nm，其特征是高表达磷脂酰丝氨酸，并携带来源细胞的表面标志物6。EVs含有RNA、蛋白质及其他生物活性分子，具有与母细胞相似的功能，在细胞间通讯、免疫应答以及组织损伤修复中发挥重要作用7。MSC-EVs已被广泛研究，作为再生医学中一种高效的无细胞治疗工具8。

间充质干细胞来源的细胞外囊泡（MSC-derived EVs）的分离与纯化是当前研究与应用领域中的常见难题。目前，差速及密度梯度超速离心法9、超滤法10、免疫磁珠分离法11、分子排阻色谱法12以及微流控芯片技术13被广泛应用于EVs的分离与纯化。由于各种方法均存在优缺点，所获得EVs的产量、纯度和活性难以同时满足要求14,15。本研究详细展示了从培养的间充质干细胞中分离与表征EVs的差速离心方案，该方法已支持实现高效的治疗应用16,17,18,19,20。本方法在一系列下游应用中的适用性，如荧光标记、局部移植和系统性注射，也已得到验证。实施该操作流程将有助于满足转化研究中对MSC-EVs简单、可靠地收集与应用的需求。

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方案

所有动物实验程序均经第四军医大学动物护理与使用委员会批准，并依照美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》进行。实验选用8周龄C57Bl/6小鼠（对雌雄小鼠无偏好）。本研究所用的冷冻保存人脐带来源间充质干细胞（UCMSCs）购自商业来源（见材料表）。人源细胞的使用已获第四军医大学伦理委员会批准。

1. 人源间充质干细胞（hMSCs）的培养

  1. 准备实验所需的器材和溶液，包括移液器、移液器吸头、10 cm 培养皿、恒温设备（水浴锅）、橡胶手套、75% 酒精、培养基（37 °C 预热）、胎牛血清（FBS）和 100 倍青霉素-链霉素（P/S）溶液（参见材料表）。
  2. 通过添加 20% FBS 和 1% P/S 配制市售的 α-最低必需培养基（α-MEM）。
    注意：用于细胞外囊泡（EVs）分离和分析的所有溶液均需使用超纯水净化系统制备的超纯过滤水进行稀释（参见材料表）。
  3. 将冻存的人脐带来源间充质干细胞（UCMSCs）从液氮中取出，并在 37 °C 水浴中融化复苏。
  4. 迅速而轻柔地将融化的细胞悬液转移至含有 5 mL 培养基（步骤 1.2）的 15 mL 离心管中，在 4 °C 条件下以 500 × g 离心 5 分钟。
  5. 用无菌移液器吸除上清液，保留细胞沉淀。向离心管中加入 2 mL 培养基，轻轻重悬细胞。
  6. 将细胞接种至 10 cm 培养皿中，并加入 8 mL 培养基，使总体积达到 10 mL。
  7. 将间充质干细胞置于细胞培养箱中，在 37 °C、5% CO2 条件下进行培养。

2. 差速离心法分离外泌体和微囊泡

  1. 当MSCs生长至>90%融合度时，将培养基更换为添加了20%去外泌体胎牛血清（EV-depleted FBS）和1%青霉素-链霉素（P/S）的α-MEM，每皿8 mL。
    注意：将胎牛血清在4 °C、150,000 × g条件下离心过夜，以去除外泌体及其他杂质。
  2. 培养48小时后，将培养基（步骤2.1）收集至50 mL离心管中。
  3. 在4 °C、800 × g条件下离心MSC培养基10分钟。
  4. 将上清液转移至洁净的1.5 mL离心管中，以去除细胞碎片和细胞残渣。
    注意：使用1.5 mL离心管有助于提高外泌体（EV）的得率。
  5. 在4 °C、16,000 × g条件下离心上清液30分钟。沉淀即为微囊泡（MVs）。将每皿细胞来源的MVs用50 µL PBS重悬。
  6. 用移液器将步骤2.5离心后所得上清液转移至洁净的超速离心管中，在4 °C、150,000 × g条件下离心2小时。
  7. 弃去上清液，收集沉淀物，即外泌体（Exos）。将七皿细胞来源的Exos用50 µL PBS重悬。
    注意：用于外泌体分离的为第六代脐带间充质干细胞（UCMSCs）。为获得足够量的MVs和Exos用于实验，通常需要7–8皿培养细胞。分离所得外泌体样本应立即用于后续表征分析或治疗应用，不建议储存。
    警告：避免对外泌体进行反复冻融，短期储存时最好置于4 °C，而非-80 °C。

3. 间充质干细胞来源的细胞外囊泡（EVs）的颗粒数与粒径分布检测

注意：对于粒径分布评估，采用市售的纳米颗粒跟踪分析仪进行纳米颗粒跟踪分析（NTA）（参见材料表）。

  1. 将1 µL的EVs（来自步骤2.5和步骤2.7）用1,499 µL的PBS稀释，并在15 mL离心管中充分混匀。
  2. 按照制造商的说明操作追踪分析仪。首先，启动配套软件（参见材料表）。
  3. 用蒸馏水填充样品池，然后让仪器开始进行池检测。
  4. 使用已配制的标准溶液校准仪器。确保软件检测界面上显示的颗粒数在50–400之间（最好在200左右）。点击确定。
    注意：通过将1 µL校准液（参见材料表）重悬于1 mL蒸馏水中制备原液，再取100 µL原液加入25 mL蒸馏水中，配制成标准溶液（1:250,000）。该工作试剂可在4 °C保存一周。
  5. 用5 mL蒸馏水冲洗样品池。
  6. 在样品分析前，用1 mL蒸馏水冲洗通道。确保软件检测界面上显示的颗粒数少于10。
  7. 注入步骤3.1中制备的1 mL EV样品。根据仪器操作说明进行囊泡检测。
    警告：样品和蒸馏水需使用1 mL注射器在手动精确控制下以0.5 mL/s的恒定速度注入。

4. 通过透射电子显微镜（TEM）表征EV的形态

  1. 取步骤 2.7 中的 1 µL EVs，加入 199 µL PBS 稀释并充分混匀。取 20 µL EV 悬液滴加至经甲醛/碳膜包被的方格铜网上（见材料表），静置 3 分钟。
  2. 用小片滤纸吸去多余液体，静置 15 秒，使表面略微干燥。
  3. 用 1.5% 磷钨酸液滴对 EV 样品进行负染，染色 40 秒。
  4. 吸去多余的磷钨酸溶液，静置 15 秒，使表面略微干燥。
  5. 将含有甲醛/碳膜包被方格铜网的样品置于铺有滤纸的洁净培养皿中，使用透射电子显微镜观察并采集图像。
    注：本步骤以 Exos 为例进行说明。

5. 间充质干细胞来源的细胞外囊泡标记

  1. 外泌体（EVs）提取后（步骤 2.5），用 250 µL PBS 重悬于 1.5 mL 锥形管中。
  2. 另取一个 1.5 mL 锥形管配制 PKH26 染料的工作液；将 1 µL PKH26 标记试剂用 250 µL 稀释液 C 稀释（稀释液 C 为本研究使用的 commercially available EV 标记试剂盒的组分，参见 材料表）。
    注意：工作液需现用现配。
    警告：PKH26 染料过量或未预先稀释即进行标记，可能导致外泌体损伤。
  3. 将重悬的外泌体与工作液混合，室温孵育 5 分钟，随后加入 500 µL 去除外泌体的胎牛血清（EV-depleted FBS）以终止反应。
  4. 对于微囊泡（MVs），在 4 °C 下以 16,000 × g 离心 30 分钟，用移液器弃去上清液，加入 1 mL PBS 洗涤沉淀。
  5. 在 4 °C 下以 16,000 × g 离心 30 分钟，弃去上清液以去除未结合的染料。
  6. 用 200 µL PBS 重悬沉淀，取 20 µL 悬液滴加至载玻片上，于荧光显微镜下观察。
    注意：本步骤以微囊泡（MVs）为例进行说明。

6. MSC-EVs 的局部移植与系统性注射

注意：进行以下操作时，注射前需将细胞外囊泡置于冰上。

  1. 按照以下步骤进行局部移植。
    1. 使用 4% (vol/vol) 异氟烷对小鼠进行麻醉。 手术过程中以 1%–3% 异氟烷维持麻醉状态。
    2. 手术前，通过腹腔注射给予 5 mg/kg 卡洛芬（IP）以实现镇痛，减轻术后疼痛。
    3. 伤口切除前，剃除背部毛发，并使用 10% 聚维酮碘和 75% 乙醇交替擦拭三轮，对背部表面进行消毒。 
    4. 使用皮肤活检打孔器（见材料表），在背部皮肤上制造一个直径为 1 cm 的全层伤口。
    5. 将来自两皿细胞的间充质干细胞来源的细胞外囊泡（EVs）重悬于 100 µL 磷酸盐缓冲液（PBS）中，并在每个伤口周围的创面皮下层四个位点进行注射。
      注：每只小鼠平均注射 100 µg EVs（来自两个 10 cm 培养皿的细胞）。在小鼠模型中建立 n = 5 的实验，需要十皿 10 cm 的间充质干细胞以获得足够的 EVs。
    6. 处理后，用无菌纱布包裹小鼠，并将其置于保温垫上（见材料表），直至其苏醒。
    7. 确保小鼠在恢复意识足够之前不得无人看管。在小鼠完全恢复之前，不得将其放回与其他动物同笼饲养。
    8. 根据需要，在术后第 2 天和第 3 天追加镇痛剂剂量。 
  2. 进行系统性注射。
    1. 将间充质干细胞来源的 EVs 重悬于 200 µL PBS 中，然后按 10:1 的体积比与肝素溶液混合。
    2. 将小鼠放入尾静脉成像系统（见材料表），按下开关以抬起杠杆。
    3. 静脉注射前，使用酒精棉片对尾静脉进行消毒。随后，通过尾静脉将步骤 6.2.1 中制备的悬液系统性地注射入小鼠体内。可借助尾静脉示意图辅助操作。
      注：EV 悬液与肝素混合后应立即注射。每只小鼠平均注射 100 µg EVs（来自两个 10 cm 培养皿的细胞）。在小鼠模型中建立 n = 5 的实验，需要十皿 10 cm 的间充质干细胞以获得足够的 EVs。
      警告：小鼠尾静脉注射的体积通常限制在 200 µL 以内。注射应缓慢进行，若观察到局部隆起或阻力，应立即停止注射，这提示针头已脱出血管。若小鼠出现 蜷缩、颤抖等不良临床症状，可能是由于大体积注射、快速注射或毒性/过敏反应引起的休克反应。

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结果

根据实验流程（图1），从培养的人脐带间充质干细胞（UCMSCs）中分离出微囊泡（MVs）和外泌体（Exos）。纳米颗粒追踪分析（NTA）结果显示，来源于人源间充质干细胞（MSCs）的外泌体粒径分布在40 nm至335 nm之间，峰值粒径约为100 nm；微囊泡的粒径分布在50 nm至445 nm之间，峰值粒径为150 nm（图2）。间充质干细胞来源的外泌体在形态学表征中呈现典型的杯状结构（图3）。EVs可被PKH26高效标记，通过肉眼观察标记后的沉淀物以及荧光显微镜观察均可确认标记效果（图4）。间充质干细胞来源的EVs可通过局部或系统性注射方式给予，分别注射于皮肤伤口周围或经尾静脉注射（图5）。因此，外泌体和微囊泡已成功分离并可用于后续实验。

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讨论

细胞外囊泡在多种生物活动中正日益发挥重要作用，包括抗原呈递、遗传物质运输、细胞微环境调控等。此外，其广泛应用为疾病的诊断和治疗带来了新的方法与机遇21外泌体（EVs）治疗应用的实施依赖于成功的分离与表征。然而，由于缺乏标准化的分离与纯化方法以及提取效率较低，外泌体研究受到阻碍。本文主要介绍一种从培养的人源间充质干细胞（MSCs）中简便可行的外泌体提取与表征方案，并进一步介绍其可被标记后用于促进组织修复的应用 通过 通过局部注射或静脉注射使用间充质干细胞（MSCs）来源的细胞外囊泡（EVs）治疗系统性疾病。通过采用新生儿来源的脐带间充质干细胞（UCMSCs）、标准化的细胞培养条件以及避免使用晚期传代细胞，可保持用于EV分离的MSCs的可重复性。尽管本研究中分别使用“Exos”和“MVs”指代通过差速离心法在不同离心速度下收集的EVs，但根据《细胞外囊泡研究最低信息标准》（MISEV2018）的建议，未来研究仍需开展更多检测以明确其来源。22 指南，例如通过活细胞成像观察生产过程，以及通过免疫电子显微镜检测特定标记物。总体而言，...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作得到国家自然科学基金（32000974、81930025 和 82170988）以及中国博士后科学基金（2019M663986 和 BX20190380）的资助。感谢空军军医大学基础医学国家级实验教学示范中心（AMFU）和军事医学创新中心分析测试中心实验室提供的协助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10% 聚维酮碘（贝塔碘）Weizhenyuan10053956954292伤口消毒
校准溶液Particle Metrix110-0020NTA 仪器校准
卡洛芬Sigma53716-49-7镇痛药物
Caudal vein imager KEW Life ScienceKW-XXY尾静脉成像仪
离心机Eppendorf5418R离心操作
胎牛血清Corning35-081-CVUCMSCs 培养
Formvar/碳涂层方格载网PBL Assay Science 24916-25透射电子显微镜
加热垫中科生命科学Z8G5JBMz动物术后护理
肝素溶液StemCell7980系统性注射
异氟烷RWD Life ScienceR510-22动物麻醉
最低必需培养基 Alpha 基础型 (1x)GibcoC12571500BTUCMSCs 培养
纳米颗粒追踪分析仪Particle MetrixZetaView PMX120纳米颗粒追踪分析
PBS (1x)迈伦生物MA0015重悬 EVs
青霉素/链霉素普诺赛生命科学PB180120UCMSCs 培养
磷钨酸索莱宝12501-23-4透射电子显微镜
移液器Eppendorf3120000224
PKH26 红色荧光细胞连接试剂盒Sigma-AldrichMINI26EVs 标记
皮肤活检穿孔器Acuderm69038-10-50皮肤缺损
ZetaView 软件Particle MetrixVersion 8.05.14 SP7 
恒温设备Grantv-0001-0005水浴
透射电子显微镜HITACHIHT7800透射电子显微镜
UCMSCsBai'ao UKK220201商用 UCMSCs
超速离心机BeckmanXPN-100离心操作
超纯水过滤净化系统Milli-QIQ 7000超纯水制备

参考文献

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